混菌發酵對西拉葡萄酒香氣品質的影響

邢家愛，于慶泉，李福東，鎖然，黨超，王頡*，劉亞瓊*

（1.河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000；2.中糧長城桑干酒莊（懷來）有限公司，河北 張家口 075400）

西拉（Syrah）葡萄原產于法國羅訥河谷，是世界第四大紅色釀酒品種，我國第五大紅色釀酒品種。近幾年西拉葡萄在我國的種植面積穩步增加，據統計，2016 年我國西拉葡萄種植面積約1 000 hm2，占世界該品種栽培面積的0.6%。西拉所釀葡萄酒因具有濃郁的漿果香、烤肉味以及黑胡椒香氣特征而深受消費者喜愛[1]。但國內關于西拉葡萄酒的風味研究相對較少，主要涉及栽培技術對果實品質的影響以及陳釀條件對西拉葡萄酒品質的影響[1-3]，酵母菌種對其風味品質的影響尚不明確。

葡萄酒的酒精發酵是涉及多種微生物復雜生化反應的過程，作為主導微生物的酵母菌的種類以及菌種間的相互作用均會影響代謝物的種類和含量[4-5]。目前，葡萄酒生產企業廣泛使用商業釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進行酒精發酵以便最大程度地保證發酵的順利完成，并獲得穩定的產品質量，但這在一定程度上削弱了葡萄酒的產區獨特性[6-7]。研究發現，本土微生物菌群更適應當地的氣候、土壤和微生態條件，應用本土酵母菌進行發酵有利于增強葡萄酒風味多樣性和產區典型性[8-9]。葡萄生長環境中存在著多種非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae），其分泌的糖苷酶可促進葡萄汁中的糖苷前體物質水解生成揮發性香氣化合物，但難以單獨完成酒精發酵，通常與釀酒酵母進行混合發酵以改善葡萄酒的風味品質[10-12]。研究表明，戴爾有孢圓酵母參與發酵能提高苯乙醇、辛酸乙酯和癸酸乙酯等的含量，增強馬瑟蘭葡萄酒的花果香味[13]。美極梅奇酵母與S.cerevisiae 混合發酵提高了澳大利亞西拉葡萄酒中乙酸苯乙酯、庚酸乙酯和芳樟醇等的含量，賦予葡萄酒愉悅的風味[14]。Mestre等[15]報道稱，順序接種有孢漢遜酵母和S.cerevisiae 的馬爾貝克葡萄酒中乙酸異戊酯、己酸乙酯和γ-丁內酯的含量高于釀酒酵母單菌發酵的葡萄酒，對葡萄酒的感官特性有積極影響。然而，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵對國產西拉葡萄酒風味品質的影響研究鮮有報道。

本研究以懷來產區西拉葡萄為原料，選用本土美極梅奇酵母和本土葡萄汁有孢漢遜酵母及商業戴爾有孢圓酵母，分別與釀酒酵母F15 按照不同接種方案進行發酵試驗，探究混合發酵對葡萄酒理化指標、揮發性香氣成分以及感官品質的影響，旨在為非釀酒酵母對西拉葡萄酒風味品質的改善研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西拉葡萄：2021 年10 月采自河北懷來桑干酒莊葡萄園，還原糖含量242.6 g/L，可滴定酸含量（以酒石酸計）5.67 g/L。

釀酒酵母（S.cerevisiae）F15：法國LAFFORT 公司；商業戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）：安琪酵母股份有限公司； 本土美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、本土葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）：均由河北農業大學果蔬加工貯藏實驗室前期在懷來產區篩得，保藏于河北農業大學食品科技學院。

YPD 培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L、瓊脂20 g/L（固體培養基時加入），高壓滅菌20 min。

葡萄汁培養基：葡萄汁高壓滅菌20 min。

果膠酶（食品級，8 600 PGNU/g）：法國LAFFORT公司；偏重亞硫酸鉀、氯化鈉（食品級）：國藥集團化學試劑有限公司；3-辛醇標準品：美國Sigma-Aldrich 公司；檸檬酸（分析純）：天津市北辰方正試劑廠；磷酸氫二鈉（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B -5977A 氣相色譜質譜聯用儀、HP -INNOWAX 色譜柱（60 m×250 μm，0.25 μm）：美國Agilent公司；57328-U 固相微萃取儀：美國Supelco 公司；Wine Scan FT 120 葡萄酒成分分析儀：丹麥FOSS 公司；SPX 生化培養箱：寧波東南儀器有限公司；HZQ-F全溫振蕩培養箱：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；TU-1810 紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母培養

商業釀酒酵母菌株的活化：稱取S.cerevisiae F15活性干粉（100 mg/L），將其溶于10 倍體積的37 ℃的無菌水中活化20 min。稱取T.delbrueckii 活性干粉（200 mg/L），將其溶于10 倍體積的25 ℃的無菌水中活化20 min。

本土非釀酒酵母菌株的活化：從YPD 固體培養基上挑取M.pulcherrima 和H.uvarum 的單菌落分別接入YPD 液體培養基中，28 ℃搖床培養24 h，以2%的接種量接種到葡萄汁培養基中，28 ℃培養48 h 后以2%的接種量進行酒精發酵。

1.3.2 發酵試驗

西拉葡萄除梗破碎后加入20 mg/L 果膠酶，50 mg/L偏重亞硫酸鉀，分裝于5 L 玻璃發酵罐中，每罐約3.5 L西拉葡萄醪，低溫浸漬48 h，按照表1 的接種方案接入酵母種子液，15～25 ℃發酵，每個處理3 組平行。每天監測發酵液比重，當比重降至0.996 時測定發酵液中殘糖含量，當殘糖含量小于4 g/L 時，分離皮渣，從每個發酵罐中取200 mL 酒樣，于-20 ℃保存待測。

表1 發酵試驗接種方案Table 1 Inoculation programme of fermentation test

1.4 試驗指標測定方法

1.4.1 基本理化指標

酒精度、還原糖含量、總酸含量、pH 值和甘油含量等基本理化指標利用葡萄酒成分分析儀測定，透射掃描波數5 012～926 cm-1。

色度及色調：參考李運奎等[16]的方法測定。酒樣經0.45 μm 濾膜過濾，配制與酒樣相同pH 值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液將酒樣稀釋10 倍，將待測樣品放入1 cm 比色皿中，分別測定其在波長420、520、620 nm下的吸光值A420、A520、A620，色度為三者之和，色調為A420與A520的比值。

1.4.2 揮發性香氣化合物

采用氣相色譜質譜聯用儀測定酒樣中揮發性香氣物質，參照夏亞男等[17]的方法并稍作改動。吸取8 mL待測酒樣于20 mL 樣品瓶中，同時加入10 μL 的3-辛醇（300 mg/L）和2 g NaCl，立即蓋緊瓶蓋密封。40 ℃水浴平衡15 min 后，將萃取頭插入樣品瓶頂空部分吸附40 min，于氣相色譜儀進樣口解吸6 min。

色譜條件：升溫程序為50 ℃保持2 min，以3 ℃/min的速率升溫至80 ℃，再以5 ℃/min 速率升溫至230 ℃，持續6 min。進樣口溫度為240 ℃，不分流進樣，載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min。

質譜條件：電子轟擊電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質譜掃描范圍m/z 35～550。

定性與定量分析：利用質譜掃描圖譜與NIST14.L譜庫進行比對定性，對匹配度為80%以上的組分進行分析。各成分的含量采用內標法進行半定量，選用3-辛醇作為內標物質。

1.4.3 感官評價

品評小組由7 名經驗豐富的品酒師和5 名經過專業培訓的品評人員組成，采用盲品的方式。在光線充足、通風良好、無異味的房間內進行3 輪。分別從外觀（澄清度、色澤）、香氣（花香、果香、酒精味）、口感（酸度、甜度、收斂性）和整體評分4 個方面對酒樣進行評價，按照10 分制強度等級進行打分，評分范圍從0（弱）到10（強），感官評價結果為所有評估小組成員得分的平均值。

1.5 數據統計分析

試驗結果用平均值±標準差表示，使用SPSS26 軟件進行方差分析和鄧肯多重比較，顯著性水平P＜0.05；使用Origin 2021 軟件進行繪圖和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 酒精發酵過程中比重的變化

不同處理酒樣的比重變化如圖1 所示。

圖1 酒精發酵過程比重的變化Fig.1 Change of specific gravity during alcohol fermentation

由圖1 可知，各處理酒樣的比重隨發酵時間的延長呈持續下降趨勢，不同處理酒樣的比重下降速率存在差異。發酵前3 d，各處理酒樣比重下降均較緩慢，變化不明顯。隨后比重快速下降，從發酵第10 天開始各處理酒樣比重下降速率趨緩，發酵12 d 時F15 處理酒精發酵結束，15 d 時其余處理均完成酒精發酵，且所有處理最終達到相似比重。混合發酵延長了酒精發酵時間，這與Hranilovic 等[14]的研究結果一致。

2.2 不同處理對西拉葡萄酒基本理化指標的影響

酒精發酵結束時酒樣的基本理化指標如表2 所示。

表2 酒精發酵后酒樣的基本理化指標Table 2 Basic physical and chemical indexes of wine samples after alcohol fermentation

由表2 可知，5 個處理的還原糖含量均小于4 g/L，混合發酵處理的酒精度（12.54% vol～12.74% vol）均顯著低于F15 處理（13.06% vol）（P＜0.05），這與宋茹茹等[18]的研究結果一致。非釀酒酵母通過氧化消耗葡萄糖生成除乙醇外的其他代謝產物，從而降低酒樣的乙醇含量[19]。此外，混合發酵的葡萄酒中甘油含量提高了12.3%～15.3%，甘油可以增加葡萄酒的黏度，賦予葡萄酒圓潤的口感和豐滿的酒體。相關研究顯示，非釀酒酵母具有較強的產甘油能力，如H.uvarum 與S.cerevisiae混合發酵的甘油含量高于釀酒酵母單獨發酵[20]。混合發酵顯著提高了葡萄酒色度（P＜0.05），這可能與混合發酵處理丙酮酸含量增加有關，丙酮酸與花色苷形成色素vitisin A，有助于增加色素穩定性[21]。與單菌發酵相比，混合發酵葡萄酒的色調顯著降低（P＜0.05），顏色更偏向紅色，這與梁麗紅等[22]的研究結果一致。

2.3 香氣成分分析

不同處理對西拉葡萄酒揮發性香氣化合物的影響如表3 所示。

表3 不同試驗處理葡萄酒的香氣成分及其含量Table 3 Aroma components and their contents in wine samples with different test treatments

由表3 可知，供試酒樣共檢測出37 種揮發性香氣物質，包括17 種酯類（其中乙酸酯類5 種、乙醇酯類10 種以及其他酯類2 種）、10 種高級醇類、4 種脂肪酸類和6 種其他類化合物。不同處理對西拉葡萄酒揮發性香氣成分的影響差異較大，其中FM 香氣物質含量最高，為27 787.61 μg/L，對照F15 香氣物質含量最低，為23 254.24 μg/L。

酯類物質是葡萄酒中重要的風味組成成分，主要包括乙酸酯和乙醇酯，它們能夠為葡萄酒帶來愉悅的花香和果香味[23]。本試驗各處理酒樣中酯類總含量從高到低依次是FM＞FH＞FN＞FMH＞F15，混合發酵有利于提升酯類產量，這與李毅麗等[24]的研究結果一致。與對照F15 相比，混合發酵處理乙酸異戊酯含量提高了54.2%～204.2%，且含量均超過其閾值，增強了葡萄酒的果香特征。乙酸苯乙酯可以賦予葡萄酒梔子花香和玫瑰花香，本試驗FM 酒樣中乙酸苯乙酯含量明顯高于其他處理。此前有研究發現M.pulcherrima 與S.cerevisiae順序接種發酵提高了葡萄酒中乙酸苯乙酯的含量[25]。供試酒樣中共檢測出10 種乙醇酯類化合物，其中辛酸乙酯（梨香、菠蘿）、癸酸乙酯（椰子味、果香）和己酸乙酯（青蘋果、草莓、香蕉）含量較高，對葡萄酒的果香有重要貢獻，混合發酵均提高了己酸乙酯的含量。

高級醇是酵母代謝的副產物之一，在氨基酸或糖的作用下，通過Ehrlich 途徑和葡萄糖合成代謝途徑生成[26]，對葡萄酒香氣有重要影響。當含量低于300 mg/L時會增加葡萄酒的香氣復雜性，當含量過高時則會給葡萄酒帶來負面影響[27]。由表3 可知，混合發酵顯著提高了苯乙醇含量（P＜0.05），其中FN 酒樣中苯乙醇含量最高，是F15 處理的2.29 倍，賦予葡萄酒玫瑰、蜂蜜、丁香花的香氣。混合發酵酒樣的異丁醇含量為對照的1.71 倍～3.86 倍，李毅麗等[24]和夏鴻川等[28]的研究也得到相似結果。此外，僅在FM 和FH 酒樣中檢測到辛醇，給葡萄酒帶來了茉莉花香和檸檬香味。

葡萄酒中的脂肪酸對香氣平衡起重要作用，低濃度時能賦予葡萄酒奶酪、黃油等香氣特征，高濃度則會有醋酸味和刺激味[29]。本試驗共檢測出4 種脂肪酸，與對照F15 相比，混合發酵處理顯著降低了酒樣中揮發性脂肪酸總量，同時混合發酵處理的葡萄酒中辛酸和己酸的含量明顯減少。這與宋茹茹等[18]的研究結果一致，T.delbrueckii 與釀酒酵母混合發酵顯著降低了辛酸含量，有利于減少葡萄酒的酸敗味。萜類物質具有較低閾值，對葡萄酒中花香和水果香有重要貢獻[30]。本試驗中測得的萜烯類化合物有香茅醇和β-香茅醇，其中β-香茅醇只在對照F15 中檢測出，而香茅醇含量在各處理中差異不明顯。

不同處理香氣物質的主成分（principal component，PC）分析如圖2 所示。

圖2 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖Fig.2 Factor load diagram of principal component analysis of aroma compounds

由圖2 得知，PC1 的貢獻率為50.2%，PC2 的貢獻率為23.5%，總貢獻率為73.7%。各處理在圖中彼此分離，F15 處理與順序接種發酵處理分別位于PC1 的左右兩側且相距較遠，說明混合發酵處理改變了葡萄酒的香氣輪廓。其中F15 位于PC1 的正方向和PC2 的負方向上，主要有Y12（棕櫚酸乙酯）、Y35（β-香茅醇）、Y30（癸酸）和Y16（己酸異戊酯)等香氣成分。而混合發酵處理組均位于PC1 的負方向上，其中FMH 位于PC2 的負方向上，與Y27（丙醇）、Y20（壬醇）、Y13（9-癸烯酸乙酯）和Y37（2，4-二叔丁基苯酚）相關性強；FN、FM 和FH 位于PC2 的正方向上，酒樣中Y3（乙酸苯乙酯）、Y10（己酸乙酯）、Y5（乙酸乙酯）、Y21（苯乙醇）、Y2（乙酸異戊酯）、Y6（辛酸乙酯）、Y9（丁酸乙酯）和Y23（正己醇）等香氣物質含量豐富，這些物質為葡萄酒貢獻了濃郁的花香味和果香味。

2.4 感官評價結果

不同處理西拉葡萄酒的感官分析結果如圖3 所示。

圖3 酒精發酵結束西拉葡萄酒香氣輪廓圖Fig.3 Aroma profile of Syrah wine after alcohol fermentation

從外觀方面來看，葡萄酒的澄清度無明顯差異，混合發酵的葡萄酒色澤評分略高于對照。口感方面，混合發酵的葡萄酒酸度評分略高，各處理甜度和收斂性差別不大。在香氣方面，對照組的酒精味較明顯，與該處理酒樣的乙醇含量較高相一致。添加非釀酒酵母發酵弱化了酒精味，并且具有更加濃郁的花香和果香味，這與混合發酵處理酒樣中一些酯類物質和高級醇類物質含量增加有關，祝霞等[29]也發現混合發酵明顯增強了葡萄酒的花香和果香特征。綜合分析，FM 處理的酒樣香氣馥郁、口感平衡且酒體豐滿，整體感官評分最高。

3 結論

本試驗探究了不同非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵對西拉葡萄酒理化指標、揮發性香氣成分以及感官品質的影響。結果表明：與對照F15 相比，混合發酵處理葡萄酒的乙醇含量顯著降低，甘油含量及色度均顯著增加（P＜0.05）。在香氣方面，混合發酵均提高了香氣物質總量，其中FM 酒樣的香氣物質總量比對照增加了19.5%，增強了西拉葡萄酒愉悅的果香和花香味，感官評價結果表明FM 葡萄酒香氣濃郁協調，且具有良好的口感，整體評分最高。綜上所述，本土M.pulcherrima 與S.cerevisiae 順序接種發酵對改善西拉葡萄酒的香氣品質有積極作用，具有潛在的應用價值。