美藤果粕多肽的提取工藝優化

賴玉萍，林錦銘，安苗青，陳穎儀，杜冰，黎攀

（華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642）

美藤果（Plukenetia volubilis Linneo） 又名南美油藤、星油藤、印加花生、印奇果，屬大戟科多年生木質含油攀援植物，原產于南美洲安第斯山脈的熱帶雨林地區，長期作為傳統食物被土著居民群體以煮熟和烘烤的形式食用[1]。我國云南普洱、西雙版納等地在2006年開始引進種植美藤果，種植規模現已達3 300 多公頃[2-3]。美藤果仁中含有豐富的營養成分，其中含油量30%～60%，蛋白質含量26%～33%，碳水化合物含量12.1%～13.4%，可制得美藤果油和高蛋白食品[4-8]。美藤果粕則是美藤果種仁低溫壓榨提油后的副產物，其富含亮氨酸、色氨酸、纈氨酸等人體必需氨基酸，營養價值高，但這些蛋白質資源目前多數用于動物飼料加工、肥料加工或者被直接廢棄，沒有得到有效利用，造成了嚴重浪費[3，9-10]。

許多研究表明，植物加工的副產物是重要的蛋白來源，但因一些動物源性的蛋白來源易攜帶病毒或致敏物質，所以植物源性的副產品蛋白來源更有望成為增值成分，添加到食品中[11]。在蛋白提取方法中，酶輔助提取法更受青睞。這是因為在酶輔助提取過程中，其提取的條件較溫和、操作較簡單[12]。其次，在副產物中蛋白質常與淀粉、纖維素、果膠以及細胞中的脂質共存，而酶輔助提取有利于蛋白質以可溶性形式從內部細胞區室釋放出來，提高蛋白質的提取率[11]。此外，該法還可提取因酸/堿水解而被破壞的氨基酸，如谷氨酰胺和天冬酰胺等[13]。有研究發現，采用堿性-中性蛋白酶復合提取的美藤果蛋白水解物具有良好的體外抗氧化和抗高血壓特性[14]。但從美藤果粕中提取多肽鮮有研究。因此，本文以美藤果粕為主要原料，采用高溫蒸煮結合酶解法優化美藤果粕多肽提取工藝，并對最佳工藝參數下制備的美藤果粕多肽進行氨基酸組成和分子量分析，豐富對美藤果粕多肽的認識，為美藤果粕多肽的酶法制備和應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

美藤果粕：普洱聯眾生物資源開發有限公司；堿性蛋白酶（1 600 AU/g）、中性蛋白酶（1 600 AU/g）：廣州柏棠貿易有限公司；甲醛（分析純）：廣州化學試劑廠；茚三酮（分析純）：濟寧宏明化學試劑有限公司；檸檬酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（分析純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈（色譜純）：德國默克集團。

1.1.2 儀器與設備

恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：鄭州長城科工貿有限公司；旋轉蒸發儀（RE-5298）、循環真空水泵（SHZ-Ⅲ）：上海亞榮生化儀器廠；數顯恒溫水浴鍋（HH-8）：金壇市富華儀器有限公司；低速離心機（ANKE TDL-5-A）：上海安亭科學儀器有限公司；微量紫外分光光度計（Nano Drop）、高效液相色譜儀（LC-20AT）：日本島津公司；全自動凱氏定氮儀（SDK-1000）：上海沛歐分析儀器有限公司；紫外分光光度計（UV759）：上海精密科學儀器有限公司；全自動氨基酸測定儀（A300）：德國曼默博爾公司；冷凍干燥機（ALPHA 2-4 LDplus）：德國CHRIST 公司；低溫高速離心機（Microfuge 22R）：美國Beckman Coulter 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 美藤果粕多肽的制備

稱取20.0 g 美藤果粕，按液料比20∶1（mL/g）于95 ℃水浴鍋蒸煮6 h，冷卻后加入0.75%堿性蛋白酶和0.25%中性蛋白酶，并將pH 值調至8.5 后，置于恒溫加熱磁力攪拌器中55 ℃酶解6 h，95 ℃高溫滅酶15 min，冷卻后于離心機4 000 r/min 離心15 min ，取上清液并在55 ℃下真空濃縮，最后經真空冷凍干燥，即得美藤果粕多肽。

1.2.2 高溫蒸煮結合酶法制備美藤果多肽工藝優化

1.2.2.1 單因素試驗

稱取20.0 g 美藤果粕，以液料比15∶1（mL/g）、蒸煮時間9 h、酶添加量1.5%、酶解溫度50 ℃和酶解時間6 h 為基準條件，固定其他因素和對應水平條件，以水解度（degree of hydrolysis，DH）為指標，分別考察不同液料比[5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）]、蒸煮時間（3、6、9、12、15 h）、酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，堿性蛋白酶與中性蛋白酶體積比為3∶1）、酶解時間（2、4、6、8、10 h）和酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）對美藤果粕多肽水解度的影響。

1.2.2.2 響應面優化

在單因素結果基礎上，采用響應面試驗優化制備工藝，響應面法試驗因素與水平編碼見表1。

表1 響應面優化因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface optimization

1.2.2.3 多肽水解度的測定

參考賈靖霖等[15]的方法，略作修改。吸取10 mL 水解液用容量瓶定容至50 mL，吸取定容后的樣液5 mL于燒杯中，加入75 mL 蒸餾水，置于磁力攪拌器不斷攪拌，用NaOH 溶液先將其pH 值調至8.2，然后加入10 mL甲醛溶液混勻，再用0.025 mol/L 的NaOH 溶液將pH 值滴定至9.2，記此時消耗的NaOH 溶液體積為V1。空白對照組則直接吸取80 mL 蒸餾水，其余按上述步驟操作，記此時消耗的NaOH 溶液體積為V2。水解度（D，%）計算公式如下。

式中：hNH2為水解后氨基態氮濃度，mmol/g；V1為樣品組消耗NaOH 溶液體積，mL；V2為空白對照組消耗NaOH 溶液體積，mL；c 為NaOH 溶液實際摩爾濃度，mol/mL；V 為待測樣液體積，mL；m 為樣品蛋白質質量，g。

式中：Mt為肽鍵毫摩爾數，mmol；ma為氨基酸含量，g；Mr為氨基酸相對分子質量，g/mmol；MT為總肽鍵毫摩爾數，mmol；Mp為蛋白質含量，g；h0為水解前氨基態氮濃度，mmol/g；htot為底物中肽鍵濃度，mmol/g。

1.2.3 多肽氨基酸組成分析

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》中方法，略作修改。將多肽酸水解成游離氨基酸，經全自動氨基酸測定儀分離后與茚三酮溶液反應，再經比色法測定氨基酸含量。精確稱取20～30 mg 美藤果粕多肽，加入10 mL 6 mol/L 的鹽酸并通氮氣，持續2 min，然后在110 ℃下水解22 h。放置常溫后過濾，取1 mL 于60 ℃水浴烘干，再加入1 mL 蒸餾水繼續烘干，重復兩次后于4 ℃冰箱保存待測。測定時加入4 mL 上機溶劑充分溶解樣品，用0.22 μm 濾膜過濾后，取其中1.5 mL 與1 mL 上機溶劑混勻后即可測定。流動相：檸檬酸鈉A（0.12 mol/L，pH3.45）；B（0.2 mol/L，pH10.85），色譜柱型號為LCA K06/Na，洗脫泵流速設定為0.45 mL/min，衍生泵流速為0.25 mL/min，進樣體積50 μL，采集570 nm 和440 nm 兩個波長下的信號，準確定量樣品氨基酸。

1.2.4 多肽分子量測定

參考GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中描述的方法，稍作改動。利用高效凝膠過濾色譜法進行測定，以標準品重均分子量為縱坐標，相對保留體積為橫坐標，繪制標準曲線和回歸方程，根據標準曲線y=-0.473 9x+6.966 1，R2=0.998，計算樣品相應的分子量。準確稱取20 mg 多肽樣品于10 mL 容量瓶，用流動相（乙腈∶水∶三氟乙酸體積比為45∶55∶0.1）定容至刻度，充分溶解后，用0.22 μm 濾膜過濾后即可上樣，進樣體積10 μL，洗脫泵流速設定為0.5 mL/min，色譜柱型號為TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，檢測波長為220 nm。

1.3 數據處理

每組試驗均為3 組平行，用Design-Expert 10.0.7進行響應面試驗設計，數據結果采用Origin 9.1、Excel 2016 和GrapPad Primsm 8 等軟件進行數據統計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 高溫蒸煮結合酶法制備美藤果粕多肽工藝優化

2.1.1 液料比對美藤果粕多肽水解度的影響

液料比對美藤果粕多肽水解度的影響如圖1 所示。

圖1 液料比對美藤果粕多肽水解度的影響Fig.1 Effect of feed-to-liquid ratio on the degree of hydrolysis of Plukenetia volubilis Linneo meal peptides

由圖1 可知，多肽水解度隨溶劑體積的增大而增大，液料比為5∶1～10∶1（mL/g）時，多肽水解度提高了7%，增速最快。隨著溶劑體積的繼續增加，多肽水解度上升幅度減緩。因為液料比5∶1（mL/g）時，溶液整體較為黏稠，分子擴散速率較低，導致在體系中分散不均勻，美藤果粕蛋白酶切位點與酶的反應不充分，且溶液少，蛋白質易達到飽和狀態，不能完全溶解，因此多肽的水解度較低[16]。繼續增大溶劑體積，多肽水解度的增幅變小，可能是底物濃度過低，降低了底物與酶的碰撞概率，酶解反應速度降低[17]。因此，基于成本和生產效率的考慮，液料比選擇15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）進行后續響應面優化試驗。

2.1.2 蒸煮時間對美藤果粕多肽水解度的影響

蒸煮時間對美藤果粕多肽水解度的影響如圖2所示。

圖2 蒸煮時間對美藤果粕多肽水解度的影響Fig.2 Effect of steaming time on the degree of hydrolysis of Plukenetia volubilis Linneo meal peptides

由圖2 可知，隨著蒸煮時間的延長，多肽水解度逐漸上升。蒸煮時間為6 h 時，美藤果粕蛋白已充分受熱變性，暴露出酶切位點，并有利于后續酶解。當蒸煮時間超過6 h 后，多肽水解度趨于穩定。蒸煮會使美藤果粕蛋白發生蛋白質結構變化，天然的三級結構打開，從而暴露出內部的基團，這樣有利于后續酶解[18]。綜合成本考慮，選擇蒸煮時間為6 h。

2.1.3 酶添加量對美藤果粕多肽水解度的影響

酶添加量對美藤果粕多肽水解度的影響如圖3所示。

圖3 酶添加量對美藤果粕多肽水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on the degree of hydrolysis of Plukenetia volubilis Linneo meal peptides

由圖3 可知，酶添加量為0.5%～1.5%時，水解度從18%升高到29%，水解度快速升高，而繼續增加酶添加量，多肽的水解度上升幅度減緩，最終趨于平緩。堿性蛋白酶和中性蛋白酶均為催化劑，具有不同的酶切位點，而酶添加量增加可提升多肽酶解速率，但酶解底物質量一定，酶切位點是固定的，酶添加量超過一定限度酶的作用達到飽和時，過多的酶不能繼續與酶切位點結合，無法提高水解度和水解效率[19]。此外，當酶添加量過高時，可能導致可溶性多肽過度水解，即進一步水解為游離氨基酸；或在有限底物中增加酶添加量導致大分子之間的位阻效應形成了空間障礙抑制了酶促反應的進行[20-21]。綜上所述，選擇酶添加量為0.5%、1.0%、1.5%進行后續響應面優化試驗。

2.1.4 酶解時間對美藤果粕多肽水解度的影響

酶解時間對美藤果粕多肽水解度的影響如圖4所示。

圖4 酶解時間對美藤果粕多肽水解度的影響Fig.4 Effect of enzymatic digestion time on the degree of hydrolysis of Plukenetia volubilis Linneo meal peptides

由圖4 可知，隨著酶解時間延長，水解度逐漸升高。酶解時間為2～6 h 時，水解度從21%升高到30%，其變化速率較快，而繼續延長酶解時間，多肽水解度上升幅度減緩。由此表明在酶解6 h 時，酶解已較為充分。當酶解時間繼續延長，酶解產物和未酶解蛋白會競爭酶的作用位點，產生競爭性抑制，抑制酶解反應的進行[22-23]。因此，確定酶解時間為6 h。

2.1.5 酶解溫度對美藤果粕多肽水解度的影響

酶解溫度對美藤果粕多肽水解度的影響如圖5所示。

圖5 酶解溫度對美藤果粕多肽水解度的影響Fig.5 Effect of enzymatic digestion temperature on the degree of hydrolysis of Plukenetia volubilis Linneo meal peptides

由圖5 可知，酶解溫度對多肽水解度的影響較為明顯，隨著酶解溫度升高，水解度呈現先升高后降低的趨勢。酶解溫度為40～55 ℃時，水解度從18%升高到31%，差異顯著；而酶解溫度為60 ℃時，水解度有所降低。原因是溫度升高有利于加快體系內分子的擴散運動，而酶有其最佳酶解溫度，溫度過高和過低都不利于酶解反應。溫度從40 ℃逐漸升高到55 ℃，逐漸接近復合酶酶解的最適溫度，水解度顯著升高，而當溫度超過55 ℃時，酶活性受到抑制，酶的二級結構或三級結構遭到破壞，失去活性，不能再作為催化劑以催化反應[24]。因此，選擇酶解溫度50、55、60 ℃進行后續響應面優化試驗。

2.2 響應面試驗分析

2.2.1 響應面試驗結果

根據單因素試驗結果，以水解度為響應值，利用軟件Design-Expert 10.0.7 進行三因素三水平響應面設計分析，試驗設計和結果如表2 所示。

表2 響應面優化試驗方案及結果Table 2 Experimental scheme and results of response surface optimization

根據試驗結果進行多元擬合回歸分析，得到三元二次多項回歸方程，模型如下。

Y =32.63 +0.23A +0.14B +1.49C -0.41AB +0.48AC -0.098BC-4.68A2-1.08B2-2.64C2

2.2.2 響應面回歸模型方差分析

通過Design-Expert 10.0.7 軟件進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

由表3 可知，模型F=26.46，P＜0.001 表明該回歸模型具有統計學意義，可以用該模型分析預測美藤果粕多肽提取方法的結果。失擬項F=4.66，P=0.085 7＞0.05，表示失擬項不顯著。相關決定系數R2=0.971 4，表明該模型與試驗擬合較好，可解釋97.14%的響應值變化。酶添加量（C）對多肽水解度有極顯著影響（P＜0.01）；酶解溫度（A）、液料比（B）對多肽水解度影響不顯著，且三者對多肽水解度影響大小為C>A>B。

2.2.3 響應曲面及等高線分析

根據回歸方程繪制各因子交互作用的響應面，所擬合的三維效應圖形狀能反映因素交互作用對響應值的影響程度，對應的曲線坡度越大、呈橢圓狀，且等高線越密集，說明該因素的改變對水解度的影響越大[25]。各因素交互作用響應面圖及等高線圖見圖6～圖8。

圖6 酶解溫度和液料比交互作用對水解度的影響Fig.6 Effect of the interaction between enzymolysis temperature and liquid-solid ratio on the degree of hydrolysis

由圖6 可知，酶解溫度為50～60 ℃，液料比為15∶1～25∶1（mL/g）時，曲面呈橢圓狀，且等高線較密集，說明水解度受酶解溫度和液料比交互作用影響較顯著。由圖7 可知，酶解溫度和酶添加量交互作用的等高線接近圓形，說明二者交互作用對水解度的影響不顯著。由圖8 可知，液料比為15∶1～25∶1（mL/g），酶添加量為0.5%～1.5%時，曲面呈現橢圓狀，且等高線較為密集，說明水解度受液料比和酶添加量交互作用影響較為顯著。

圖7 酶添加量和酶解溫度交互作用對水解度的影響Fig.7 Effect of interaction between enzyme addition and hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

圖8 酶添加量和液料比交互作用對水解度的影響Fig.8 Effect of the interaction between enzyme addition and liquid-solid ratio on the degree of hydrolysis

2.2.4 響應面模型驗證

經響應面分析，得到美藤果肽酶解最佳工藝為酶解溫度55.18 ℃、液料比為20∶1.24（mL/g）、酶添加量為1.14%，此條件下得到最優的水解度為32.8%。考慮到實際操作的可行性，將條件修正為酶解溫度55 ℃、液料比為20∶1（mL/g）、酶添加量為1.16%，在此條件下重復試驗進行驗證，測出的水解度為32.5%，與預期值相差不大，且高于單因素試驗中的水解度，說明回歸模型擬合度較好，具有可行性。

2.3 美藤果粕多肽氨基酸組成分析

用優化后的工藝參數制備美藤果粕多肽，其氨基酸組成見表4。

表4 美藤果粕多肽的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of polypeptide from Plukenetia volubilis Linneo meal

由表4 可知，美藤果粕多肽含有16 種氨基酸，其中7 種為人體必需氨基酸。在所測得的16 種氨基酸中，谷氨酸含量最高，達14.92%，其次是天冬氨酸，為12.22%，其中人體必需氨基酸（蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸）含量高達31.41%，必需氨基酸與總氨基酸的比值EAA/TAA 為31.41%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值EAA/NEAA 達45.59%，表明生物學價值較高。研究表明，生物活性肽的氨基酸組成與其活性顯示一定的相關性，而多肽的抗腫瘤活性與其中的疏水性氨基酸或氨基酸殘基有密切聯系，比如甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸以及賴氨酸、精氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的一個或多個殘基[26]。而美藤果粕多肽中谷氨酸、甘氨酸和精氨酸中含量豐富，分別為14.92%、10.79%和10.00%，且疏水性氨基酸占總氨基酸含量比例較大，由此推測美藤果粕多肽可能具有抗腫瘤活性。

2.4 美藤果粕多肽分子量分布

美藤果粕多肽分子量檢測結果如圖9 和表5 所示。

圖9 美藤果粕多肽的GPC 圖譜Fig.9 GPC map of polypeptide from Plukenetia volubilis Linneo meal

表5 美藤果粕多肽分子量分布Table 5 Molecular weight distribution of polypeptide from Plukenetia volubilis Linneo meal

由圖9 和表5 可知，美藤果粕多肽主要由分子量小于1 000 Da 的肽段組成，占比94.5%；而1 000～＜2 000 Da和2 000～＜5 000 Da 的肽段占比較低，分別為4.5%和1.0%，美藤果粕多肽分子量超過5 000 Da 的肽段未檢出。梁鉆好等[27]通過超聲輔助堿性蛋白酶酶解制備的美藤果肽，其相對分子質量主要集中在小于1 000 Da，占94.64%，與本試驗研究結果一致。由此表明，美藤果蛋白經高溫蒸煮結合酶解后，大多數被分解成小分子多肽，預測多數肽段為肽鏈長度小于10 個氨基酸的寡肽。小分子肽能夠直接穿過腸道屏障，更容易在消化道中被吸收，發揮生物效應[28]。因此，美藤果粕多肽主要由分子量小于1 000 Da 的肽段組成，屬于小分子多肽，可能具有良好的生物活性。

3 結論

本研究通過單因素試驗和Box-Behnken 響應面法優化高溫蒸煮結合酶法制備美藤果多肽的工藝條件為液料比為20∶1（mL/g）、蒸煮時間6 h、酶解溫度55 ℃、酶解時間6 h 和酶添加量1.16%，其水解度為32.5%，其中對多肽水解度的影響程度依次為酶添加量＞酶解溫度＞液料比；制得的多肽94.5%屬于小分子肽，其分子量小于1 000 Da，其生理活性和應用還需進一步深入研究。