叢毛紅曲霉工程菌TI- 25 高產莫納可林K發(fā)酵工藝優(yōu)化

張亞如，肖麗釃，陳麗晨，葉燕芳，鄭政淮，黃志偉*

（1.福建農林大學 食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學 福建省特種淀粉品質科學與加工技術重點實驗室，福建 福州 350002）

紅曲是亞洲的一種傳統(tǒng)食物，又稱為赤米、紅米，具有藥用和食用的雙重用途[1]。紅曲霉屬（Monascus Van.Tiegh.） 隸屬于散囊菌目（Eurtotiales）、曲霉科（Aspergillaceae）[2]。紅曲霉發(fā)酵秈米(又稱為紅曲米)被廣泛食用[3]。紅曲霉發(fā)酵后可產生各種有益的次生代謝產物，包括色素、γ-氨基丁酸、莫納可林K（monacolin K，MK）等[4-5]。

莫納可林K 最早由日本學者遠藤章教授于1979年從紅色紅曲霉（Monascus ruber）的發(fā)酵產物中首次分離獲得[6]。莫納可林K 是一種廣泛應用的降血脂藥物，其結構與膽固醇合成途徑限速酶——3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶相似，可高效地競爭性抑制該還原酶的活性，從而有效抑制血液中的膽固醇合成[7-8]。莫納可林K 在酸性條件下有酸式和內酯式兩種結構，其中起降血脂作用的是酸式莫納可林K[9]。除降血脂外，莫納可林K 還具有抗癌防癌[10-12]、保護神經[13-14]、抗炎抑菌[15]等生理功能。

紅曲霉生產MK 的常見發(fā)酵模式有固態(tài)發(fā)酵（solid state fermentation，SSF）和液態(tài)發(fā)酵（submerged fermentation，SmF）。在紅曲霉產MK 的發(fā)酵條件優(yōu)化研究中，以SSF 的研究居多[16-17]，其原因可能是與SmF 法相比，SSF 法有許多優(yōu)勢，真菌在SSF 中能產生更多的酶和次級代謝物，并且有些酶只在SSF 中產生[18]。Zhang 等[19-20]向液態(tài)培養(yǎng)基中加入瓊脂制成固態(tài)培養(yǎng)基，再將紅曲霉分別接種于切割成小塊的固態(tài)培養(yǎng)基與未加瓊脂的液態(tài)培養(yǎng)基中進行發(fā)酵試驗，結果發(fā)現(xiàn)與SmF 相比，SSF 下紅曲霉的生物量積累、MK 合成速率、甘油消耗率、細胞膜的流動性與滲透性以及甘油耐受濃度都明顯高于SmF 下的紅曲霉。因此，在SSF下紅曲霉的MK 產量通常會比SmF 高[21-22]。

本課題組在前期研究中獲得了過表達mok I 基因的叢毛紅曲霉工程菌TI-25，其MK 產量比出發(fā)菌株CICC 5045 提高了41.39%。本試驗采用固態(tài)發(fā)酵的方式，研究發(fā)酵瓶裝米量、初始加水量、種子液接種量、種子液培養(yǎng)基初始pH 值、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵變溫時間6 個因素對該菌株MK 產量的影響，并結合響應面法優(yōu)化其產MK 的最適發(fā)酵工藝，以期為該菌株的應用推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

供試菌株為叢毛紅曲霉過表達mok I 基因的工程菌TI-25。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：稱取145.1 g 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，加入適量純凈水中，加熱使其充分溶解后定容至1 000 mL，然后分裝于試管中，在121 ℃下高壓滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基配方：蛋白胨10 g，葡萄糖30 g，NaNO32 g、甘油70 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，豆粕粉15 g。種子液培養(yǎng)基配制完成后，分裝于250 mL三角瓶中（100 mL/瓶），在121 ℃下高壓滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基配方：甘油5 g，秈米30 g，pH 自然，純凈水14 mL，于121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.1.2 材料與試劑

秈米（金泰香米）：泉州萬年香米業(yè)有限責任公司；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：山東海波海洋生物科技股份有限公司；葡萄糖蛋白胨、甘油、磷酸二氫鉀、豆粕粉（發(fā)酵專用）、ZnSO4·7H2O、氫氧化鈉、75%乙醇、NaNO3、Mg－SO4·7H2O(均為分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、磷酸、甲醇（均為色譜純）：格雷斯（中國）有限公司；MK 標準品（洛伐他汀≥98%）：中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設備

DHG-9005 電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；MDF-382E 超低溫保存箱：日本三洋電機貿易會社；ZHWY-200D 恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；MJ-54A 高壓蒸汽滅菌鍋：施都凱儀器設備有限公司；KQ-500VDE 雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 叢毛紅曲霉菌株TI-25 產MK 發(fā)酵工藝的單因素試驗

1.3.1.1 發(fā)酵瓶裝米量對MK 產量的影響

在350 mL 發(fā)酵瓶中分別裝入20、30、40、50、60 g秈米，固定培養(yǎng)基的初始加水量為30 mL、種子液接種量為10%、種子液培養(yǎng)基初始pH4.5、30 ℃培養(yǎng)2 d后，變溫為28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)13 d。考察發(fā)酵瓶裝米量對MK 產量的影響。

1.3.1.2 初始加水量對MK 產量的影響

固定發(fā)酵瓶裝米量30 g、種子液接種量10.0%、種子液培養(yǎng)基初始pH4.5、30 ℃培養(yǎng)2 d 后，變溫為28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)13 d。在大米固態(tài)培養(yǎng)基中，分別添加10、15、20、25、30、35 mL 水，考察培養(yǎng)基的初始加水量對MK 產量的影響。

1.3.1.3 種子液接種量對MK 產量的影響

固定發(fā)酵瓶裝米量30 g、培養(yǎng)基的初始加水量30 mL、種子液培養(yǎng)基初始pH4.5、30 ℃培養(yǎng)2 d 后，變溫為28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)13 d。在大米固態(tài)培養(yǎng)基中分別接種7.0%、10.0%、13.0%、16.0%、19.0%的種子液，考察種子液接種量對MK 產量的影響。

1.3.1.4 種子液培養(yǎng)基初始pH 值對MK 產量的影響

固定發(fā)酵瓶裝米量30 g、培養(yǎng)基的初始加水量30 mL、種子液接種量10.0%、30 ℃培養(yǎng)2 d 后，變溫為28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)13 d。利用氨水和醋酸調節(jié)種子液培養(yǎng)基的初始pH 值，分別調至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，種子液培養(yǎng)后接種到秈米固態(tài)培養(yǎng)基中，考察種子液培養(yǎng)基初始pH 值對MK 產量的影響。

1.3.1.5 發(fā)酵變溫時間對MK 產量的影響

固定發(fā)酵瓶裝米量30 g、培養(yǎng)基的初始加水量30 mL、種子液接種量10.0%、種子液培養(yǎng)基初始pH4.5。分別將已接種叢毛紅曲霉的發(fā)酵瓶置于30 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d 后，變溫為28 ℃繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至15 d，考察發(fā)酵變溫時間對MK 產量的影響。

1.3.1.6 發(fā)酵時間對MK 產量的影響

固定發(fā)酵瓶裝米量30 g、培養(yǎng)基的初始加水量30 mL、種子液接種量10.0%、種子液培養(yǎng)基初始pH4.5，30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)2 d，然后28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)至18 d。將接種叢毛紅曲霉后的秈米固態(tài)培養(yǎng)基分別培養(yǎng)7、9、13、15、18、21、24 d，考察發(fā)酵時間對MK 產量的影響。

1.3.1.7 固態(tài)發(fā)酵條件最優(yōu)組合的響應面優(yōu)化設計

選取單因素試驗的最佳條件中心位置，并分別選取在中心位置的左右水平值。選取對叢毛紅曲霉MK產量影響較顯著的因素：發(fā)酵瓶裝米量、初始加水量、變溫時間，進行三因素三水平的響應面試驗設計，因素水平見表1。

表1 響應面試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.2 高效液相色譜檢測和MK 產量計算

酸式MK 標準溶液：準確稱取1.5 mg MK 標準品，置于10 mL 棕色容量瓶中，加入2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液處理，再用75%乙醇定容至10 mL，50 ℃水浴35 min，超聲轉化35 min，配制成濃度為150 μg/mL 的標準溶液。

內酯式MK 標準溶液：準確稱取1.5 mg MK 標準品，置于10 mL 棕色容量瓶中，以75%乙醇溶解，并定容至10 mL，配制成150 μg/mL 的標準溶液。

待測樣品的前處理：稱取1.0 g 叢毛紅曲霉發(fā)酵產物的待測樣品，加入10 mL 離心管中，加入75%乙醇溶液定容至10 mL，于30 ℃下超聲處理40 min，超聲過程的前期、中期、后期均要進行搖勻，超聲結束后靜置15 min，然后取上清液5 mL，過0.45 μm 濾膜后待進樣檢測。

色譜條件：色譜柱為Waters SunFire C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動相為乙腈∶0.1%磷酸水溶液=55∶45（體積比）；流速為1 mL/min；紫外檢測器的波長為238 nm；柱溫為30℃；進樣量為20 μL。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測后，待測樣品中MK 產量的計算公式如下。

式中：Y 為MK 產量，mg/kg；W 為稀釋倍數(shù)；CMK為MK 標準品濃度和待測樣品目標物質峰面積（A）的比值，μg/mL；m 為待測樣品的質量，g。

1.4 數(shù)據處理與統(tǒng)計

采用SPSS 數(shù)據處理系統(tǒng)（IBM SPSS Statistics 24.0）和Design-Expert 12.0，對試驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 MK 標準品和待測樣品的HPLC 圖

MK 標準品的高效液相色譜圖見圖1。叢毛紅曲霉菌株TI-25 待測樣品的HPLC 色譜圖見圖2。

圖1 MK 標準品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of standard form of MK

圖2 叢毛紅曲霉菌株TI-25 待測樣品的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of Monascus pilosus strain TI-25 samples to be measured

由圖1 可以看出，在150 μg/mL 濃度下，酸式MK標準品的出峰時間為9.328 min，內酯式MK 標準品的出峰時間為17.751 min，均不存在雜峰，有良好的分離效果。

由圖2 可以看出，待測樣品中酸式MK 的出峰時間為9.032 min，內酯式MK 的出峰時間為17.751 min，不存在雜峰，有良好的分離效果。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 發(fā)酵瓶裝米量對MK 產量的影響

紅曲霉固態(tài)發(fā)酵中，氧氣對產MK 產量至關重要，發(fā)酵過程中，瓶裝米量對生產MK 的影響較大，而對氧濃度的控制主要取決于發(fā)酵瓶裝米量的多少。發(fā)酵瓶裝米量對MK 產量的影響結果如圖3 所示。

從圖3 可知，當發(fā)酵瓶的裝米量為20～30 g 時，叢毛紅曲霉的MK 產量隨發(fā)酵瓶裝米量增加逐漸提高，且在30 g 時MK 產量最高，可達到303.04 mg/kg，其原因可能是發(fā)酵瓶的裝米量過少時，培養(yǎng)基里的水分易揮發(fā)，培養(yǎng)基變干，無法提供紅曲霉正常生長所必需的營養(yǎng)[23]。裝米量為30～50 g 時，叢毛紅曲霉的MK 產量隨著發(fā)酵瓶裝米量的增加而逐漸降低。分析其原因，可能是發(fā)酵瓶中的氧氣有限，若裝米量過多會加快氧氣的消耗，使發(fā)酵瓶內產生大量乙醇，不利于紅曲霉的生長，從而影響MK 的產量。因此發(fā)酵瓶裝米量以30 g 最優(yōu)。

2.2.2 初始加水量對MK 產量的影響

固態(tài)發(fā)酵基質的不同對其含水量的要求也不同，但一般為40%～60%[24]，含水量過高或過低都不利于紅曲霉的生長。培養(yǎng)基的初始含水量對MK 產量的影響結果如圖4 所示。

圖4 培養(yǎng)基的初始加水量對MK 產量的影響Fig.4 Effect of initial water addition in culture medium on MK yield

從圖4 可知，培養(yǎng)基初始加水量的多少對MK 產量有一定的影響。在10～30mL 時，隨著初始加水量的增加，叢毛紅曲霉菌株TI-25 的MK 產量持續(xù)增加；在初始加水量達到30 mL 時，MK 的產量最高，為601.21 mg/kg。分析其原因，加水量少于30 mL 時，米粒發(fā)酵不充分，斷層稍有白色，米質較硬，水不能將大米完全浸泡，不利于菌體的生長繁殖，導致其MK 產量較低。當初始加水量為35 mL 時，MK 產量大幅下降，且發(fā)酵秈米出現(xiàn)嚴重結團現(xiàn)象，不利于菌體的生長。因此，加30 mL 水最有利于叢毛紅曲霉菌株TI-25 的生長和MK 合成。

2.2.3 種子液接種量對MK 產量的影響

種子液接種量的不同會影響菌體的生長狀況，進而對其MK 產量存在一定的影響。種子液接種量對MK 產量的影響結果見圖5。

圖5 種子液接種量對MK 產量的影響Fig.5 Effect of inoculation amount of seed solution on MK yield

如圖5 所示，種子液接種量對其MK 產量有一定的影響。當種子液接種量為10.0%時，發(fā)酵產物的MK產量最高，達到442.12 mg/kg。分析原因可能是當種子液接種量過少時，菌體生長速度較慢，培養(yǎng)基營養(yǎng)過剩，發(fā)酵需要的時間增加，MK 產量較低；當種子液接種量不斷增加時，菌體生長繁殖加快，從而消耗的營養(yǎng)及溶氧量不斷增加，導致MK 產量受限。因此，叢毛紅曲霉產MK 的最佳種子液接種量為10.0%。

2.2.4 種子液培養(yǎng)基初始pH 值對MK 產量的影響

種子液培養(yǎng)基初始pH 值對MK 產量的影響試驗結果見圖6。

圖6 種子液培養(yǎng)基初始pH 值對MK 產量的影響Fig.6 Effect of initial pH of culture medium with seed solution on MK yield

圖6 顯示，種子液培養(yǎng)基的不同初始pH 值對其MK 產量的影響不大。當種子液培養(yǎng)基初始pH 值小于4.5 時，MK 產量與種子液培養(yǎng)基初始pH 值呈正比，當種子液培養(yǎng)基初始pH 值高于4.5 時，隨著種子液培養(yǎng)基初始pH 值的升高，MK 產量整體呈下降趨勢。當種子液培養(yǎng)基初始pH 值為4.5 時，MK 產量達到最高，即298.86 mg/kg，說明此時的種子液培養(yǎng)基初始pH 值最適宜叢毛紅曲霉產MK。

2.2.5 發(fā)酵變溫時間對MK 產量的影響

紅曲霉發(fā)酵過程中，變溫培養(yǎng)的MK 產量普遍優(yōu)于恒溫培養(yǎng)，但不同的菌株對變溫的需求不同[21-25]。發(fā)酵變溫時間對MK 產量的影響試驗結果見圖7。

圖7 發(fā)酵變溫時間對MK 產量的影響Fig.7 Effect of temperature change time of fermentation on MK yield

如圖7 所示，發(fā)酵變溫時間對紅曲霉產MK 也有著很大的影響。當30 ℃培養(yǎng)3 d 后變?yōu)?8 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 d 時，叢毛紅曲霉的MK 產量最高，達到826.75 mg/kg；當30 ℃培養(yǎng)的時間過長時，MK 產量會顯著降低，這可能是因為叢毛紅曲霉的發(fā)酵周期一般為15 d，菌絲體長期在高溫下，生長旺盛，營養(yǎng)物質提前耗盡，不利于后期發(fā)酵產物的次生代謝物積累，從而降低了MK的產量。因此，30 ℃培養(yǎng)3 d 后變?yōu)?8 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 d，為叢毛紅曲霉菌株TI-25 固態(tài)發(fā)酵產MK 的最適變溫條件。

2.2.6 發(fā)酵時間對MK 產量的影響

不同紅曲霉菌株的發(fā)酵周期可能不同，要根據具體的菌株確定其適宜的發(fā)酵時間[26]。發(fā)酵時間對MK產量的影響結果見圖8。

圖8 發(fā)酵時間對MK 產量的影響Fig.8 Effect of fermentation time on MK yield

如圖8 所示，發(fā)酵時間對叢毛紅曲霉MK 產量的影響較大。在發(fā)酵前期(1～6 d)，MK 的產量很低甚至檢測不到，說明叢毛紅曲霉產MK 的發(fā)酵周期可能較長，發(fā)酵前期正處于其生長階段尚未合成MK；當發(fā)酵至15 d 時，MK 的產量達到最高值（261.47 mg/kg）；繼續(xù)發(fā)酵，MK 的產量整體呈降低趨勢，其可能原因是營養(yǎng)物質在發(fā)酵后期消耗殆盡，不能再支持菌體的生長，從而導致MK 的產量降低。因此，紅曲霉產MK 的發(fā)酵過程中，其MK 產量在發(fā)酵至第15 天時達到最大值。

2.3 固態(tài)發(fā)酵條件最優(yōu)組合的響應面優(yōu)化結果分析

2.3.1 響應面優(yōu)化試驗與結果

根據單因素試驗結果，利用Design-Expert 12.0 進行中心組合試驗設計，所得結果如表2 所示。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface experimental design and results

2.3.2 響應面模型的建立與分析

利用Design-Expert 12.0 軟件對表2 中的試驗結果進行回歸分析，得到二次回歸模型的方差分析結果，見表3。

表3 二次回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for quadratic regression model

對表3 中的數(shù)據進行二次多項回歸擬合，得到MK產量（Y）對發(fā)酵瓶裝米量（A）、初始加水量（B）、發(fā)酵變溫時間（C） 的二次多項式回歸方程：Y=336.4-123.20A+33.83B-60.79C+11.15AB+27.66AC-30.18BC+72.01A2-44.94B2+13.56C2。

由表3 可以看出，響應模型極顯著，F(xiàn)=7.75，失擬項P=0.967 3＞0.05 不顯著，表明該模型擬合度較高。方程決定系數(shù)R2為0.908 8，說明該方程的回歸效果比較理想；預測R2值（0.791 6）與矯正R2值（0.782 7）較為接近，表明該方程不需要做進一步優(yōu)化。此外，模型的一次項A 影響極顯著（p＜0.01），C 影響顯著（p＜0.05）。通過比較F 值的大小得出3 個因素對MK 產量影響的主次順序為A>C>B，即發(fā)酵瓶裝米量>發(fā)酵變溫時間>初始加水量。

各交互作用對MK 產量影響的響應面圖見圖9。

圖9 各因素交互作用對MK 產量的影響Fig.9 Effects of interaction between factors on MK yield

根據三維響應面可以看出各變量之間的交互作用對響應值的影響，等高線是響應面在水平方向的投影，等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著，呈圓形表示兩因素交互作用不顯著。由圖9 可以看出，各因素交互作用大小依次為BC＞AC＞AB，但各曲面坡度均較平緩，等高線接近圓形，對響應面值的影響均不顯著，與表3 的回歸分析結果相符。

由該模型得到的最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵瓶裝米量20 g，初始加水量32.38 mL，30 ℃培養(yǎng)3 d 后，變溫為28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 d，種子液接種量10.0%，種子液培養(yǎng)基初始pH 值為4.5，按此條件發(fā)酵培養(yǎng)，MK 產量為635.12 mg/kg，與預測的643.61 mg/kg 接近，說明該回歸方程預測的MK 產量與實際的MK 產量是一致的。

3 結論

本試驗以MK 為目標產物，通過單因素試驗和Box-Behnken 響應面優(yōu)化試驗，得出叢毛紅曲霉工程菌TI-25 高產MK 的最佳發(fā)酵工藝：發(fā)酵瓶裝米量20 g，初始加水量32.38 mL，30 ℃培養(yǎng)3 d 后變?yōu)?8 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 d，種子液種子液接種量10%，種子液培養(yǎng)基初始pH 值為4.5，按此條件發(fā)酵培養(yǎng)，MK 產量高達635.12 mg/kg。這與預測值643.61 mg/kg 接近，說明通過響應面優(yōu)化得到的叢毛紅曲霉工程菌TI-25 高產MK 的固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)準確可靠。