山藥皮中黃酮、多酚提取工藝優化及其抗氧化活性

杭書揚，楊林霄，郭建行，錢格格，劉延奇，2，3*

（1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001；3.河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001）

山藥屬薯蕷科植物，是我國傳統的功能性食材[1-2]，山藥含有多種生物活性成分，其中必需氨基酸、多糖、黃酮類化合物和酚酸是主要成分[3]，它們具有許多潛在功效，廣泛應用于治療糖尿病、抗氧化和免疫調節[4-5]等方面。山藥既可以作為家常菜食用，也可剝皮、切片、曬干或風干制作中草藥[6]，在處理過程中，產生可達20%的廢棄物——山藥皮[7]。山藥皮中含有的生物活性化合物比可食用部分更多[8]，據研究，山藥皮提取物的尿囊素、黃酮和總酚含量均高于粉質部位提取物，山藥皮提取液中黃酮類化合物含量是粉質部位提取液的1.72～2.23 倍[9]。

黃酮、多酚有著抗氧化、抗菌和抗炎等豐富的生物活性，這些性質對改善人體健康水平有著積極的作用，因此黃酮、多酚類物質一直是食品領域研究的熱點。最近的研究表明，每天攝入超過1 g 的多酚可有效降低慢性疾病的患病率[10]。山藥皮中有著豐富的黃酮、多酚，已有報道通過熱回流法提取鐵棍山藥皮中黃酮類化合物，但提取量僅為0.338 2 mg/g[11]，因此尋找一種高效的提取方法對于開發山藥皮的營養功能有重要意義。

提取方式作為從山藥皮中獲取酚類物質的關鍵步驟，目前主要有溶劑萃取、機械萃取、超臨界萃取、微波萃取、熱回流等方法。但通過這些方法回收酚類物質具有局限性，例如在溶劑萃取中使用額外的溶劑、機械萃取的得率低、超臨界萃取的成本高以及微波輔助萃取中需要水相等[12]。與這些方法相比，超聲輔助提取具有時間和能量需求少、低溫提取和保留提取物質量等優點。超聲輔助提取是用高強度聲波從山藥皮中提取黃酮、多酚，利用超聲波輻射壓強產生的強烈空化效應、機械振動、擾動效應等多級效應，增大物質分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標成分進入溶劑，促進提取的進行[13]，與超聲輔助提取相關的變量有頻率、功率、溫度、時間、溶劑類型、液固比，需要精確控制以實現最佳提取。

為研究山藥皮黃酮、多酚的高效提取工藝，本試驗以鐵棍山藥皮為原料，以黃酮、多酚得率為考察指標，選擇乙醇濃度、液固比、超聲時間作為考察因素，利用正交法優化提取條件，并對最優條件提取的山藥皮粗提物進行抗氧化性試驗，為進一步研究山藥皮的營養功能提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

鐵棍山藥：市售；蘆丁標準品、沒食子酸標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、福林酚：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、NaNO2、Na2CO3、Al（NO3）3、NaOH、復合磷酸鹽、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、石油醚（均為分析純）：天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器

紫外分光光度計（UV-1800）：上海美普達公司；分析天平（BSA223S）：德國賽多利斯公司；數控超聲清洗機（SB-4200DT）：寧波新芝生物科技有限公司；循環式多用真空泵（SHZ-D）：河南金友成儀器設備有限公司；旋轉蒸發儀器（YRE-52AA）：鞏義市予華儀器有限責任公司；電熱鼓風干燥箱（DHG-9123A）：上海精宏實驗設備有限公司。

2 方法

2.1 山藥皮粗提物提取流程

新鮮山藥洗凈、去皮（皮厚約為0.2 mm）、烘干、磨粉過80 目篩得山藥皮粉末，將山藥皮粉末與乙醇溶液按一定比例置于錐形瓶中進行超聲提取，提取完成后將溶液離心取上清液，減壓濃縮到一定體積后用石油醚進行萃取脫脂處理，旋蒸除去殘留的石油醚后，冷凍干燥得山藥皮粗提物。

2.2 線性關系考察

2.2.1 多酚含量的測定

參考文獻[14]方法并稍作修改，分別移取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 沒食子酸標準溶液（0.1 mg/mL）于10 mL 比色管中，加入福林酚0.4 mL 搖勻，再加入0.8 mL Na2CO3（質量分數為15%），加蒸餾水定容到10 mL 混勻后避光反應1 h，于760 nm 處測定吸光度。以吸光度（A）對沒食子酸的質量濃度（X）進行回歸，得方程Y=0.111 7X+0.116 3，R2=0.996 7。

2.2.2 黃酮含量的測定

參考文獻[15]方法并稍作修改，分別吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 蘆丁標準溶液（0.1 mg/mL）于10 mL棕色比色管；加入0.3 mL NaNO2（質量分數為5%）避光反應6 min；加入0.3 mL Al（NO3）3（質量分數為10%）避光反應6 min；加入4 mL NaOH（質量分數為4%），去加蒸餾水定容到10 mL 后靜置15 min，于510 nm 處測定吸光度。以吸光度（A）對蘆丁濃度（X）進行回歸，得方程Y=0.011 4X+0.059 7，R2=0.998 3。

2.3 黃酮和多酚得率測定

黃酮得率測定：根據蘆丁標曲方法進行吸光度的檢測，黃酮得率計算公式如下。

式中：X 為黃酮得率，%；C1為黃酮質量濃度，g/mL；V1為提取液的定容體積，mL；m 為山藥皮質量，g；N1為稀釋倍數。

多酚得率測定：根據沒食子酸標曲方法進行吸光度的檢測，多酚得率計算公式如下。

式中：Y 為多酚得率，%；C2為多酚質量濃度，g/mL；V2為提取液的定容體積，mL；m 為山藥皮質量，g；N2為稀釋倍數。

2.4 單因素試驗

準確稱取1.0g 山藥皮粉末，采用超聲輔助提取黃酮、多酚，考察乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）和液固比[30∶10、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）]對山藥皮黃酮、多酚得率的影響。

2.5 正交試驗設計

分別以超聲時間（A）、乙醇濃度（B）及液固比（C）作為考察因素，以山藥皮中黃酮、多酚的得率為考察指標，優化提取工藝。正交試驗因素水平因素見表1。

表1 因素水平及編碼Table 1 Levels and codes of experimental factors

2.6 抗氧化能力測定

2.6.1 DPPH 自由基清除率測定

參考文獻[16]的方法并有所修改，2 mL 山藥皮粗提物溶液與2 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合均勻，37 ℃恒溫避光反應30 min，以VC作陽性對照，于517 nm 波長處測定吸光度，DPPH 自由基清除率計算公式如下。

式中：M 為DPPH 自由基清除率，%；A0為去離子水代替樣品測得的吸光度；A1為樣品溶液測得的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH 測得的吸光度。

2.6.2 還原力測定

參考文獻[17]的方法測定還原力。將山藥皮粗提物配成一系列濃度梯度溶液，取0.5 mL 樣品溶液，分別加入0.2 mol/L PBS 溶液0.5 mL、1 g/100 mL 鐵氰化鉀溶液0.5 mL，50 ℃反應20 min 后加10 g/100 mL的三氯乙酸溶液0.5 mL，4 500 r/min 離心10 min 后取1 mL 上清液，加入0.1 g/100 mL 的氯化鐵溶液0.2 mL，混勻后靜置10 min，以VC作為陽性對照，于700 nm 波長處測定吸光度，并以該吸光度表征還原力。

2.6.3 羥自由基清除率測定

參考文獻[18]并稍作修改，在試管中混合1 mL 不同濃度的粗提物溶液、1 mL 硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L）和1 mL 過氧化氫（6 mmol/L）。將混合物在室溫（25 ℃）下儲存10 min，并添加1 mL 水楊酸。輕輕搖動并保持30 min 后，在510 nm 處測定混合物的吸光度。羥自由基清除率計算公式如下。

式中：N 為羥自由基清除率，%；A0為對照組（無樣品）的吸光度；A1為試驗組（無水）的吸光度；A2為空白組（不含水楊酸）的吸光度。

2.6.4 總抗氧化能力測定

參照文獻[19]中總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）的測定方法，根據試劑盒的T-AOC比色法進行測定。以Fe2+濃度表示總抗氧化能力，以系列亞鐵離子濃度（mmol/100 g）為橫坐標，相應吸光度為縱坐標，作標準曲線，根據提取液的吸光度在標準曲線上相應的Fe2+濃度，即可得出該樣品的抗氧化能力。

2.7 數據處理

各試驗重復3 次，采用Excel 整理數據，IBM SPSS Statistics 22.0 軟件程序Duncan 檢驗法進行顯著性分析（P＜0.05），采用Origin 2021 軟件作圖。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 超聲時間對黃酮、多酚得率的影響

超聲時間對黃酮、多酚得率的影響見圖1。

圖1 超聲時間對黃酮、多酚得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the yield of flavonoids and polyphenols

由圖1 可知，在10～20 min 內，黃酮、多酚得率與超聲時間呈正相關關系，在20～40 min 時，隨著超聲的延長，山藥皮中黃酮、多酚得率逐漸減小，40～50 min 得率有所增加但低于20 min 的得率。這是因為在最初階段超聲處理時間延長時，超聲的空化效應促進了植物組織基質的溶脹、水合作用、破碎和孔隙形成，從而提高了山藥皮黃酮、多酚的得率[20]，因此選擇20 min 進行后續試驗。

3.1.2 乙醇濃度對黃酮、多酚得率的影響

乙醇濃度對黃酮、多酚得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對黃酮、多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids and polyphenols

由圖2 可知，乙醇濃度分別為70%和60%時，山藥皮中黃酮、多酚提取得率最佳，乙醇濃度是影響產量的最重要因素之一，乙醇濃度的增加會增加酚類化合物的產率，直至達到最大乙醇濃度，然后使產率下降，這種趨勢與Garcia-Castello 等[21]從柚子殘渣中提取黃酮所得結果相符。這種變化趨勢可能是由于溶劑的介電常數隨著乙醇濃度的增加而降低，從而導致酚類化合物的溶解度和擴散率增加，但是接近100%的乙醇濃度，即高純度乙醇溶劑會導致山藥皮中組織脫水以及蛋白質變性，從而導致產量降低。對于工業生產，溶劑濃度低可有效降低生產成本，此外山藥皮黃酮的含量高于多酚，所以選擇70%作為最優提取濃度。

3.1.3 液固比對黃酮、多酚得率的影響

液固比對黃酮、多酚得率的影響見圖3。

圖3 液固比對黃酮、多酚得率的影響Fig.3 Influence of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids and polyphenols

由圖3 可知，液固比30∶1～70∶1（mL/g）時，山藥皮中黃酮、多酚得率隨液固比的增加而增加，當液固比大于50∶1（mL/g）時，黃酮、多酚物質得率增速減慢。這可能是因為在低比例液固比下，山藥皮溶液的黏度較高，由于必須克服高黏度溶液中更強的內聚力，因此空化效應更困難。初始階段，隨著液固比增加，萃取介質的黏度和濃度降低，導致更大的空化效應，溶質的較高濃度差增加了溶質在溶劑中的擴散和溶解，從而增強了萃取過程，在高液固比下，施加在副產品基質上的超聲強度更高，導致更多的碎裂、侵蝕和孔隙形成效應，從而提高產量。當液固比增加到一定程度時候溶劑與溶質達到飽和，此后繼續增加乙醇添加量，也很難增加得率[22]。所以，試驗中選擇液固比50∶1（mL/g）進行后續試驗。

3.2 正交設計及結果

表2 和表3 分別為黃酮、多酚得率正交試驗結果。表4 和表5 分別為黃酮、多酚得率方差分析結果。

表2 黃酮得率正交試驗結果Table 2 Flavonoids yield of orthogonal test

表3 多酚得率正交試驗結果Table 3 Yield of polyphenols of orthogonal test

表4 黃酮得率方差分析Table 4 Variance analysis of flavonoids yield

表5 多酚得率方差分析Table 5 Variance analysis of polyphenols yield

由表2 和表4 可知：山藥皮中黃酮得率與超聲時間、乙醇濃度、液固比顯著相關（P＜0.05），相關程度依次為B＞A＞C，即乙醇濃度＞超聲時間＞液固比，優化的最佳提取條件為A3B1C3[提取時間30 min，乙醇濃度60%，液固比60∶1（mL/g）]。由表3 和表5 可知：山藥皮多酚得率與超聲處理時間和乙醇濃度顯著相關（P＜0.05），影響次序為B＞A＞C，即乙醇濃度＞超聲時間＞液固比，優化的最佳提取條件為A3B1C3[提取時間30 min，乙醇濃度60%，液固比60∶1（mL/g）]。此結果與正交試驗中最佳組合結果一致，此時黃酮得率為0.929%，多酚得率為0.519%。

3.3 抗氧化試驗結果

3.3.1 DPPH 自由基清除率試驗結果

VC和粗提物的DPPH 自由基清除率見圖4。

圖4 VC 和粗提物的DPPH 自由基清除率Fig.4 DPPH radical scavenging rate of VC and crude extract

當DPPH 自由基還原為1，1-二苯基-2-三硝基苯肼時，顏色由紫色變為黃色，導致與樣品提供氫/電子能力相關的吸收平衡的降低[23]。由圖4 可知，粗提物對DPPH 自由基清除率與樣品濃度呈現正相關的對應關系，在濃度為1.0 mg/mL 時達到最大值79.96%，其IC50值為0.158 mg/mL，大于VC的IC50值0.016 mg/mL，說明粗提物的DPPH 自由基清除率弱于VC。

3.3.2 還原力試驗結果

VC和粗提物的還原力見圖5。

圖5 VC 和粗提物的還原力Fig.5 Reducing power of VC and crude extract

抗氧化活性可通過使反應體系中Fe3+還原成Fe2+體現，在700 nm 處吸光度大小變化與還原能力的高低呈正相關[24]。由圖5 可看出，粗提物的還原力隨著濃度的增大顯著增強，但與陽性對照VC相比，各濃度下還原力均低于VC，濃度為1 mg/mL 的粗提物的還原力為0.70，而濃度為1 mg/mL 的VC的還原力可達到2.53。

3.3.3 羥自由基清除率試驗結果

VC和粗提物的羥自由基清除率見圖6。

圖6 VC 和粗提物的羥自由基清除率Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of VC and crude extract

由圖6 可以看出，粗提物對羥自由基有良好的清除效果。濃度范圍為0.2～0.6 mg/mL 時，粗提物羥自由基清除率顯著高于同等濃度下VC的羥自由基清除率，粗提物IC50值為0.083 mg/mL，小于VC的IC50值0.302 mg/mL，說明粗提物相比于VC有著更好的羥自由基清除率。

3.3.4 總抗氧化能力試驗結果

VC和粗提物的總抗氧化能力見圖7。

圖7 VC 和粗提物的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of VC and crude extract

在酸性條件下，樣品中的抗氧化物質還原Fe3+-TPTZ 產生Fe2+-TPTZ，呈現出明顯的藍色，于593 nm 處有最大的光吸收，在Fe3+-TPTZ 過量的情況下，測定藍色物質的生成量，即可獲得待測樣品的總抗氧化能力。由圖7 可看出，粗提物的總抗氧化能力在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內總抗氧化能力逐步上升，在1.0 mg/mL 時達到峰值為0.68 mmol/100 g，這與其還原力的測定結果相對應。但粗提物抗氧化能力不如VC，陽性對照VC在濃度為0.6 mg/mL 時達到峰值為2.27 mmol/100 g。

4 結論

通過對山藥皮中黃酮、多酚提取工藝的優化，以及山藥皮粗提物抗氧化活性測定試驗得出：在提取時間30 min、乙醇濃度60%、液固比60∶1（mL/g）時，山藥皮中黃酮、多酚得率最高，分別為0.929%和0.519%；在最優工藝下提取的乙醇粗提物的抗氧化性試驗結果表明，粗提物具有良好的DPPH 自由基清除作用（IC50值為0.158 mg/mL）和羥自由基清除作用（IC50值為0.083 mg/mL），具有一定的還原力和總抗氧化能力。因此，超聲輔助乙醇提取山藥皮中黃酮和多酚是一種高效、可行的方法，同時，山藥皮粗提物具有良好的抗氧化活性，為進一步探究山藥皮中的生物活性物質提供參考方法。