茶條槭葉沒食子酸提取工藝優化及抗氧化活性

李姣，孫思全，張慶芬，楊逢建*

（1.東北林業大學 森林植物生態學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業大學 林業生物制劑教育部工程中心，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省林源活性物質生態利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；4.東北林業大學 化學化工與資源利用學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

茶條槭（Acer ginnala Maxim.）屬槭樹科槭樹屬落葉灌木或小喬木植物[1]，主要分布在我國華北、東北和西北等地區，多呈灌叢狀，適應性強，耐寒[2]。茶條槭葉形柔美，其嫩葉可食用，也可制成茶葉，具有清熱明目，生津止咳的功效，茶條槭在觀賞和藥用方面都具有重要價值[3]。茶條槭葉中含有多酚類、黃酮類、揮發油類化合物等化學物質[4-7]。其中，沒食子酸是茶條槭葉中的重要有效成分，是可水解單寧的組成部分，含量高達20%[8]，沒食子酸具有較強的抗氧化性以及抑菌、抗腫瘤、抗炎、降血糖等生物活性[9-13]，被廣泛應用于化工、醫藥和食品等領域中。

目前，沒食子酸的提取方法主要有酶法[14]、索氏提取法、酸水解法等[15]。酶法和索氏提取法提取效率較高，但存在耗時長的問題，酸水解法不僅耗時長，而且對設備腐蝕性較大。單寧酶是一種單寧酰基水解酶，對單寧類物質可進行專一且高效的水解[16]，超聲-微波協同提取法具有提取時間短、提取效率高等優點，是近幾年發展較快的提取方法之一[17]。目前，對于單寧酶耦聯超聲-微波協同提取茶條槭葉沒食子酸鮮見報道。本研究采用單寧酶耦聯超聲-微波協同提取茶條槭葉沒食子酸，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法對單寧酶耦聯超聲-微波協同提取茶條槭葉沒食子酸的提取工藝進行優化，并根據1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino -bis （3 -ethylbenzthiazoline -6 -sulfonic acid），ABTS）] 陽離子自由基清除試驗對茶條槭葉沒食子酸的抗氧化活性進行評價，以期為茶條槭葉中沒食子酸的深度開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶條槭葉采集于東北林業大學校園內。DPPH、ABTS、單寧酶（200 U/g）、沒食子酸標準品（純度＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸（vitamin，VC）：天津市東麗區天大化學試劑廠；無水乙醇（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH7.4，分析純）：上海博微生物科技有限公司；甲醇（色譜級）：湖北弗頓生化科技有限公司；乙腈（色譜級）：愛思開生物醫藥科技（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

超聲-微波協同萃取儀（CW-2000）：上海新拓分析儀器科技有限公司；醫用離心機（H1650）：長沙市湘儀離心機儀器有限公司；高效液相色譜儀（1260）：美國安捷倫公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9145A）：上海一恒科技儀器有限公司；FW100 型萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；旋渦混合器（M375-XH-）：東方化玻（北京） 科技有限公司；電子分析天平（AUW220）：浙江賽德儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備及沒食子酸得率測定

將同一批次茶條槭葉置于50 ℃鼓風干燥箱內干燥24 h，粉碎過80 目篩備用。稱量0.5 g 茶條槭葉粉末，倒入50 mL 離心管中，按一定的料液比加入pH7的60%乙醇溶液，隨后加入一定量的單寧酶，在旋渦混合器充分混合后，立即轉移到超聲-微波萃取儀中，提取溫度為60 ℃，在不同提取時間、不同微波功率（超聲功率為50 W）的條件下，制備后8 000 r/min 離心10 min，取2 mL 上清液過0.22 μm 有機濾膜，即為供試品溶液。

將供試品溶液測得峰面積代入標準曲線中，得到樣品質量濃度，從而計算出茶條槭葉片中沒食子酸得率，其計算公式如下。

式中：Y 為沒食子酸得率，%；C 為單位體積提取液中沒食子酸的質量濃度，mg/mL；V 為提取液總體積，mL；M 為茶條槭葉粉末的質量，mg。

1.3.2 液相色譜條件的建立

Diamonsil-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），沒食子酸檢測條件為流動相A：乙腈，流動相B：0.1%磷酸水溶液，檢測波長260 nm，柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.3 標準曲線的建立

稱取10mg 沒食子酸標準品，用甲醇配制為1 mg/mL的沒食子酸標準品貯備溶液，并逐級稀釋為0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 mg/mL 標準品溶液，分別進樣10 μL 測定其峰面積值。以質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，沒食子酸的回歸方程為y=5 638.7x-6 121.3（R2=0.999 0），線性范圍為0.062 5～1.000 0 mg/mL。

1.3.4 單因素試驗

稱取干燥茶條槭葉粉末0.5 g，以60%乙醇為提取溶劑，采用單寧酶耦聯超聲-微波協同提取法提取沒食子酸。固定提取條件：提取時間20 min、提取溫度50 ℃、微波功率400 W、pH5、料液比1∶60（g/mL）、單寧酶添加量為（樣品質量的）3%；分別對單寧酶添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、料液比[1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1 ∶80（g/mL）]、pH 值（3、4、5、6、7、8）、微波功率（100、200、300、400、500 、600 W）、提取時間（5、10、20、30、40、50 min）、提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）6 個因素進行單因素試驗，考察各因素對茶條槭葉沒食子酸得率的影響。

1.3.5 響應面法優化提取工藝

以單因素試驗結果為基礎，選取對沒食子酸得率影響較高的4 個因素（單寧酶添加量、料液比、提取時間、微波功率）作為自變量，采用四因素三水平設計Box-Beheken Design 試驗，試驗因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.3.6 提取方法的比較

索氏提取法：參考王彥清等[18]的提取方法，稱取茶條槭葉粉末5.0 g，置索氏提取器中，提取溶劑為95%乙酸溶液，液料比20∶1（mL/g），提取時間4 h，10 000 r/min離心10 min 后取上清液即為待測溶液。

酸水解法：參考邱亮[8]的提取方法，稱取茶條槭粉末1.0 g，按1∶40（g/mL）的料液比，加入濃度為4 mol/L HCl，在80 ℃水浴中加熱水解4 h，10 000 r/min 離心10 min 后取上清液即為待測液。

1.3.7 沒食子酸的純化

參照王廣娟[19]的方法對D301 陰離子交換樹脂進行預處理，使用上樣流速為1 mL/min，洗脫速度為1 mL/min，洗脫溶劑為5%鹽酸-70%乙醇的條件經過D301 樹脂對茶條槭葉沒食子酸提取液進行純化。將結晶樣品進行真空干燥，得到沒食子酸純化物。

1.3.8 沒食子酸的DPPH 自由基清除能力測定

參考文獻[20]的方法并稍加調整。分別配制不同濃度梯度的沒食子酸溶液和VC溶液。取3 mL DPPH溶液和3 mL 體積分數95%的乙醇溶液，置于a 試管中，取3 mL DPPH 溶液和3 mL 不同質量濃度的沒食子酸溶液，置于b 試管中，取3 mL 不同質量濃度的沒食子酸溶液和3 mL 體積分數95%乙醇溶液，置于c 試管中，搖勻，避光條件下靜置30 min，VC溶液同樣按照上述方法操作。用體積分數95%乙醇調零，在517 nm處測量各樣品吸光度。樣品對DPPH 自由基清除率（E1，%）按下列公式計算。

式中：Aa為a 試管中樣品的吸光度；Ab為b 試管中樣品的吸光度；Ac為c 試管中樣品的吸光度。

1.3.9 沒食子酸的ABTS+清除能力測定

參考文獻[21]的方法并稍加調整，分別配制7.4 mmol/L ABTS 溶液和2.6 mmol/L 過硫酸鉀溶液，按1∶1 的體積比混合在暗黑室溫下反應12 h。再用磷酸鹽緩沖液稀釋40～50 倍，得到ABTS+工作液。分別配制5 組不同濃度的沒食子酸溶液和VC溶液。取0.2 mL甲醇溶液和0.8 mL ABTS+工作液，放置在試管1 中，取0.2 mL 樣品溶液與0.8 mL ABTS+工作液放置在試管2 中，取0.2 mL 樣品溶液與0.8 mL 的甲醇溶液放置在3 試管中，室溫下避光靜置30 min 后，在734 nm 處測量各樣品吸光度。樣品的ABTS+自由基清除率（E2，%）按下列公式計算。

式中：A1為試管1 中混合液的吸光度；A2為試管2 中混合液的吸光度；A3為試管3 中混合液的吸光度。

1.4 數據統計與處理

每組試驗平均重復3 次，數據的統計與處理使用Origin 2018 和Design-Expert 8.0.6。

2 結果與分析

2.1 標準品及樣品色譜結果

標準品及樣品色譜圖如圖1 所示。

圖1 標準品和樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of the standard and the sample

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 pH 值對茶條槭葉沒食子酸得率的影響

pH 值對茶條槭葉沒食子酸得率的影響見圖2。

圖2 不同pH 值對沒食子酸得率的影響Fig.2 Effect of different pH values on the yield of gallic acid

由圖2 可知，當pH 值從3 增加到7 時，沒食子酸得率隨著pH 值的升高而升高，但在pH 值達到4 后，升高趨勢變緩；在pH 值達到7 時，沒食子酸得率最高，為20.62%，隨后沒食子酸得率開始緩慢下降。這是由于酶的活性具有最適pH 值，當達到最佳條件時，酶的活性最高，導致反應速率增加。當超出最適pH 值時，會導致酶活力降低，使酶發生變性，導致反應速率降低[22]。因此，選擇溶液pH 值確定為7。

2.2.2 單寧酶添加量對茶條槭葉沒食子酸得率的影響

單寧酶添加量對茶條槭葉沒食子酸得率的影響見圖3。

圖3 不同單寧酶添加量對沒食子酸得率的影響Fig.3 Effect of different tannase addition amounts on the yield of gallic acid

由圖3 可知，當單寧酶添加量從1%增加到5%時，沒食子酸得率隨著單寧酶添加量的增加而升高，當單寧酶添加量為4%時，沒食子酸得率為21.11%，但在單寧酶添加量超過4%后，沒食子酸得率增加變慢。這是因為適量的單寧酶與底物反應較充分，減少或增加單寧酶濃度，均會抑制反應速率[23]。因此，選擇3%～5%的單寧酶添加量進行后續優化試驗。

2.2.3 料液比對茶條槭葉沒食子酸得率的影響

料液比對茶條槭葉沒食子酸得率的影響見圖4。

圖4 不同料液比對沒食子酸得率的影響Fig.4 Effect of different solid-to-liquid ratios on the yield of gallic acid

由圖4 可知，當料液比為1∶30～1∶60（g/mL）時，沒食子酸得率隨著溶劑添加量的增加而升高，當料液比為1∶60（g/mL）時，沒食子酸得率為21.69%。但料液比達到1∶60（g/mL）后，沒食子酸得率開始呈現降低趨勢。這可能是因為溶劑添加量較少使得提取溶劑不能完全浸潤樣品，沒食子酸沒有充分提取出來，使得其得率降低。隨著溶劑添加量的增加，樣品與提取溶劑的接觸面積增大，可能將沒食子酸完全充分提取出來。但是，當溶劑添加量進一步增大時，溶質已全部溶出，反而引入更多的雜質，導致沒食子酸的得率降低[24]。因此，選擇1∶50～1∶70（g/mL）的料液比進行后續優化試驗。

2.2.4 微波功率對茶條槭沒食子酸得率的影響

微波功率對茶條槭葉沒食子酸得率的影響見圖5。

圖5 微波功率對沒食子酸得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on the yield of gallic acid

由圖5 可知，當微波功率從100W 增加到500W 時，沒食子酸得率隨著微波功率的升高而升高，微波功率為500 W 時，沒食子酸得率為18.62%，達到最高，但微波功率斷續增大時，沒食子酸得率呈下降趨勢。其原因是隨著微波功率繼續增大，溶質吸收微波的能力逐漸增強[25]，使得大部分雜質溶出，影響了提取物質的溶解度，導致得率下降。因此，選擇400～600 W 的微波功率進行后續優化試驗。

2.2.5 提取時間對茶條槭葉沒食子酸得率的影響

提取時間對茶條槭葉沒食子酸得率的影響見圖6。

圖6 提取時間對沒食子酸得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the yield of gallic acid

由圖6 可知，提取時間從5 min 增加40 min 時，沒食子酸得率隨著提取時間的延長而升高，提取時間為40 min 時，沒食子酸得率為20.36%，達到最高。但在提取時間超過40 min 后，沒食子酸得率呈下降趨勢。其原因是隨著提取時間的延長，沒食子酸大多已析出到溶液中，繼續延長提取時間可能會導致其他雜質溶出，使沒食子酸含量降低[26]。因此，選取30～50 min 提取時間進行后續優化試驗。

2.2.6 提取溫度對茶條槭葉沒食子酸得率的影響

提取溫度對茶條槭葉沒食子酸得率的影響見圖7。

圖7 不同提取溫度對沒食子酸得率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on the yield of gallic acid

由圖7 可知，提取溫度從30 ℃增加到60 ℃時，沒食子酸得率隨著提取溫度的增加而升高，當提取溫度為60 ℃時，沒食子酸得率為16.64%，達到最高。但提取溫度達到60 ℃后，沒食子酸得率下降趨勢較明顯。其原因是在一定范圍內，適當提高提取溫度，有利于沒食子酸的析出，同時能夠促進酶解作用，隨著提取溫度繼續升高，沒食子酸發生降解，同時單寧酶超出其溫度的耐受范圍而變性失活，使反應受到抑制[27]，導致沒食子酸得率降低。因此，確定提取溫度為60 ℃。

2.3 響應面優化試驗結果

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗

中心組合優化試驗結果見表3。

表3 中心組合優化試驗結果Table 3 Optimized results of central composite experiment

采用單寧酶耦聯超聲-微波協同提取法從茶條槭葉中提取沒食子酸，在單因素試驗基礎上，以提取時間（A）、單寧酶添加量（B）、料液比（C）、微波功率（D）為自變量，沒食子酸提取率（Y）為響應值，設計四因素三水平試驗，測定每組試驗的沒食子酸得率。利用軟件Design-Expert 8.0.6 對表3 數據進行擬合，得到二次多項式回歸方程：Y=26.50＋0.088A＋0.43B＋0.28C＋0.48D -0.068AB ＋0.058AC -0.65AD ＋0.13BC ＋0.33BD －0.16CD－0.73A2－0.78B2－0.89C2－1.44D2。

響應面擬合回歸方程的方差分析結果見表4。

表4 響應面擬合回歸方程的方差分析結果Table 4 Results of variance analysis of response surface fitting regression equation

由表4 方差分析結果可知，該模型F=21.63，P＜0.01，說明該試驗優化模型差異極顯著，在統計學上有意義，而且失擬項F=1.92，P=0.277 5＞0.05 ，表明差異不顯著，無失擬因素存在，該模型擬合度良好，可對試驗結果進行分析。該試驗設計表明，提取時間（A）對沒食子酸得率沒有顯著性影響，單寧酶添加量（B）、料液比（C）以及微波功率（D）對沒食子酸得率影響極顯著（P＜0.01），且由F 值大小可知，C＜B＜D ，說明微波功率（D）對沒食子酸得率影響最大。在組合因素中，AD 的交互作用對沒食子酸得率影響極顯著（P＜0.01），BD 的交互作用對沒食子酸得率影響顯著（P＜0.05），其余各因素的交互作用對沒食子酸得率的影響不顯著。

2.3.2 響應面優化試驗結果

各因素交互作用的響應面見圖8。

圖8 各因素交互作用的響應面Fig.8 Response surface diagram of interaction of various factors

由圖8 可知，坡度越陡表明相互作用越明顯。由圖8a 和圖8b 分析可直觀地看出，響應面坡度較陡，等高線為橢圓形，說明A、D 和B、D 之間交互作用表現為影響顯著。

對圖8c～8f 分析可知，響應面坡度較平緩，等高線接近圓形，說明AB、AC、CD 以及BC 之間交互作用均表現為影響不顯著。這與表4 方差分析結果相一致。

2.3.3 最佳提取條件的確定及驗證試驗

通過綜合回歸模型的統計分析可知，沒食子酸的最佳提取工藝參數為提取時間39.60 min、單寧酶添加量4.33%、料液比1∶61.64（g/mL）、微波功率520.48 W，此條件下沒食子酸理論提取得率為26.64%。考慮到實際操作的可行性，將工藝參數調整為提取時間40 min、單寧酶添加量4.3%、料液比1∶60（g/mL）、微波功率520 W。利用上述最優條件進行重復性試驗，得到沒食子酸的得率為（26.25±0.41）%，與理論預測值吻合度較高，表明優化后的條件切實可行。因此，該模型準確、可靠，可用于茶條槭葉沒食子酸的優化提取。

2.3.4 與其他提取工藝比較

不同提取方法對茶條槭葉沒食子酸得率的對比結果見表5。

由表5 可知，本研究將單寧酶耦聯超聲-微波協同提取法與酸水解法和索氏提取法進行了比較，單寧酶耦聯超聲-微波協同提取法對茶條槭葉中沒食子酸的得率均高于酸水解法和索氏提取法，且耗時短，說明單寧酶耦聯超聲微波協同提取法能有效提高沒食子酸得率。

2.3.5 沒食子酸純化結果

沒食子酸粗提液經樹脂純化后再旋轉蒸發除去洗脫溶劑然后冷凍干燥制得固體粉末。經高效液相色譜儀測定沒食子酸的純度可達90%以上。

2.4 沒食子酸抗氧化能力測定

2.4.1 DPPH 自由基的清除能力

茶條槭葉沒食子酸和VC對DPPH 自由基的清除能力見圖9。

圖9 沒食子酸對DPPH 自由基清除率的影響Fig.9 Effect of gallic acid on DPPH free radical scavenging rate

由圖9 可知，隨著質量濃度的增加，沒食子酸和VC對DPPH 自由基清除率均為先升高后穩定的趨勢，在質量濃度5～30 μg/mL 時，沒食子酸和VC清除DPPH自由基清除能力均顯著升高，在30 μg/mL 后，隨著濃度的增加，兩者清除率變化均不明顯。當質量濃度為50 μg/mL 時，沒食子酸對DPPH 自由基的清除率為87.3%，高于VC對DPPH 自由基清除率為83.6%。結果表明，沒食子酸對DPPH 自由基有較強的清除作用。

2.4.2 ABTS+自由基的清除能力

茶條槭葉沒食子酸和VC對ABTS+自由基的清除率見圖10。

圖10 沒食子酸對ABTS+自由基清除率的影響Fig.10 Effect of gallic acid on ABTS+ free radical scavenging rate

由圖10 可知，隨著質量濃度的增加，沒食子酸和VC對ABTS+自由基清除率均表現為先升高后穩定的趨勢，在質量濃度5～30 μg/mL 時，沒食子酸和VC清除ABTS+自由基能力均顯著升高，在質量濃度達到30 μg/mL后，兩者清除ABTS+自由基能力均趨于穩定，此時，沒食子酸對ABTS+自由基的清除率為92.13%，高于VC對ABTS+自由基的清除率89.16%。結果表明，沒食子酸具有較好的抗氧化性。

3 結論

本研究采用單寧酶耦聯超聲-微波協同提取法，以茶條槭葉為研究材料，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法進行優化分析，最終確定的最佳工藝參數：提取時間40 min、單寧酶添加量4.3%、料液比1∶60（g/mL）、微波功率520 W、pH 值為7，提取溫度60 ℃。此條件下進行重復試驗，沒食子酸得率為（26.25±0.41）%。與模型的預測值26.64%相近。單寧酶耦聯超聲-微波協同法顯著提高了沒食子酸的得率，并且具有消耗時間短，效率高，操作簡單等優勢。通過DPPH 自由基以及ABTS+自由基清除試驗，比較沒食子酸和VC的抗氧化活性，發現沒食子酸的抗氧化性均高于VC。試驗結果證明，單寧酶耦聯超聲－微波協同提取法能夠提高沒食子酸得率，且沒食子酸具有較強的抗氧化性，為茶條槭葉中沒食子酸的高效提取和深度開發利用提供參考。