circTLK1靶向miR-16-5p對MPP+誘導的帕金森病模型細胞損傷的影響

谷偉 馮英慧 楊繼雷

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學科,河北 張家口 075000)

帕金森病(PD)發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的一種,其發(fā)病機制與黑質多巴胺神經(jīng)元退行性病變有關,還與神經(jīng)細胞氧化應激損傷有關,氧化應激可通過誘導神經(jīng)細胞凋亡而使神經(jīng)細胞損傷〔1〕。1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)屬于一種神經(jīng)毒素,其可引起神經(jīng)細胞凋亡及氧化應激,并可用于PD細胞模型的構建〔2〕。環(huán)狀(circ)RNA屬于非編碼RNA分子,其廣泛存在于真核細胞中,且具有高度保守性與組織特異性,并可充當微小RNA(miRNA)的海綿分子或與蛋白質結合從而參與蛋白翻譯過程,進而參與PD等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生及發(fā)展過程〔3,4〕。circTLK1在心肌缺血再灌注損傷中上調表達,下調其表達可通過調節(jié)miR-214/RIPK1表達而抑制心肌細胞凋亡〔5〕。靶基因預測軟件顯示miR-16-5p可能是circTLK1的下游靶點,miR-16-5p可減輕β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導的神經(jīng)細胞損傷〔6〕。但circTLK1/miR-16-5p在PD致病機制中的作用尚未可知。本研究探討circTLK1對MPP+誘導人神經(jīng)母細胞瘤細胞SK-N-SH建立PD模型細胞損傷的影響及其與miR-16-5p的作用關系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人神經(jīng)母細胞瘤細胞SK-N-SH購自上海生命科學研究院細胞中心;MPP+購自上海麥克林生化;丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher;Trizol試劑、circTLK1過表達載體(pcDNA-circTLK1)及其對照載體(pcDNA)、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen;circTLK1小分子干擾RNA(si-circTLK1)及其陰性對照(si-NC)、miR-16-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-16-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、miR-16-5p寡核苷酸模擬物(miR-16-5p mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)購自廣州銳博生物;逆轉錄試劑、實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(PCR)試劑、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自大連Takara;凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶;凝膠電泳試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、增強化學發(fā)光(ECL)劑與RIPA裂解液購自碧云天生物技術公司;兔抗人切割型(cleaved)-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase3)、cleaved-caspase9抗體與二抗購自美國CST。StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI;FACS Calibur流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特。

1.2PD細胞損傷模型建立〔7〕SK-N-SH細胞用DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)培養(yǎng),用含有用100 μmol/L的MPP+處理SK-N-SH細胞24 h,構建PD細胞模型。

1.3細胞轉染及分組 用不含血清的培養(yǎng)基稀釋轉染物,并用不含血清的培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000,二者充分混合,靜置20 min后加入SK-N-SH細胞。實驗分組:Con組:取上述培養(yǎng)的SK-N-SH細胞,不做任何處理;PD組:按照“1.2”處理細胞;PD+si-NC組:用上述轉染方法將si-NC轉染至SK-N-SH細胞,轉染成功后按照PD組操作處理細胞;PD+si-circTLK1組:將si-circTLK1轉染至SK-N-SH細胞,轉染成功后按照PD組操作處理細胞;PD+miR-NC組:將miR-NC轉染至SK-N-SH細胞,轉染成功后按照PD組操作處理細胞;PD+miR-16-5p組:將miR-16-5p mimics轉染至SK-N-SH細胞,轉染成功后按照PD組操作處理細胞;PD+si-circTLK1+anti-miR-NC組:將si-circTLK1與anti-miR-NC共轉染至SK-N-SH細胞,轉染成功后按照PD組操作處理細胞;PD+si-circTLK1+anti-miR-16-5p組:將si-circTLK1與anti-miR-16-5p共轉染至SK-N-SH細胞,轉染成功后按照PD組操作處理細胞。

1.4qRT-PCR測定circTLK1、miR-16-5p表達 使用Trizol分離各組SK-N-SH細胞的總RNA,然后使用SMA 400紫外-可見分光光度計評估其質量和濃度。隨后根據(jù)制造商的說明,使用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA轉錄成cDNA。使用SYBR Green PCR試劑盒在CFX96實時PCR系統(tǒng)上進行qRT-PCR,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為circTLK1的內參,以U6為miR-16-5p的內參。采用2-ΔΔCt法計算circTLK1、miR-16-5p相對表達量。

1.5檢測氧化應激指標MDA與GSH的水平 收集各組SK-N-SH細胞,取100 μl上清液與200 μl MDA或GSH工作試劑混合,最后用酶標儀在532 nm或412 nm處測量吸光度。

1.6流式細胞術評估細胞凋亡 收集不同處理下的SK-N-SH細胞,加入預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,細胞沉淀在500 μl結合緩沖液中重懸。然后用5 μl Annexin膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(V-FITC)與5 μl碘化丙啶(PI)在黑暗中雙染10 min。最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7雙熒光素酶報告基因證實circTLK1和miR-16-5p的靶向關系 StarBase預測circTLK1和miR-16-5p的結合位點,將含有miR-16-5p結合位點野生型(WT)或突變型(MUT)的circTLK1片段擴增并插入pmirGLO熒光素酶載體中,構建熒光素酶報告載體pmirGLO-WT-circTLK1與pmirGLO-MUT-circTLK1。將SK-N-SH細胞與100 ng構建的熒光素酶報告載體和50 nmol/L的miR-16-5p mimics或miR-NC在37 ℃共轉染24 h后收獲SK-N-SH細胞,使用熒光素酶測定試劑盒測定熒光素酶活性。采用脂質體轉染法分別將pcDNA-circTLK1、pcDNA、si-circTLK1、si-NC轉染至SK-N-SH細胞,采用qRT-PCR檢測miR-16-5p表達。

1.8Western印跡測量蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達 使用放射免疫沉淀(RIPA)裂解液分離SK-N-SH細胞總蛋白,采用定量試劑盒檢測其濃度。將30 μg蛋白裝入十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)并分離后轉移至PVDF膜上。室溫下在5%脫脂乳中封閉2 h,與cleaved-caspase3(1∶1 000)、cleaved-caspase9(1∶1 000)與GAPDH抗體(1∶3 000)一抗在4 ℃下孵育過夜,然后用相應的二抗(1∶5 000)在室溫下放置1 h。最后,用ECL試劑盒對條帶進行可視化。采用GAPDH作為內參。用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件,兩組間比較進行獨立樣本t檢驗,多組間比較進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1PD細胞中circTLK1和miR-16-5p的表達 與Con組比較,PD組circTLK1表達顯著增高,miR-16-5p表達顯著下降(P<0.05),見表1。

表1 各組circTLK1和miR-16-5p在PD細胞中的表達

2.2干擾circTLK1表達對PD細胞氧化應激的影響 與Con組比較,PD組MDA水平增加,GSH水平下降;與PD+si-NC組比較,PD+si-circTLK1組MDA水平下降,GSH水平增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見表2。

表2 各組干擾circTLK1表達對PD細胞氧化應激、細胞凋亡的影響

2.3干擾circTLK1表達對PD細胞凋亡的影響 與Con組比較,PD組凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平增加;與PD+si-NC組比較,PD+si-circTLK1組凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見表2、圖1。

圖1 各組干擾circTLK1表達對PD細胞凋亡的影響

2.4circTLK1靶向并負調控miR-16-5p StarBase軟件預測結果顯示circTLK1與miR-16-5p存在結合位點,見圖2。與miR-NC組比較,miR-16-5p組WT-circTLK1細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),MUT-circTLK1細胞的熒光素酶活性無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。與PcDNA組(1.00±0.00)比較,PCDNA-circTLK1組miR-16-5p(0.48±0.04)顯著降低;與si-NC組(0.98±0.06)比較,si-circTLK1組miR-16-5p(3.12±0.25)顯著升高(F=134.021,P<0.05)。

圖2 StarBase分析顯示circTLK1中miR-16-5p的假定識別序列

表3 各組雙熒光素酶報告實驗

2.5miR-16-5p過表達對PD細胞氧化應激和細胞凋亡的影響 與PD+miR-NC組比較,PD+miR-16-5p組MDA水平下降,GSH水平增加,凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平下降,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見圖3、表4、圖4。

1～4:PD+miR-NC組、PD+miR-16-5p組、PD+si-circTLK1+anti-miR-NC組、PD+si-circTLK1+anti-miR-16-5p組;圖4同

圖4 各組PD細胞凋亡

表4 miR-16-5p過表達對PD細胞氧化應激和細胞凋亡的影響

2.6下調miR-16-5p表達逆轉了干擾circTLK1表達對PD細胞凋亡和氧化應激的作用 與PD+si-circTLK1+anti-miR-NC組比較,PD+si-circTLK1+anti-miR-16-5p組MDA水平增加,GSH水平下降,凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平增加,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見圖3、圖4、表5。

表5 各組下調miR-16-5p表達逆轉干擾circTLK1表達對PD細胞氧化應激和細胞凋亡的作用

3 討 論

非編碼RNA在神經(jīng)退行性疾病的進展中發(fā)揮重要的調控作用,其可能為PD藥物治療的潛在靶點〔8,9〕。circRNA是由一種反向剪接方式形成的一種環(huán)狀結構,是由上游的剪接受體與下游的剪接供體以共價鍵結合而形成的閉合環(huán)狀結構,circRNA可競爭性結合miRNA而發(fā)揮自身功能作用,并可通過調節(jié)神經(jīng)細胞增殖、凋亡等過程而參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生及發(fā)展過程〔10〕。有研究表明circDLGAP4通過調節(jié)miR-134-5p/CREB的表達而減輕神經(jīng)細胞損傷從而抑制PD發(fā)生發(fā)展〔11〕。但circRNA對PD模型細胞損傷的影響及其可能作用機制尚未完全闡明。

circTLK1在腦缺血在灌注損傷中高表達,敲低其表達可通過調節(jié)miR-335-3p/TIPARP表達而減輕腦缺血在灌注損傷〔12〕。circTLK1在腎細胞癌等腫瘤中表達上調,并可促進細胞增殖及轉移〔13〕。但circTLK1在PD模型細胞損傷中的作用仍不清楚。本研究與既往研究相似〔14〕,提示PD細胞損傷模型成功建立。本研究提示干擾circTLK1表達可通過增強抗氧化能力抑制MPP+誘導的神經(jīng)細胞氧化應激反應。本研究結果與既往研究報道結果相似〔15〕,提示干擾circTLK1表達可減輕MPP+誘導的神經(jīng)細胞凋亡進而改善PD模型細胞損傷。

miRNA屬于非編碼小RNA分子,可調控細胞凋亡、自噬等生物學過程從而在PD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調控作用,circRNA或LncRNA可充當miRNA的競爭性內源RNA分子而發(fā)揮作用,研究表明miR-16-5p在脂多糖誘導的肺上皮細胞損傷中下調表達,上調其表達可減輕肺上皮細胞損傷〔16〕。上調miR-16-5p表達可促進骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖并阻滯細胞凋亡〔17〕。miR-16-5p可通過調控人牙齦上皮細胞增殖及凋亡而參與牙周炎進展〔18〕。本研究提示miR-16-5p過表達可減輕PD模型細胞損傷,可能是通過增強MPP+誘導的神經(jīng)細胞抗氧化能力而抑制細胞凋亡實現(xiàn)的。本研究推測circTLK1可能通過充當miR-16-5p的海綿分子而促進MPP+誘導的神經(jīng)細胞損傷。本研究提示下調miR-16-5p表達可逆轉干擾circTLK1表達對MPP+誘導的神經(jīng)細胞凋亡及氧化應激的作用。