云南大葉種茶樹夏秋季鮮葉加工γ- 氨基丁酸白茶的工藝優化

肖艷琴，焦文文，3，劉琨毅，3，陳立佼，陳秋月，李若愚，王啟，羅慧，馬燕*，趙明*

（1.云南農業大學 茶學院，食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 云南省藥用植物生物學重點實驗室，西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心，云南 昆明 650201；3.宜賓職業技術學院 現代農業學院，五糧液技術與食品工程學院，四川 宜賓 644003）

我國夏秋茶產量高，但夏秋茶的茶多酚、咖啡堿含量較高[1]，滋味苦澀，香氣較低[1-2]，經濟效益較差，資源利用率偏低[3]；提高夏秋季茶鮮葉的利用率已經成為茶葉加工的重要課題。云南大葉種茶樹鮮葉的茶多酚含量較高，滋味更濃厚[4]，尤其是夏秋茶苦澀味重，品質不高[5]，云南大葉種茶樹夏秋茶鮮葉的加工利用，已成為限制云南茶葉產業發展的關鍵，亟待研究。目前已有報道應用施肥[6]、遮陰[7]降低鮮葉茶多酚含量，以及通過殺青、做青、揉捻、干燥等茶葉加工技術提高夏秋茶品質[8-9]。運用科學方法提高夏秋茶品質、挖掘夏秋茶市場、促進夏秋茶資源高效利用，是茶葉產業可持續發展的關鍵環節。

本文以云南勐海地區的夏秋季大葉種茶樹鮮葉為原料，通過爬坡試驗、響應面設計優化真空厭氧處理富集GABA 的工藝，加工GABA 白茶，以期開發一種富含GABA 且風味較好的白茶。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

GABA 白茶加工的鮮葉，于2019 年9 月，采摘于云南省勐海縣光芒山地區的勐海大葉種茶樹鮮葉，采摘標準為一芽二葉。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Sigma 公司；乙酸、氯仿、福林酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化亞錫、茚三酮、鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）、硼酸緩沖液、β-巰基乙醇（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；γ-氨基丁酸（GABA）標準品、天冬氨酸（aspartic acid，Asp）標準品、谷氨酸（glutamic acid，Glu）標準品、絲氨酸（serine，Ser）標準品、組氨酸（histidine，His）標準品、甘氨酸（glycine，Gly）標準品、蘇氨酸（threonine，Thr）標準品、精氨酸（arginine，Arg）標準品、丙氨酸（alanine，Ala）標準品、酪氨酸（tyrosine，Tyr）標準品、半胱氨酸（cysteine，Cys）標準品、甲硫氨酸（methionine，Met）標準品、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）標準品、異亮氨酸（isoleucine，Ile） 標準品、亮氨酸（leucine，Leu）標準品、賴氨酸（lysine，Lys）標準品、脯氨酸（proline，Pro）標準品（純度均≥98%）美國安捷倫公司；茶氨酸（thean）標準品（純度≥98%）：中國食品藥品檢定研究院；咖啡堿（caffeine，CA）標準品、兒茶素（catechin，C）標準品、表兒茶素（epicatechi，EC）標準品、表沒食子酸兒茶素（epigallocatechin，EGC）標準品、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）標準品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）標準品、沒食子酸（gallic acid，GA）標準品、1，4，6-O-沒食子酰基-食子酰基葡萄糖（gallate catechin，GG）標準品、鞣花酸（ellagic acid，EA）標準品、楊梅素（myricetin，My）標準品、槲皮素（quercetin，Qu）標準品、木犀草素（luteolin，Lu） 標準品、山奈酚（kaempferol，Kf）標準品（純度均≥98%）：成都曼思特生物有限公司。

1.3 儀器與設備

1200 型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；756CRT 紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；AR-1140 電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HTY-800g 茶樣粉碎機：永康市紅太陽機電有限公司；Smart-Q30 實驗室純水系統：上海和泰儀器有限公司；101A-2 型電熱鼓風恒溫干燥箱：上海市崇明實驗儀器廠；DZF-6050 型真空干燥箱：上海博迅實業有限公司；HH-S28S 型電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司；CT15RE 型低速離心機：科大創新股份有限公司中佳分公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 茶葉GABA 含量測定

應用OPA 在線柱前衍生的高效液相色譜-熒光檢測器（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）方法[27]，測定GABA 含量。

法律是維護社會秩序的重要途徑，沒有法律，國家權力的運行會受阻，國家的意志得不到實現。交通沒有規則，道路會受阻，出現交通事故。學校沒有規章制度無法正常運行。同樣一堂足球課，沒有良好的秩序，就無法達到良好的教學效果。在足球課堂教學中，上課場地空曠，組織教學比較困難，小學低年級尤其明顯，所以制定足球課堂教學規則是首要原則。教學是師生互相交往，共同參與的

1.4.2 GABA 富集工藝優化

參考段雙梅等[28]的方法，采用真空厭氧技術進行茶鮮葉GABA 富集。將鮮葉萎凋8 h 后，設計爬坡試驗，分別在不同厭氧處理溫度和時間（27 ℃/12 h、30 ℃/16 h、33 ℃/20 h、36 ℃/24 h）下處理萎凋茶葉，放入真空干燥箱中；對照未經厭氧處理，分別在不同溫度和時間下處理萎凋茶葉，放入電熱鼓風恒溫干燥箱中；處理結束后50 ℃烘干茶葉；測定GABA 含量，優化厭氧處理的時間和溫度。

利用Design Expert 8.0.6 軟件，基于爬坡試驗的結果，根據中心復合原理，以GABA 含量（Y）為響應值，厭氧處理溫度（A）和時間（B）為因子水平，中心點數為2 個，重復次數為2，進行響應曲面中心復合設計。按照試驗設計處理茶樹鮮葉，測定處理樣品的GABA 含量。應用F 檢驗對響應曲面設計的多元回歸方程及失擬顯著性進行分析，在響應曲面試驗結果的基礎上，采用兩因素一水平的響應面試驗設計，以厭氧處理時間、溫度為考察因素，以GABA 含量為指標進行曲面三維圖的繪制，分析得出最佳厭氧處理時間、溫度及GABA 含量的峰值。應用響應面設計獲得的最優GABA 富集條件（即最佳厭氧處理時間、溫度） 進行GABA 白茶加工，并測定其GABA 含量，與理論值比較，驗證響應面設計模型的準確性，進行2 次重復試驗。

1.4.3 感官審評

采用GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》。由5 名高級評茶員組成，年齡在20～40 歲、男生2 人和女生3 人，對茶樣的外形、湯色、香氣、滋味和葉底5 項因子進行評分；采用百分制評分，每5 分為一檔，2～3 分為半檔；5 項評分（0～100 分） 分別與評分系數25%、10%、25%、30%、10%相乘，并將各個乘積值相加，即為該茶樣感官審評的總分。

1.4.4 茶葉生化成分測定

以優化得到的條件加工GABA 白茶，以未經厭氧處理的茶樣為對照茶樣，測定樣品生化成分含量。采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中的直接干燥法、GB/T 8305—2013《茶水浸出物測定》中的全量法、GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》中的茚三酮比色法分別測定茶葉水分、水浸出物（water extraction，WE）、游離氨基酸（free amino acid，AA）含量，茶多酚（tea polyphenols，TP）含量參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》。應用高效液相色譜方法，分別測定兒茶素類、沒食子酸、咖啡堿、黃酮類的含量[29]，以及氨基酸組分含量[27]。

1.5 數據處理

每個試驗處理重復2 次，每個樣品重復提取測定2 次（響應面試驗除外），試驗數據用軟件IBM Spssstatistics 22 進行單因素方差分析，組間采用最小顯著差數法進行兩兩比較，p＜0.05 為差異顯著。采用GraphPad Prism 8 統計繪圖。

2 結果與分析

2.1 GABA 白茶工藝優化

2.1.1 爬坡試驗

設置處理時間和處理溫度梯度進行爬坡試驗處理鮮葉，烘干后測定樣品GABA 含量，結果見圖1。

圖1 不同溫度/時間處理茶樣GABA 含量Fig.1 Contents of GABA in tea samples treated with various temperatures/time

由圖1 可知，與對照相比，厭氧處理后GABA 含量增加，當處理溫度為33 ℃，處理時間20 h 時出現拐點，GABA 含量為（1.45±0.07）mg/g，因此選擇爬坡試驗厭氧溫度30～36 ℃、處理時間16～24 h 的工藝進行后續響應面試驗設計。

2.1.2 響應面試驗設計及結果

利用Design Expert 8.0.6 軟件，設計響應面試驗，厭氧處理后測定茶樣GABA 含量，結果見表1。

表1 響應面試驗設計及結果Table 1 Design and results of response surface test

以GABA 含量為因變量（Y），以處理溫度（A）、處理時間（B）為自變量。基于以上結果進行回歸分析，建立響應面回歸模型，得到GABA 含量的回歸方程：GABA含量（Y）=1.52+0.14A+0.01B+0.040AB-0.13A2-0.11B2。

數據運用Design-Expert 8.0.6 軟件進行方差分析，結果見表2。

表2 響應面設計模型的方差分析Table 2 Variance analysis of response surface design model

由表2 可知，模型極顯著（p<0.01），且失擬項不顯著（p>0.05），模型的決定系數R2=0.946 3。表明未知因素對試驗結果的干擾較小，該試驗模型能夠充分擬合試驗數據，證明GABA 含量的回歸方程是GABA 含量與各因素合適的數學模型，即可以利用此回歸方程確定GABA 白茶加工的最佳工藝[30]。根據F 值可知，處理溫度對GABA 含量的影響大于處理時間，處理溫度達到極顯著水平（p<0.01），處理溫度和處理時間的交互作用對GABA 含量的影響達到顯著水平（p<0.05）。

根據回歸方程得到兩個因子的響應面三維曲面圖和等高線圖，分別見圖2、圖3。

圖2 處理時間和處理溫度交互作用的響應面3D 圖Fig.2 3D graph of response surface about the interaction between processing time and processing temperature

圖3 處理時間和處理溫度交互作用的響應面等高線圖Fig.3 Response surface contour map about the interaction between processing time and processing temperature

圖2 中呈現出坡度較陡的曲面，圖3 等高線呈橢圓，表明各因素之間的交互作用較顯著，說明厭氧處理時間和溫度的交互作用顯著，對GABA 含量有較大影響。

通過響應面結果分析，得到GABA 白茶加工厭氧處理的最優條件為處理溫度34.72 ℃、處理時間20.62 h，公式計算得出GABA 含量的理論值為1.498 mg/g。根據實際情況調整工藝參數為處理溫度34 ℃、處理時間20 h。為了檢驗模型的準確性，進行3 次驗證試驗，測定得到GABA 含量為（1.52±0.05）mg/g，與預測值1.498 mg/g 相接近，說明該模型可以很好地預測厭氧處理條件與GABA 含量之間的關系。

2.2 GABA 白茶感官品質與生化成分

對加工得到的GABA 白茶和對照茶樣（經厭氧處理的白茶）進行感官審評，結果見圖4 和表3。

表3 GABA 白茶與對照感官審評結果Table 3 Sensory evaluation results of white tea rich in GABA and control group

圖4 GABA 白茶與對照的外觀和茶湯顏色Fig.4 Appearance and infusion colors of white tea rich in GABA and control group

由圖4 和表3 可知，GABA 白茶干茶色澤較紅，湯色橙黃明亮，滋味更加甜、醇厚、潤滑且無苦澀味，香氣為甜香帶果香；對照茶樣干茶色澤灰綠，湯色綠黃明亮，滋味平和、有青草味，香氣呈青草氣；厭氧處理后GABA 白茶感官評分為91.6±6.0，極顯著（p<0.01）高于對照茶樣85.0±6.0。

為了進一步研究加工茶葉的品質特征，測定了GABA白茶和對照茶樣的29 種茶葉特征成分，結果見圖5。

圖5 GABA 白茶與對照生化成分含量聚類熱圖Fig.5 Cluster heat maps of biochemical components in white tea rich in GABA and control group

由圖5 可知，經厭氧處理白茶的GABA 含量極顯著增加，達（1.53±0.06）mg/g，這與Liao 等[31]研究結果一致。且GABA 白茶水浸出物含量極顯著增加，達（580.70±0.35）mg/g，水浸出物是體現滋味醇厚品質特征的原因之一。茶多酚是主要澀味物質，兒茶素為茶多酚主要成分，其中酯型兒茶素具更強的苦澀味[32]。GABA 白茶比對照組茶葉中茶多酚含量極顯著低于對照（p<0.01）；在GABA 白茶中，兒茶素類中EGCG、ECG、C、EGC、GG、GC 等呈苦澀味的主要化合物含量極顯著低于對照茶樣（p<0.01），這與感官審評結果經厭氧處理GABA 白茶相比于對照組滋味苦澀味更低相符；GCG、GA 的含量較對照茶樣增加極顯著（p<0.01），CG、EC 的含量較對照茶樣有所增加，但不顯著。咖啡堿是茶湯中主要苦味物質，GABA 白茶中咖啡堿含量降低了1.23 mg/g，這與GABA 白茶滋味苦澀味更低表現一致。游離氨基酸是主要鮮爽味物質，GABA 白茶較對照茶樣的游離氨基酸含降低了12.00 mg/g。氨基酸組分含量表現各異；GABA 白茶中Phe、Ile、Thr、Leu、Cys、Met、Pro、Tyr 含量顯著高于對照（p<0.05），而Thean、Ala、Gly、Glu、His、Asp、Ser 的含量極顯著低于對照（p<0.01）。

3 討論

茶葉經過厭氧處理后，其生化成分也發生了明顯變化。本研究中，茶鮮葉經萎凋8 h，厭氧處理及干燥優化工藝制備GABA 白茶的GABA 含量得到了顯著提高，這與鄔齡盛等[24]、王芳[33]的γ-氨基丁酸白茶加工工藝研究結果一致。但本研究加工出的GABA 含量為1.52 mg/g，本研究的原料為夏秋茶鮮葉，氨基酸含量低是原因之一。測定結果顯示茶鮮葉經過厭氧處理后水浸出物含量增加，不同處理方式加工的白茶水浸出物含量存在一定差異，說明GABA 白茶茶湯中的呈味物質比較豐富，與茶湯厚薄、滋味濃厚程度密切相關[27]；茶多酚和游離氨基酸含量降低，這與王芳[33]、Teng 等[15]研究中GABA 白茶的茶多酚含量均下降的研究結果一致；測定結果還發現兒茶素、咖啡堿的含量降低，這是本文制備的GABA 白茶口感甜醇的物質基礎。

早期林智等[19]建立了25 ℃真空厭氧8 h 的綠茶加工工藝，Dai 等[34]、毛清黎等[35]、鄔齡盛等[24]、吳琴燕等[36]、沈強等[37]、王芳等[33]也運用厭氧處理加工得到GABA 綠茶、白茶，其中沈強等[37]還采用間歇厭氧的方式來提高GABA 含量。這些研究得到的厭氧時間大都是6～8 h，而本研究最終得到的最佳加工工藝為34 ℃厭氧處理20 h，厭氧處理的時間較長。較長時間的厭氧處理，不僅提高了茶樣GABA 含量，而且加工的白茶還具有湯色橙黃明亮、滋味甜醇的特征，一方面提高了GABA 含量，另一方面改善了夏秋茶的口感。

夏秋茶產量占我國總產量的60%以上[38]，其高效利用成為我國茶葉產業提質增效的關鍵。本研究發現通過厭氧處理可以降低夏秋茶茶多酚、咖啡堿含量，進而減少夏秋茶的苦澀味，為夏秋茶資源的高效利用提供了技術參考。今后，應當繼續研究，以期建立環保、低成本的技術，提高夏秋茶風味品質。

4 結論

本研究以云南大葉種夏秋季茶鮮葉為原料，優化建立了經34 ℃厭氧處理20 h 后50 ℃干燥加工GABA白茶的工藝。加工的GABA 白茶中GABA 含量超過1.5 mg/g，具有滋味甜醇、甜香帶果香的品質特征，為提高茶葉資源利用率提供了試驗依據。