凍融循環對海灣扇貝內收肌肌原纖維蛋白理化特性及凝膠特性的影響

洪思琦，任超，杜明，吳超，祁立波

（大連工業大學 食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116000）

海灣扇貝（Argopecten irradias）于1982 年被引進我國。從1984 年開始，海灣扇貝養殖業快速發展，規模巨大[1]。海灣扇貝，屬瓣鰓綱，異內收肌目，扇貝科，扇貝屬[2]。海灣扇貝內收肌是一種高蛋白、低脂肪的健康食品，因其味道和營養價值備受推崇。海灣扇貝內收肌的品質變化與其蛋白質的變性程度具有很強的相關性，其中肌原纖維蛋白的變性存在最顯著的影響。肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白和肌動蛋白，是肌肉收縮最關鍵的蛋白質[3]。肌肉蛋白質的功能特性與蛋白質的結構完整性密切相關。影響肌肉蛋白質特定結構和功能的因素包括動物種類、肌肉新鮮度以及肌肉是否被冷凍或凍藏[4]。為了應對長途運輸和延長水產品的保質期，冷凍是目前較好的方法之一，即使有不可避免的質量損失。然而在運輸過程中不可避免的會發生凍融現象，特別是水產品在經過凍融后會導致汁液損失增加、質構劣變及風味降低。

凍藏過程中由于冰結晶的形成會使蛋白質發生變性，造成蛋白質溶解性降低，從而影響肌原纖維蛋白的功能特性。 以肌動球蛋白三磷酸腺苷酶為指標進行的研究表明，凍融會破壞斑節對蝦肌原纖維蛋白的穩定性[5]。通過研究牛肌肉肌原纖維蛋白的變性效應，發現解凍導致肌肉組織的失水率升高，熱穩定性降低[6]。反復凍融會導致蝦的蛋白質變性、組織破壞和肌肉纖維損傷；隨著凍融循環次數的增加，蝦的硫代巴比妥酸增加，鹽溶蛋白質含量減少，肌肉纖維間距增加，肌肉纖維被撕裂[7]。綜上所述，反復凍融會引起肌原纖維蛋白變性從而引起肌肉產品的質量下降。

本試驗以海灣扇貝內收肌為原料，模擬凍融循環、通過測定解凍后的理化指標（保水性、質構特性、肌原纖維蛋白含量、總巰基和活性巰基含量、表面疏水性），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）、內源熒光光譜、圓二色譜探索凍融循環次數對海灣扇貝內收肌品質及蛋白質特性的影響。同時以凍融扇貝內收肌為原料，通過斬拌、加熱定型成扇貝凝膠，通過測定持水性、質構特性、凝膠強度、流變特性、低場核磁共振、冷場掃描電鏡等探討凍融循環次數對貝糜凝膠的持水性、水分分布、品質特性和微觀結構的影響，以期為貝糜制品凝膠特性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮海灣扇貝內收肌：市售。

氯化鈉：天津市石英鐘廠霸州市化工分廠；β-巰基乙醇、8-奈基磺酸鹽-1-苯胺基：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸、丙烯酰胺、溴酚藍、尿素：上海生工生物工程股份有限公司；腺嘌呤核苷三磷酸、甘氨酸：北京索萊寶科技有限公司；蛋白電泳marker：美國伯樂公司；三羥甲基氨基甲烷、5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）：上海麥克林生化科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CF16R XⅡ高速冷凍離心機、S8020 場發射掃描電子顯微鏡、F-2700 熒光分光光度計：日本日立公司；Discovery HR-1 流變儀：美國TA 公司；SD-JR6800 絞肉機：佛山市順德區三的電器制造有限公司；TA.XT.plus 質構儀：北京微訊超技儀器技術有限公司；MesoQ MR23-060H 核磁共振成像分析儀：上海紐邁電子科技有限公司；UV-2100B 紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；BIO-RAD-ChemiDoc Touch 化學發光成像分析系統、J-1500 圓二色光譜儀：日本分光株式會社。

1.3 方法

1.3.1 海灣扇貝內收肌樣品處理及凍融循環設計

將新鮮海灣扇貝內收肌分別放于10 cm×7 cm 的封口袋中，密封。將封裝好的扇貝內收肌肉置于超低溫冰箱中，采用平板接觸凍結，凍結至中心溫度-40 ℃。然后將樣品置于（-18±2）℃下冷凍保存。每隔48 h 取出冷凍的扇貝內收肌，在25 ℃恒溫培養箱解凍40 min，待扇貝內收肌中心溫度達到0～1 ℃，即為1 個凍融循環。隨后依次完成2、4 次冷凍-解凍后備用。

1.3.2 海灣扇貝凝膠的制備

將新鮮和經過1、2、4 次凍融后的扇貝內收肌肉切碎后加入質量比1.5%的食鹽斬拌10 min 成貝糜，使鹽溶性蛋白充分溶出，將斬拌后的貝糜填裝入25 mm×30 mm 的聚碳酸酯管中，保鮮膜包裹，采用水浴一段式直接加熱的方式（90 ℃，10 min），加熱后立即冷卻，充分冷卻后放入4 ℃冰箱冷藏過夜，用于進一步檢測。

1.3.3 海灣扇貝肌原纖維蛋白制備

參照Nishio 等[8]的方法并稍作修改，挑選大小和形狀接近一致的扇貝內收肌。將3 個扇貝內收肌用絞肉機絞碎后取貝肉5 g，然后加入30 倍體積冷卻的5 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液[含40 mmol/L NaCl，1 mmol/L巰基乙醇和0.1 mmol/L 乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸]，在勻漿機中10 000 r/min 勻漿1 min，勻漿液在10 000 r/min 條件下離心5 min，沉淀用相同的溶液再溶解，沖洗離心2 次，沖洗后的沉淀與20 倍體積的冷卻的5 mmol/L 的磷酸緩沖液[含0.6 mol/L 氯化鈉和5 mmol/L 腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）]混合形成蛋白懸濁液，通過加入0.5 mol/L 磷酸氫二鈉使其維持在pH7.0，在4 ℃條件下攪拌75 min 后，將懸濁液在10 000 r/min 條件下離心20 min，取上清液為肌原纖維蛋白，通過雙縮脲法測定肌原纖維蛋白含量。1.3.4 貝糜凝膠品質測定

1.3.4.1 貝糜凝膠持水性測定

將待測樣品切成約2 mm 厚的薄片。稱取質量為W1（2.0～3.0 g）的樣品平攤在3 張濾紙上包裹好放入離心管中，在8 000 r/min、4 ℃溫度下離心10 min，離心結束后取出稱量為W2（g），每組樣品重復測量4 次取平均值，按下列公式計算持水率（C，%）。

1.3.4.2 貝糜凝膠質構特性測定

采用質構儀測定海灣扇貝肉質構特性，注意下壓方向應與肌肉纖維的走向垂直。參數設定為測試探頭P/50、壓縮形變50%、測試前速度1.0 mm/s、測試速度和測試后速度均為2.0 mm/s。硬度指標一般用下壓過程中的最大感應力表征。每個樣品做8 次平行。

1.3.4.3 貝糜凝膠水分分布測定

用核磁共振分析成像分析儀測定橫向弛豫時間（T2），其磁場強度為0.5 T，對應的質子共振頻率為21 MHz。將扇貝凝膠放入直徑60 mm 的核磁管中，插入核磁共振探針。脈沖序列（carr-purcell-meiom-gill，CPMG），90°和180°脈沖分別為21.00、42.00 μs，π 值為100 μs，回聲數為4 500，重復掃描3 次。

1.3.4.4 流變特性測定

使用流變儀測定未經凍融以及凍融后的扇貝凝膠，每個樣品做3 次平行。參數設定為固定溫度25 ℃、間隙1 mm、應變0.5%、頻率0.1～10 Hz，測試樣品得到樣品的儲存模量G′隨著溫度的變化曲線。

1.3.4.5 凝膠強度測定

將熱凝膠扇貝切為高度25 mm 左右的圓內收肌體，采用質構儀測定海灣扇貝肉凝膠特性，每個樣品至少8 個平行。參數設定為測試探頭P/5S、測試速度1.0 mm/s、測前速度和測后速度10.0 mm/s、壓縮形變50%。記錄破裂力（Y，g）和破裂距離（Z，mm），凝膠強度（X，g·mm）計算公式如下。

1.3.4.6 微觀結構

用低溫掃描電子顯微鏡觀察貝糜凝膠樣品的微觀結構。將待測樣品切成3 mm 厚，使用掃描電子顯微鏡放大1 000 倍掃描微觀結構。

1.3.5 肌原纖維蛋白理化特性的測定

1.3.5.1 肌原纖維蛋白含量的測定

將肌原纖維蛋白上清液用0.6 mol/L NaCl 稀釋25 倍。移取1 mL 上清液，雙縮脲法測定肌原纖維蛋白含量，每個樣品重復3 次。

1.3.5.2 肌原纖維蛋白電泳分析

SDS-PAGE 方法參考Kim 等[9]的方法并稍作修改。將肌原纖維蛋白上清液用0.6 mol/L NaCl 稀釋到2 mg/mL，并向其中添加質量分數1%溴酚藍（bromophenol blue，BPB）指示劑，然后進行非還原電泳；加β-巰基乙醇沸水浴5 min，進行還原電泳。分離凝膠和堆積凝膠分別包含12.5%和3%的丙烯酰胺，8 μL 樣品加入到凝膠中，以恒定12 mA 的電流進行電泳。使用的蛋白電泳marker 的分子量為10～250 kDa。電泳結束后，凝膠用考馬斯亮藍G-250 染色，并用蒸餾水脫色。使用Bio-Rad 圖像分析系統檢測蛋白質條帶。

1.3.5.3 總巰基和活性巰基的測定

肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L NaCl 溶液稀釋到2 mg/mL，取1 mL 加入8 mL 三羥甲基氨基甲烷（trimethylolaminomethane，Tris）-甘氨酸（含8 mol/L 尿素，4 mol/L 乙二胺四乙酸，pH8.0）。取4.5 mL 混合溶液，加入0.5 mL、10 mmol/L 5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）] 溶液，室溫反應30 min。以0.6 mol/L NaCl 溶液作為空白樣品，測定412 nm 處吸光度。測量活性巰基含量時去掉反應混合液中尿素，其余步驟均同前。每個樣品均做3 次平行。按下列公式計算總巰基和活性巰基的含量。

式中：Q 為巰基含量，10-5mol/mg；A 為待測樣品吸光度減去空白樣品吸光度；N 為稀釋因子；C 為蛋白濃度，mg/mL。

1.3.5.4 表面疏水性的測定

采用1-苯胺基-8-奈基磺酸鹽（1-anilino-8-napthalene sulfonic acid，ANS）作為熒光探針。將肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L NaCl 稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 系列蛋白濃度的溶液。溫度平衡后，取4 mL稀釋的蛋白溶液加入50 μL 8 mmol/L 的ANS 溶液，振蕩混勻后在暗處放置15 min 后進行測試；每個樣品做3 次平行。參數設置：激發波長和發射波長分別為300、500 nm，采用5 nm 作為熒光激發和發射的狹縫寬度。以熒光強度為縱坐標、蛋白質濃度為橫坐標，該曲線初始階段的斜率作為肌原纖維蛋白的表面疏水性指數。

1.3.5.5 內源熒光測定

將肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L NaCl 稀釋到1 mg/mL，用熒光分光光度計檢測熒光光譜。參數設置：激發波長290 nm，激發和發射狹縫寬度均為5 nm，波長掃描范圍300～500 nm。每個樣品做3 次平行。

1.3.5.6 圓二色譜的測定

肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L NaCl 溶液稀釋到0.2 mg/mL，以0.6 mol/L NaCl 溶液作為空白進行掃描。參數設定：掃描波長范圍190～250 nm，掃描速率為50 nm/min，譜帶寬度為1.0 nm，試驗值為3 次掃描的平均值。

1.4 數據處理

每組試驗均重復進行3 次，采用Origin 8.0、SPSS 22.0 對各試驗數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 肌原纖維蛋白理化特性在凍融過程中的變化

2.1.1 凍融循環次數對肌原纖維蛋白含量和蛋白質組成的影響

凍融循環次數對肌原纖維蛋白含量和蛋白質組成的影響如圖1 所示。

圖1 凍融循環次數對肌原纖維蛋白含量和蛋白質組成的影響Fig.1 Effect of freeze-thaw cycles on myofibrillar protein content and protein composition

圖1A 可知，經過凍融循環試驗，隨著凍融循環次數增加，扇貝內收肌中肌原纖維蛋白含量顯著減少（P<0.05）。新鮮扇貝內收肌肌原纖維蛋白含量為64.50 mg/g，在經過4 次凍融循環后，其肌原纖維蛋白含量為29.60 mg/g，下降了54.1%（P<0.05）。引起肌原纖維蛋白含量下降的原因可能是反復凍融使蛋白質的部分結合水形成冰晶析出，導致肌球蛋白分子之間形成非共價鍵，進而形成不溶性高分子凝聚體而使肌動球蛋白溶出量下降。此外，巰基氧化形成的二硫鍵會導致蛋白質聚集，從而降低其溶解性。Sriket 等[10]發現凍融5 次后黑蝦、白蝦的蛋白溶解度顯著降低（P<0.05），蝦肉蛋白質的溶解度會隨著反復凍融次數的增加而降低。

由圖1B 可知，通過SDS-PAGE 測定凍融后的肌原纖維蛋白，結果表明在還原和非還原條件下，肌球蛋白重鏈（245 kDa）、肌動蛋白（43 kDa）、原肌球蛋白（36 kDa）等肌原纖維蛋白重要組成部分的電泳條帶之間并未觀察到明顯差異。而在所有未還原樣品中的堆積凝膠上發現了高分子量聚合物。這是因為，在凍融過程中巰基基團間相互作用生成二硫鍵有利于維持蛋白質結構的穩定性，在添加還原劑β-巰基乙醇后，可將二硫鍵拆分為自由巰基[11]。因此未被還原樣品中的堆積凝膠上發現高分子量聚合物，而還原樣品中未發現。

2.1.2 凍融循環次數對巰基含量和表面疏水性的影響

凍融循環次數對巰基含量和表面疏水性的影響如圖2 所示。

圖2 凍融循環對巰基含量和表面疏水性的影響Fig.2 Effect of freeze-thaw cycles on sulfhydryl content and surface hydrophobicity

由圖2A 和2B 可知，巰基是肌肉蛋白質中最敏感的官能團，巰基容易被氧化成共價二硫鍵（—S—S—），導致蛋白質的交聯[12]。因此，巰基含量的變化可以反映肌原纖維蛋白的構象變化。隨著凍融循環次數增加，肌原纖維蛋白樣品的總巰基和活性巰基含量均明顯降低；在經過4 次凍融處理后，樣品的總巰基含量和活性巰基含量分別降低到初始值的62.7%和58.3%。總巰基和活性巰基含量減少的原因主要是多肽內部或多肽之間形成二硫鍵，或者巰基氧化為二硫化物和其他氧化物[13]。而活性巰基的還原可以歸因于巰基的交聯反應，或者暴露的巰基與氧自由基發生反應。在凍藏過程中，鰱魚肌球蛋白中總巰基含量也出現降低的結果[14]。冷藏過程中由于半胱氨酸上的硫醇基團氧化形成二硫鍵，導致花鱸魚的肌原纖維蛋白巰基含量也出現下降的趨勢[15]。

蛋白質的表面疏水性反映的是蛋白質分子表面疏水性殘基的相對含量，其變化說明蛋白質的表面性質發生改變，故可作為蛋白質結構改變的表征指標[16]。由圖2C 可知，經過凍融循環試驗，隨著凍融循環次數的增加，表面疏水性出現顯著增大的趨勢（P＜0.05）。經過4 次凍融循環后，扇貝肌原纖維蛋白的疏水性相對新鮮樣品增加了48.7%。蛋白質的疏水性基團具有較低的表面疏水性，其位于蛋白質分子內部。扇貝內收肌經過凍融處理后會導致肌原纖維蛋白質構象的顯著變化，進一步引起疏水氨基酸殘基的暴露，這些疏水基團通過疏水相互作用聚集在一起。故隨著凍融循環次數的增加，肌原纖維蛋白表面疏水性的含量不斷增加。其他肌肉蛋白經凍融后也出現相同的結果。鱈魚肌肉蛋白在經過3 次凍融循環后表面疏水性增加[17]。在-20 ℃下冷凍儲存6～8 周期間，螃蟹肌肉蛋白的疏水性增加，可能與肌球蛋白頭部區域的變性有關[18]。蛋白質變性主要是通過疏水相互作用導致暴露的殘基聚集，從而最終降低表面疏水性。冰晶引起肌原纖維蛋白空間結構的變化，使得巰基基團、疏水基團暴露。這一結果與總巰基和活性巰基含量的下降是一致的。

2.1.3 凍融循環次數對肌原纖維蛋白質二級和三級結構的影響

凍融循環次數對肌原纖維蛋白二、三級結構的影響如圖3 所示。

圖3 凍融循環次數對肌原纖維蛋白二、三級結構的影響Fig.3 Effect of freeze-thaw cycles on secondary and tertiary structures of myofibrillar protein

蛋白質的三級結構主要由色氨酸（Trp）的熒光光譜信息來表達，色氨酸殘基位于肌原纖維蛋白的核心，具有較高的熒光強度，經冷凍等處理后，熒光強度會發生變化[19]。由圖3A 可知，與對照組相比，凍融樣品的色氨酸熒光強度明顯降低，隨著凍融循環次數增加，熒光強度逐漸減弱。凍融循環的處理導致蛋白質三級結構展開，埋藏在蛋白質核心的色氨酸殘基暴露在溶劑（親水環境）中而產生猝滅作用，從而降低熒光強度。此外，肌原纖維蛋白的熒光強度下降也可能是由于肌原纖維蛋白的聚集和疏水相互作用的增加所引起的空間位阻的增加。鏡鯉魚也出現同樣的結果，凍融處理也會導致鏡鯉魚蛋白凝膠的熒光強度降低，蛋白質三級結構被破壞[20]。

肌原纖維蛋白二級結構的穩定性可以用圓二色譜（circular dichroism，CD）遠紫外光譜來描述，它包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲[21]。由圖3B 可知，未經凍融樣品的遠紫外光譜波長在210 nm 和220 nm左右有典型的負峰，代表了經典的α-螺旋結構，隨著凍融次數增加，負峰出現明顯的衰減，峰值強度的降低意味著其結構含量的減少。由圖3C 可知，隨著凍融次數的增加，肌原纖維蛋白的α-螺旋和β-折疊百分比逐漸減少，β-轉角、無規則卷曲百分比逐漸增加。凍融循環可引起豬最長肌肌原纖維蛋白的蛋白質聚集和降解、α-螺旋結構破壞[22]。α-螺旋結構的含量主要與多肽鏈上的羰基氧（—CO）和氨基氫（—NH—）之間的氫鍵穩定性有關。在凍融過程中，可能由于水與蛋白質結合狀態的變化，導致氫鍵的破壞和氨基酸間靜電相互作用的減弱，使得穩定性減弱[16]。蛋白質的不可逆變性將會導致α-螺旋構象含量的減少或是導致β-折疊和無規卷曲含量的增加。

2.2 在凍融循環過程中扇貝內收肌凝膠品質的變化

2.2.1 凍融循環次數對貝糜凝膠持水性和水分分布的影響

凍融循環次數對貝糜凝膠持水性和水分分布的影響如圖4 所示。

圖4 凍融循環次數對貝糜凝膠持水性和水分分布的影響Fig.4 Effect of freeze-thaw cycles on water-holding capacity and water distribution of shellfish gel

持水率是蛋白質凝膠通過蛋白質-水相互作用在凝膠網絡中保持水分的一種重要能力。由圖4A 可知，隨著凍融循環次數增加，貝糜凝膠持水率降低；未經凍融的扇貝糜凝膠的持水率為88.6%，經4 次凍融循環后下降至83.2%。泰國魚糜凝膠在冷凍儲存4 個月后持水能力急劇下降[23]。持水力下降的原因可能是在凍融過程中，凍結生成的冰晶造成蛋白的結構損傷與變性，加熱形成的凝膠網絡結構被破壞，失去了限制水的流動能力，而滯留在凝膠中的水缺乏流動性，不易擠出[24]。

用低頻核磁共振技術檢測扇貝凝膠中水分分布的變化。每個樣品的兩個峰表示了不同凝膠體系中的質子弛豫時間曲線[25]。如圖4B 所示，與蛋白質大分子緊密結合的水被定義為T21（結合水），被困在凝膠結構中的水被定義為T22（固定水）。與對照組相比，在1、2、4 次凍融循環下，T22對應的峰面積減少。弛豫時間T22對應的峰面積代表了位于凝膠網絡結構中的主要固定水的含量。結果表明，隨著凍融循環次數的增加，凝膠中結合水含量減少，新鮮樣品較緊密的凝膠結構比凍融循環樣品具有更多的水分。水分轉移和損失的原因可能是在冷凍和解凍過程中，冰晶重新分布造成蛋白質機械損傷和變性[26]。總的來說，由于肌原纖維蛋白在凍融循環過程中發生變性，使扇貝凝膠結構變得疏松，而凝膠結構的變化導致其持水能力下降。

2.2.2 凍融循環次數對貝糜凝膠品質特性的影響

凍融循環次數對貝糜凝膠品質特性的影響如圖5所示。

圖5 凍融循環次數對貝糜凝膠品質特性的影響Fig.5 Effect of freeze-thaw cycles on quality characteristics of shellfish gel

由圖5A 可知，所有的質構參數（硬度、咀嚼度和膠著度）隨著凍融循環次數的增加而下降（P＜0.05），凝膠硬度從4 424 g（新鮮）降至2 630 g（4 個凍融循環），降幅為41%。凝膠硬度是蛋白質凝膠最重要的功能特性之一。當扇貝內收肌樣品反復冷凍和解凍時，所形成凝膠的咀嚼度和膠著度也表現出劣化（P＜0.05），變化趨勢與硬度相似；經過4 次凍融處理后，凝膠咀嚼度降低53.4%，膠著度降低。扇貝凝膠的咀嚼度和膠著度較差，說明扇貝凝膠更脆或更不富有彈性。在凍融的過程中扇貝內收肌的肌原纖維蛋白結構發生改變，從而在加熱時形成的凝膠網絡結構較弱，隨著凍融次數的增加，表現出貝糜凝膠的質構特性發生劣變。質構特性的變化結果與動態流變學測量結果一致，動態流變學測量中，儲能模量（G′）隨著凍融循環次數的增加而逐漸下降（圖5B）。

流變特性反映了貝糜凝膠質量。特別是，儲能模量G′是對剪切過程中儲存在樣品中的變形能的測量，它代表了樣品的彈性行為。由圖5B 可知，在0.1～100 Hz恒定掃描頻率的條件下，未經凍融樣品的儲能模量達到最大值，經過1 次、2 次和4 次凍融后，貝糜凝膠的G′急劇下降，說明凍融導致貝糜凝膠的彈性降低。可能是因為凍融循環導致蛋白質結構變化、蛋白質變性或者蛋白質過度聚集和不溶解[4]。

由圖5C 可知，貝糜凝膠隨著凍融循環次數增加，扇貝凝膠強度顯著下降（P＜0.05），對照組的凝膠強度為1 776.9（g·mm），經過4 次凍融循環后，凝膠強度為1 176.7（g·mm），下降了33.8%，數據表明扇貝凝膠強度的降低與凍融循環次數的增加呈正相關。凍融循環導致凝膠強度降低的原因之一是凝膠網絡結構的斷裂。在冷凍和解凍過程中，由于冰晶生長或重結晶可能導致肉類蛋白被氧化，破壞了蛋白質的結構，降低了蛋白質的凝膠形成能力[27]。蛋白質在凍藏過程中的變性會直接影響真鯛魚魚糜的成膠能力和凝膠強度[28]。說明凍融導致貝糜凝膠的凝膠強度降低的主要原因是蛋白質在凍融過程中的冷凍變性。

2.2.3 凍融循環次數對貝糜凝膠微觀結構的影響

凍融循環次數對貝糜凝膠微觀結構的影響如圖6所示。

圖6 凍融循環次數對貝糜凝膠微觀結構的影響Fig.6 Effect of freeze-thaw cycles on microstructure of shellfish gel

由圖6 可知，貝糜凝膠微觀結構的顯微照片顯示了凍融處理的顯著效果：新鮮的扇貝凝膠呈現出致密、均勻的精細網絡結構；與未凍融相比，凍融1 次凝膠網狀結構疏松、不均勻，蛋白質束發生斷裂；凍融2次和凍融4 次凝膠網狀結構更疏松、均勻度差，凝膠三維網狀結構破壞嚴重，反復凍融后凝膠微觀結構發生了明顯的變化。豬肉冷凍后超微結構也發生了變化，冷凍掃描電子顯微鏡下發現冷凍肉類樣品的空洞面積大約是新鮮樣品的10 倍，很難在松散的肌肉組織中保留游離水分[29]。

優質蛋白質會形成具有較高彈性和質構良好的凝膠。蛋白質形成凝膠是由于蛋白質分子間通過共價鍵或非共價鍵（包括二硫鍵、疏水鍵）發生適度變性，但凍融過程破壞了蛋白質分子的結構，使蛋白質的凝膠形成能力下降[30]。凍融過程產生了空隙，并將聚集體凝膠結構變為粗鏈網絡；反復凍融處理的扇貝內收肌導致凝膠網絡結構的崩潰，顯示出大的、不規則的裂縫。這些結構特征出現的原因可能是凍融處理的扇貝所制備的凝膠具有如上所述的水分分布和質構特性。

3 結論

本研究解析了凍融循環對扇貝內收肌肌原纖維蛋白理化特性、結構特性以及凝膠特性的影響。研究結果表明，隨著凍融循環次數增加，扇貝內收肌肌原纖維蛋白含量、總巰基、活性巰基含量降低；肌原纖維蛋白分子的二、三級結構發生變化，其中α-螺旋結構逐漸解旋，部分轉化為β-折疊和無規卷曲結構，色氨酸、酪氨酸等疏水性殘基逐漸暴露于蛋白質表面形成疏水區域，提高了肌原纖維蛋白分子間和分子內的疏水相互作用。這些理化特性的改變，導致了扇貝內收肌凝膠性降低。本研究為海灣扇貝的進一步研究提供理論依據。