小米谷糠多糖抗氧化及體外免疫活性

李穎，王長遠

（黑龍江八一農(nóng)墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319）

小米屬于我國主要糧食作物之一，被譽為“五谷之首”，具有高產(chǎn)、高抗逆性、適口性好等特點[1]。小米營養(yǎng)價值較高，富含蛋白質(zhì)、淀粉、礦物質(zhì)、多酚及維生素[2-3]，具有調(diào)理腸胃、降血壓等生理功能[4]，深受消費者的青睞。小米谷糠是小米加工中的副產(chǎn)物，含量約占10%[5]，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和功能性成分[6]。目前，已有研究證明從小米谷糠中提取的功能成分可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[7-8]。但其附加值的持續(xù)性開發(fā)和功能性的開發(fā)，尤其在食品領(lǐng)域產(chǎn)品的應(yīng)用仍處于起步階段。

人體如果常年處于亞健康狀態(tài)，則會造成人體免疫力低下并引起各種疾病。免疫力低下的主要原因為機體氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的氧自由基等強氧化性有害物質(zhì)摧毀細胞膜，使細胞不能吸收外界營養(yǎng)成分，并喪失對細菌、病毒的抵御能力，因此引起疾病[9-10]。尋找一種抗氧化營養(yǎng)補充劑清除機體自由基，增加機體免疫力，改善人體亞健康狀態(tài)為當前的研究熱點及難點。

天然多糖因其低毒性等生物活性被廣泛用于功能食品或制藥原料，在降血糖、抗氧化、抗凝血、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等臨床治療中發(fā)揮重要作用[11-14]。葡萄糖、阿拉伯木聚糖等單糖是小米谷糠多糖的主要成分，研究證實小米糠水溶性非淀粉多糖中包含的多酚、黃酮物質(zhì)，可清除自由基、改善腸道環(huán)境[7，15]，但關(guān)于小米多糖抗氧化和免疫調(diào)節(jié)能力的相關(guān)研究鮮有報道，并且其在天然多糖活性物質(zhì)用于調(diào)控巨噬細胞活化和細胞因子的產(chǎn)生，促使免疫系統(tǒng)高效應(yīng)答領(lǐng)域的相關(guān)研究仍處于基礎(chǔ)階段。本試驗以小米谷糠多糖為研究對象，通過對小米谷糠多糖的分離純化，并對其體外抗氧化活性進行測定，結(jié)合細胞實驗進一步驗證小米谷糠多糖的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)能力，以期為小米谷糠多糖的高值開發(fā)和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅谷小米谷糠：黑龍江省大慶市肇州托古小米廠；WST-1 試劑：北京北化精細化學品有限公司；1，1-二苯基-2 - 三硝基苯肼（1，1 -diphenyl -2 -trinitrophenylhydrazine，DPPH）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA） 試劑盒、腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）：南京建成生物工程研究所；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）、胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、RPMI-1640 培養(yǎng)基、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；抗體：北京天根生化科技有限公司；RAW246.7細胞：中國科學院上海生命科學研究所細胞庫；抗壞血酸、α-淀粉酶（5 U/mg）、葡萄糖淀粉酶（2×104U/mL）、蛋白酶（1 500 U/mg）、Griess 試劑、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-2-y1）-2，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]：上海源葉生物科技有限公司；DEAE-52 纖維素層析柱：北京百奧萊博科技有限公司；總RNA 抽提試劑（total RNA extraction reagent，Trizol）試劑：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140 型分析天平、BIO-RAD 550 型微孔板檢測器：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL16B 型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；DGG-9053A 型電熱鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；MJ-10A 型磨粉機：上海市浦恒信息科技有限公司；SP-2000UV 型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；D9000型96 孔熒光定量PCR 儀：蘇州北科震澤生物科技有限公司；CLM-170B-8-NF 型二氧化碳培養(yǎng)箱：新加坡ESCO 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小米谷糠多糖的提取、分離與純化

1.3.1.1 小米谷糠多糖的提取

參考文獻[14]和[16]，利用水提醇沉的方法進行小米谷糠多糖的提取。將采集后的小米谷糠干燥、粉碎、過篩（80 目），稱取200 g 的小米谷糠粉，100 ℃熱水浸提1 h 后[料液比1∶10（g/mL）]，3 000 r/min 離心15 min，收集上清液；雙酶法去除淀粉和蛋白質(zhì)（α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶）；滅酶離心后，加入4 倍體積的85%乙醇，醇析溶液在室溫（28±2）℃條件下于攪拌器上攪拌過夜，8 000 r/min 離心10 min，收集沉淀后用95%濃度乙醇洗滌，真空濃縮后，40 ℃進行干燥，得到沉淀為小米谷糠多糖（millet polysaccharide，MP）。

1.3.1.2 小米谷糠多糖的分離純化

稱取200 mg MP，溶于10 mL 蒸餾水中，以0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L NaCl 為洗脫液，經(jīng)DEAE-52 纖維素層析分離純化得到兩種小米谷糠多糖組分MP-1 和MP-2。

1.3.1.3 小米谷糠多糖含量的測定

將提取的小米谷糠多糖溶于1 mL 水中，采用苯酚-硫酸法測定粗多糖含量[17]。以葡萄糖為標品，繪制葡萄糖標準曲線，最后得到的擬合線性回歸方程為Y=0.014 8X-0.003 6，決定系數(shù)r2=0.998 9，按照如下公式計算小米谷糠多糖含量（W，mg/g）。

式中：C 為提取液中多糖含量，mg/mL；D 為稀釋倍數(shù)；V 為定容總體積，mL；m 為小米谷糠質(zhì)量，g。

1.3.1.4 洗脫蛋白含量

以胎牛血清蛋白為標品，蛋白質(zhì)含量采用Bradford法進行測定[18]。以K2SO4為標品，使用0.5 mol/L HCl 水解小米谷糠粗多糖后，通過BaCl2-明膠法測定硫酸鹽含量[19]。

1.3.2 小米谷糠多糖分子量的測定

小米谷糠多糖的相對分子量采用體積排阻色譜-示差檢測器-激光光散射聯(lián)用技術(shù)（size-exclusion chromatography-differential refractive index-multi-angle laser light scattering，SEC-RI-MALLS）檢測，采用Aglient PL aquagel-OH 凝膠色譜柱，0.2 mol/L 醋酸銨作為流動相，柱溫控制在30 ℃，每次進樣量為20 μL，洗脫液流速為0.7 mL/min[20]。

1.3.3 小米谷糠多糖體外抗氧化活性分析

1.3.3.1 DPPH 自由基清除能力的測定

參考Abu Bakar 等[21]的方法，分別取0.5、1.5、2.5 mg/mL 小米谷糠多糖（MP、MP-1 和MP-2） 和VC溶液各1 mL，加入至2 mL 2×10-4mol/L DPPH 標準液和無水乙醇溶液中，避光靜置30 min，在517 nm 波長下測定吸光度。DPPH 自由基清除率計算公式如下。

式中：X 為DPPH 自由基清除率，%；Am為樣品吸光度；AT為對照吸光度；A0為空白吸光度。

1.3.3.2 ABTS+自由基清除能力的測定

參考王蘭英等[22]的方法，分別取0.5、1.5、2.5 mg/mL小米谷糠多糖（MP、MP-1 和MP-2）和VC溶液各1 mL，加入至3 mL ABTS 溶液和無水乙醇溶液中，黑暗條件下放置1 h，測定734 nm 處的吸光度。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

式中：Y 為ABTS+自由基清除率，%；Am為樣品吸光度；A0為空白吸光度。

1.3.3.3 羥基自由基清除能力的測定

參照李蘭[1]的方法，分別取0.5、1.5、2.5 mg/mL 小米谷糠多糖（MP、MP-1 和MP-2）和VC溶液各1 mL，加入到反應(yīng)體系（6 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L H2O2）中，在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，乙醇代替樣品做空白組，于510 nm 處測定吸光度。羥基自由基清除率計算公式如下。

式中：Z 為羥基自由基清除率，%；Am為樣品吸光度；A0為空白吸光度。

1.3.3.4 總抗氧化能力的測定

小米谷糠多糖的總抗氧化能力測定采用T-AOC檢測試劑盒進行檢測，分別取0.5、1.5、2.5 mg/mL 小米谷糠多糖（MP、MP-1 和MP-2）和VC溶液各1 mL，操作方法嚴格按照試劑盒操作步驟進行測定。

1.3.4 小米谷糠多糖免疫活性能力測定

1.3.4.1 細胞系和細胞培養(yǎng)

巨噬細胞RAW246.7 培養(yǎng)于添加了10% FBS 的RPMI 培養(yǎng)基中，在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[23]。

1.3.4.2 小米谷糠多糖對RAW264.7 細胞NO 的影響

RAW264.7 細胞接種于96 孔板（1×106/mL）中，并在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，去除培養(yǎng)基加入200 μL含有不同濃度（25、50、100 μg/mL） 的小米谷糠多糖MP、MP-1、MP-2 和LPS（1 μg/mL）的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h 后，吸取上清液，分別使用Griess 試劑和MTT 試劑測定細胞NO 產(chǎn)量和細胞增殖情況[24-25]，在550 nm處用酶標儀測量吸光度。

1.3.4.3 RAW264.7 細胞mRNA 表達的定量分析

分別用小米谷糠多糖MP、MP-1、MP-2（25、50、100 μg/mL）和LPS（1 μg/mL）處理RAW264.7 細胞（1×106/mL）24 h。使用Trizol 試劑提取總RNA，測定RNA濃度后使用oligo -dT20 引物和Superscript III RT Takara 構(gòu)建cDNA。β-actin 用作內(nèi)標，所用引物詳情見表1。TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌量采用ELISA 試劑盒測定。

表1 實時定量PCR 分析中使用引物信息Table 1 Primer information used in RT-PCR

1.3.4.4 小米谷糠多糖對RAW264.7 細胞特異性受體的影響

RAW264.7 細胞（1×106個/mL） 通過TLR4、TLR2或CR3 單克隆抗體（10 μg/mL）預(yù)培養(yǎng)2 h，然后通過MP-1（100 μg/mL）或LPS（1 μg/mL）刺激RAW264.7 細胞產(chǎn)生NO，其NO 檢測方法同1.3.5.2。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2017、SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Origin 軟件進行繪圖處理，每次試驗重復(fù)測定3 次，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米谷糠多糖分離純化結(jié)果

小米谷糠多糖梯度洗脫結(jié)果見圖1，多糖含量和化學成分見表2。

圖1 小米谷糠多糖梯度洗脫Fig.1 Elution gradient for millet bran polysaccharide

表2 小米谷糠多糖化學成分分析Table 2 Chemical composition of millet bran polysaccharide%

如圖1 所示，經(jīng)過凝膠柱洗脫后的小米谷糠多糖，洗脫峰較為單一且對稱。小米谷糠經(jīng)過水提醇沉后得到小米谷糠多糖，其含量為11.27%，且主要含有59.78% 多 糖、12.58% 蛋白質(zhì)及少量硫酸鹽。經(jīng)過DEAE-52 纖維素層析分離純化得到兩個組分MP-1（蒸餾水洗脫）和MP-2（0.5 mol/L NaCl 洗脫），含量分別是53.14%和41.29%，由表2 可知各純化組分主要由多糖（78.58%和45.78%）、蛋白質(zhì)（9.78%和7.63%）和少量硫酸鹽（7.42%和8.47%）組成。以上結(jié)果表明，小米谷糠多糖MP 為硫酸化多糖，且經(jīng)過分離純化后得到化學成分比例有所不同。

2.2 小米谷糠多糖分子量

對純化后小米谷糠多糖各組分的分子量進行檢測，組分的分子量分布如圖2 和表3 所示。

圖2 小米谷糠多糖分子量分布Fig.2 Molecular weight distribution of millet bran polysaccharide

表3 小米谷糠多糖分子量Table 3 Molecular weight of millet bran polysaccharide

由圖2 和表3 可知，MP、MP-1 和MP-2 的分子量分別為16.4、14.1、13.9 kDa，多糖保留時間約為50 min，其中小米谷糠多糖MP 具有較高的分子量，而純化后的小米谷糠多糖MP-1 和MP-2 分子量逐漸降低。這可能是因為純化除去了部分非多糖類的小分子物質(zhì)，從而降低MP-1 和MP-2 多糖的分子量[26-27]。

2.3 小米谷糠多糖體外抗氧化活性分析

機體在進行一系列的生命活動時，不可避免會產(chǎn)生自由基，對人體造成嚴重的氧化損傷，威脅機體健康。因此機體需要大量能抵抗自由基的抗氧化物質(zhì)，消除自由基對細胞的氧化攻擊[28]。本試驗采用體外實驗檢測小米谷糠多糖的自由基清除能力及總抗氧能力的影響。小米谷糠多糖的體外抗氧化能力的測定結(jié)果見圖3。

圖3 小米谷糠多糖體外抗氧化活性分析Fig.3 Antioxidant activity of millet bran polysaccharide in vitro

由圖3 可知，在小米谷糠多糖濃度為0.5～2.5 mg/mL時，DPPH 自由基清除率呈上升趨勢，且當濃度為2.5 mg/mL 時，MP-1 中DPPH 自由基清除率高達63.45%。與對照組相比，小米谷糠多糖中ABTS+自由基清除率、羥基自由基清除率的變化趨勢同DPPH 自由基清除率變化趨勢一致，MP-1 的自由基清除能力最強，最高清除率分別為64.12%和54.26%。機體對外界的防御能力與抗氧化能力有關(guān)，并與人體健康存在密切的聯(lián)系，因此檢測小米谷糠多糖的總抗氧化能力可以代表小米多糖的抗氧化能力的強弱[29-30]。由總抗氧化能力結(jié)果可知小米谷糠多糖的抗氧化活性呈劑量依賴性，當多糖濃度在2.5 mg/mL 時，MP-1 的抗氧化能力優(yōu)于MP-2 和MP。因此，MP-1 具有較好的抗氧化活性。

2.4 小米谷糠多糖對RAW264.7 細胞NO 產(chǎn)量及細胞增殖測定結(jié)果

免疫系統(tǒng)主要通過識別和消滅外來有害物質(zhì)來預(yù)防各種疾病的發(fā)生，因此免疫系統(tǒng)對機體健康起到至關(guān)重要的作用[31]。本研究采用RAW264.7 巨噬細胞來驗證小米谷糠多糖對免疫系統(tǒng)的影響。NO 作為一種重要的炎癥因子，可由經(jīng)多糖等物質(zhì)刺激活化后的巨噬細胞產(chǎn)生，具有殺死腫瘤細胞和致病微生物等作用[32]，因此NO 可以作為小米谷糠多糖對免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)效果的重要指標。RAW264.7 細胞NO 產(chǎn)量及細胞增殖見圖4。

圖4 RAW264.7 細胞NO 產(chǎn)量及細胞增殖Fig.4 NO production and proliferation of RAW264.7 cells

由圖4 可知，濃度為25～100 μg/mL 的小米谷糠多糖及其純化組分均能顯著刺激RAW264.7 細胞NO 的產(chǎn)生，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中相同藥物計量濃度下，MP-1 的NO 產(chǎn)量高于MP 和MP-2，且當小米谷糠多糖MP-1 濃度為100 μg/mL 時，NO 產(chǎn)量與LPS（1 μg/mL）刺激得到的NO 產(chǎn)量相近。而通過RAW264.7 細胞增殖實驗結(jié)果可知，與RPMI 對照組相比，小米谷糠多糖及其純化組分均對細胞無毒副作用，并具有促進細胞增殖的效果，由此說明小米谷糠多糖具有增強機體免疫活性的效果，其中MP-1 效果最顯著。

2.5 RAW264.7 細胞mRNA 表達的定量分析

研究表明調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的NO 主要由3 種形式的一氧化碳合成酶（carbon monoxide synthetase，NOS）產(chǎn)生，其中誘導(dǎo)型一氧化碳合成酶（inducible carbon monoxide synthetase，iNOS）為其中的主要形式，其能夠在癌癥治療、腫瘤細胞凋亡及活菌抑制中大量產(chǎn)生[24]。因此本試驗通過RT-PCR 技術(shù)來驗證NO 產(chǎn)量最高的小米谷糠多糖純化組分MP-1 對iNOS mRNA 的相對表達量的影響，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 RAW264.7 細胞mRNA 表達的定量分析Fig.5 Quantitative analysis of mRNA expression in RAW264.7 cells

由圖5 可知，隨著MP-1 濃度的增加，RT-PCR 電泳檢查得到的iNOS mRNA 表達水平隨之增加，但與LPS 存在一定差異。表明iNOS 能夠促進NO 的產(chǎn)生，從而驗證MP-1 對RAW264.7 巨噬細胞的激活作用。通過檢測促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 的基因表達量，結(jié)果表明熒光條帶的強度隨著多糖濃度的增加而增加，而相關(guān)研究表明炎癥因子的過量表達會導(dǎo)致嚴重的炎癥反應(yīng)，對機體產(chǎn)生毒副作用，而IL-10炎癥因子能夠激活反饋抑制作用，其顯著的熒光強度表明IL-10 能夠進行反向調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生[33]。綜上，小米谷糠多糖MP-1 能夠激活巨噬細胞進而正向調(diào)節(jié)其免疫活性。

2.6 小米谷糠多糖RAW264.7 細胞特異性受體的分析

研究表明巨噬細胞會通過其細胞膜上的特異性受體識別病原體并發(fā)揮免疫作用，因此多糖等刺激物需要與相關(guān)受體特異性結(jié)合進而刺激免疫細胞活化從而產(chǎn)生促炎因子[34]。因此本試驗在確定MP-1 能夠促進巨噬細胞活化并正向調(diào)節(jié)機體免疫的基礎(chǔ)上，利用TLR4、TLR2 及CR3 特異性抗體來探討RAW264.7巨噬細胞與MP-1 谷糠多糖分子的相互作用機制，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 RAW264.7 細胞特異性受體的分析Fig.6 Specific receptor of RAW264.7 cells

由圖6 可知， 在TLR4 抗體的存在情況下，RAW264.7 的NO 產(chǎn)量顯著降低并與MP-1 單獨存在條件下的NO 產(chǎn)量存在顯著差異，但TLR2 及CR3 抗體對于MP-1 激活RAW264.7 細胞產(chǎn)生NO 的抑制效果不顯著，因此可以得出MP-1 多糖與巨噬細胞的相互作用的主要受體為TLR4。

3 結(jié)論

本試驗通過水提醇沉法得到小米谷糠多糖MP 并經(jīng)過分離純化得到兩種純化多糖（MP-1 和MP-2），分子量分別為16.4、14.1 kDa 和13.9 kDa，其中MP-1 的多糖得率和含量最高，分別為53.14%和78.58%。通過體外抗氧化實驗證明，小米谷糠多糖具有較強的DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS+自由基清除率，有望作為一種潛在的天然、易得的抗氧化劑資源。此外，小米谷糠多糖可通過刺激巨噬細胞釋放NO 和細胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β），進而增強免疫調(diào)節(jié)活性而且對RAW264.7 細胞無毒性，其中MP-1 具有顯著促進NO產(chǎn)生及細胞增殖的能力，從而調(diào)節(jié)機體免疫能力。因此，小米谷糠多糖可以作為新型的抗氧化及免疫調(diào)劑補充劑用于功能性食品的生產(chǎn)和加工。