MTHFR基因多態性與貴陽地區原發性不育癥的關系研究

湯賢英，楊杰，劉美，金平，李玉權

(貴陽市婦幼保健院優生遺傳科,貴陽 550003)

生殖健康一直是全球關注的熱點。在不孕不育夫婦中,約50%為男性不育[1]。男性不育與損害精子發生的先天性、后天性或特發性因素有關,而大多數的男性不育原因不明,為特發性男性不育,表現為無精子癥或少精子癥。在人類精子形成過程中,精子頭部染色質的適當濃縮可促使精子成熟并具有受精能力以及胚胎的發育,這一過程有賴于DNA的正確甲基化,而異常的DNA甲基化導致精子變異引發不育[2]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydofolate reductase,MTHFR)通過促進5-甲基四氫葉酸酸的合成,為甲硫氨酸和同型半胱氨酸(Hcy)的合成與代謝提供原料,在DNA合成與甲基化中發揮著重要作用[3]。MTHFR基因的多態性,尤其是C677T與多種疾病有關,如心血管疾病、癌癥、血管疾病、先天性唇腭裂、流產等,其原因可能與該多態性導致的高水平Hcy相關[3-4]。現有的研究顯示,MTHFR基因的多態性可能是男性不育的遺傳性危險因素之一[5-6],但有文獻報道二者之間并無相關性[7],究其原因,可能與地區、種族差異等有關。本研究通過檢測貴陽地區男性不育癥患者的MTHFR基因多態性,探討MTHFR基因多態性是否是貴陽地區原發性男性不育癥的遺傳危險因素。

一、資料與方法

1.研究對象:參照2012年歐洲泌尿外科學會男性不育癥診療指南[8]選取2018年1月至2021年12月期間就診于貴陽市婦幼保健院生殖中心的254例原發性男性不育患者為病例組,年齡19～50歲。納入標準:(1)婚后1年或1年以上、有正常性生活、未采取避孕措施未能使配偶懷孕;(2)兩次精液常規檢測確診為少弱精子癥。排除標準:(1)女方不孕因素;(2)隱睪及睪丸發育不良等生殖器發育異常者;(3)嚴重精索靜脈曲張、附睪損傷、生殖系統感染、染色體異常等因素所致不育者。同時,選取配偶自然受孕且有正常生育史的健康男性238例為對照組,均為同期就診于貴陽市婦幼保健院的體檢人員,年齡20～47歲。所有入組人員均簽署知情同意書。

2.MTHFR基因677、1298位點多態性檢測:EDTA抗凝管采集病例組和對照組外周血2～3 ml。嚴格按血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)說明提取DNA,按照葉酸代謝能力(MTHFR)基因檢測試劑盒(江西諾德)操作程序檢測MTHFR基因677和1298位點的基因型。PCR擴增程序:95℃變性10 min,95℃變性15 s、60℃退火45 s,40個循環。

3.統計學分析:采用SPSS17.0軟件進行數據分析。以百分數(%)表示基因型、等位基因頻率,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1.患者的一般資料:本研究納入254例患者均為貴陽地區常住居民,年齡19～50歲,平均年齡(32.98±7.18)歲;對照組為配偶自然受孕且有正常生育史的健康男性238例,年齡20～47歲,平均年齡(32.61±6.08)歲。兩組研究對象根據MTHFR基因檢測結果將677位點分為CC型、CT型、TT型3個亞組;1298位點分為AA型、AC型、CC型3個亞組。

2.MTHFR基因677位點基因型及等位基因頻率分布情況:病例組和對照組的MTHFR基因677位點TT型基因頻率分別為14.17%、14.71%,兩組相比無統計學差異(P>0.05);兩組間T等位基因頻率相似,分別為37.60%和36.13%,亦無統計學差異(P>0.05)(表1)。病例組及對照組中均未發現同一個體發生兩個位點純合突變的情況,即無MTHFR677TT基因型復合1298CC基因型的情況。

表1 兩組間MTHFR基因677位點基因型頻率及等位基因頻率比較[n(%)］

3.MTHFR基因1298位點基因型及等位基因頻率分布情況:病例組MTHFR基因1298位點CC基因型頻率5.51%,高于對照組(3.78%),但差異無統計學意義(P>0.05);兩組間C等位基因頻率亦無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組間MTHFR基因1298位點基因型頻率及等位基因頻率比較[n(%)］

三、討論

現有研究發現,MTHFR基因多個位點易發生單核苷酸變異,呈現多態性。其中,677和1298位點為目前研究較多且變異頻率較高的位點,并顯示與多種疾病的易感性相關[3-5,9-10]。MTHFR677位點胸腺嘧啶(T)取代了胞嘧啶(C),使該位點呈現出CC(野生型)、CT(雜合突變型)以及TT(純合突變型)三種基因型;1298位點胞嘧啶(C)取代腺嘌呤(A),呈現AA、AC、CC三種基因型。這兩個位點的基因突變均可降低MTHFR酶活性,尤以677TT基因型酶活性降低最為顯著,約降低了50%～60%,阻礙了葉酸的正常代謝[3,9],進而破壞了甲硫氨酸和Hcy的合成與代謝平衡,導致異常的DNA合成與甲基化、DNA修復等,影響精子的成熟與受精能力,這可能是MTHFR基因多態性導致原發性男性不育的原因之一[2-4],亦是MTHFR基因多態性與原發性男性不育癥相關性研究的熱點之一。

近年來,不斷有相關的研究或薈萃分析報道MTHFR基因多態性與原發性男性不育的可能關系[5-6,9-13],MTHFRC677T與無精子癥和少精子癥的關系存在著種族和地域的差異:如在亞洲、印第安及土耳其人群中,MTHFRC677T是無精子癥和少精子癥的遺傳危險因子[6,11-12];而在波蘭及巴基斯坦人中,MTHFRC677T并不是非梗阻性男性不育癥的主要遺傳危險因子[9,13];一項C677T多態性與男性不育癥的關聯分析[7]發現,在東亞人和西亞人種族中MTHFRC677T與男性不育風險增加有關,而在其他種族(如高加索人和非洲人)不存在這種相關性。

Yang等[14]的研究報告指出,我國漢族人群中MTHFR677 T等位基因頻率顯示自北向南逐漸降低的趨勢,山東最高為63.1%、海南最低為24%,TT基因型分別為40.8%、6.4%,這為解釋國內各地677TT基因型與原發性男性不育癥相關性存在地區差異提供了一種可能。但也有研究顯示,各地區原發性男性不育癥與MTHFR基因多態性的關系并未遵循這一趨勢,如四川、湖北、徐州、寧夏(漢族)等地區的研究顯示MTHFRC677T與無精子癥和少精子癥有相關性[15-20],而在中國中部和東部省份MTHFRC677T與漢族特發性男性不育癥無關聯[21-23]。本研究結果顯示,MTHFRC677T、A1298C基因多態性在貴陽地區貴州籍原發性男性不育癥(無精子癥和少子精癥)患者與那些有證實生育力的對照男性之間并無顯著性差異,說明MTHFR基因多態性與原發性男性不育癥的相關性存在不一致性,并不能單純地用地域差異來解釋,而是提示可能存在多種遺傳因素或環境因素影響疾病的遺傳風險。導致這種差異的可能相關因素如下:(1)其他與男性不育有關的尚未確定的致病基因的存在掩蓋了MTHFR基因多態性的影響;(2)基因與基因間的相互作用,如與其他Hcy代謝相關的基因多態性因素互相疊加或干擾有關;(3)種族、民族因素:現有研究顯示在歐洲人、北美人和中國人,以及國內多個民族中均觀察到MTHFR677T等位基因頻率差異[24-25],這種差異可能對疾病遺傳危險因素的判定產生影響;(4)飲食因素:有研究提示飲食也是一種與男性不育及其他疾病相關的環境因素[7]。在具有MTHFRC677T多態性T等位基因的男性中,足量的維生素B9(葉酸)和B12(鈷胺素)攝入在降低同型半胱氨酸水平、改善精子濃度和活力方面發揮關鍵作用[26],提示MTHFR基因多態性與微量營養素之間的相互作用,可影響同型半胱氨酸代謝途徑的效率,進而影響MTHFR基因多態性與相關疾病遺傳風險的評估;(5)其他環境因素。

本研究的研究對象均來自于貴陽地區常住人口,由于樣本量小,不排除結論存在偏倚性;其次,貴州地處西南,飲食結構多樣化,富含葉酸食物種類繁多,可能降低了MTHFR基因C677T多態性對男性不育的影響。隨著經濟的發展、生活水平日益改善,人們對生殖健康的關注或重視日益提高,對微量元素的足量攝入亦逐漸重視,本研究不排除對照組人員攝入足量微量元素可能影響了MTHFR基因C677T多態性與男性不育相關性的判斷。此外,貴州是多民族聚居地區,不同民族間可能存在基因多態性的差異、人口遷移等因素。本研究中亦有少數民族樣本存在,但因樣本量小不足以探討MTHFR基因多態性在不同民族男性不育癥間的差異。因此,后續研究有必要進一步加大樣本量,并增加民族、飲食結構以及影響DNA甲基化的其他基因的調查,進而深入探討MTHFR基因多態性與貴州地區原發性男性不育的關系以及相互作用的機制,指導男性不育癥的預防和治療。