基于Akt/mTOR信號通路探究芍藥甘草湯和生麥芽對高泌乳素血癥的作用機制*

時萌萌，周 坤，顧洪偉，劉春芳，馬 良

（1.武漢市精神衛(wèi)生中心，湖北 武漢 430022；2.武漢市心理醫(yī)院，湖北 武漢 430022）

高泌乳素血癥（hyperprolactin，HPRL）為臨床內(nèi)分泌科常見疾病，其病因廣泛，HPRL可由生理因素、病理因素和藥物治療因素等導致[1-2]。該病可導致患者性功能障礙、骨密度降低、月經(jīng)紊亂、乳房異常發(fā)育、溢乳、下丘腦-垂體-性腺軸抑制，嚴重時可增加乳腺癌的患病風險[3]。目前，臨床上針對HPRL多采用多巴胺受體激動劑-溴隱亭、卡麥角林治療。但由于治療過程中極易產(chǎn)生耐藥性和嚴重不良反應(yīng)，并且溴隱亭和卡麥角林激活多巴胺受體會導致使用多巴胺受體拮抗劑的精神障礙患者治療失敗，故采用上述兩藥治療HPRL的遠期風險可能大于收益[4-5]。中醫(yī)藥在緩解HPRL方面具有優(yōu)勢[6-7]，當前中藥方劑芍藥甘草湯[8-11]和生麥芽[12-15]治療HPRL已有成熟的報道。其療效溫和持久、不良反應(yīng)少，但其作用機制尚不明確。

高泌乳素血癥是泌乳素瘤的典型臨床表現(xiàn)。溴隱亭、卡麥角林可能通過自噬和凋亡途徑誘導泌乳素瘤細胞死亡[16-17]，進而抑制泌乳素分泌。Akt/mTOR通路是調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典信號通路之一[18]，芍藥甘草湯和生麥芽是否也是通過調(diào)控自噬通路減輕藥理性高泌乳素血癥有待研究。因此，本研究采用隨機對照實驗方法研究芍藥甘草湯和生麥芽對HPRL大鼠血清泌乳素水平的影響，并結(jié)合蛋白免疫印跡法（Western blotting）、免疫組化法（immunohistochemistry，IHC）考察大鼠乳腺組織中p-Akt、p-mTOR、LC3等分子水平，探究兩者治療HPRL作用機制，為尋找更加安全、有效的中藥復方提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為后期深入的機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 奧林巴斯生物顯微鏡（上海通灝光電科技有限公司，型號：BX53）；酶標儀（美國Molecular Devices公司，型號：FlexStation 3）；微型高速離心機（美國Labnet公司，型號：C2500-R-230V）；電泳儀（上海天能科技有限公司，型號：EPS-600）。

1.2 藥物與試劑 生麥芽（批號：2005209）、白芍（批號：2121070104）、炙甘草（批號：1907105）均購自湖北辰美中藥有限公司，經(jīng)武漢市精神衛(wèi)生中心藥學部副主任中藥師劉春芳鑒定白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、炙甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根莖加工品、生麥芽為禾本科植物大麥（Hordeum vulgare L.）的成熟果實經(jīng)發(fā)芽干燥的炮制加工品，質(zhì)量均符合2020年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)項下的規(guī)定。鹽酸甲氧氯普胺注射液（河南潤弘制藥股份有限公司，批號：1903072）；甲磺酸溴隱亭片（匈牙利吉瑞大藥廠，批號：T06042B）；泌乳素（PRL）ELISA試劑盒（批號：E-EL-R3006）、促黃體生成素（LH）ELISA試劑盒（批號：E-EL-R0026c）、雌二醇（ES）ELISA試劑盒（批號：E-EL-0152c）、孕酮（Pg）ELISA試劑盒（批號：E-EL-0154c）、促卵泡素（FSH）ELISA試劑盒（批號：E-EL-R0391c）均購自伊萊瑞特生物科技股份有限公司；GAPDH兔多抗（杭州賢至生物有限公司，批號：AB-P-R 001）；mTOR兔單抗（批號：BM4182）、Akt1兔多抗（批號：A00024）、HRP標記羊抗兔二抗（批號：BA1054）、mTOR（批號：BM4182）均購自武漢博士德生物工程有限公司；p-mTOR兔單抗（批號：5536）、p-Akt兔單抗（批號：4060）、LC3兔單抗（批號：3868）、Phospho-mTOR（Ser2448）（批號：5536）、Phospho-Akt（Ser473）（批號：4060）、LC3（批號：3868）均購自Cell Signaling Technology。其余所用試劑均為分析純。

芍藥甘草湯制備：參照文獻[9]，取芍藥、甘草（質(zhì)量比為3∶1）適量，藥材加水至沒過藥物表面3～5 cm，浸泡30 min，武火煮沸，然后用文火煎煮30 min，取煎液。繼續(xù)加水至沒過藥渣表面約3 cm，按上述方法重復煎煮1次，混合兩次煎液，過濾，將煎煮液濃縮至質(zhì)量濃度為2.0 g/mL的流浸膏，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用時稀釋。

生麥芽煎煮液制備：取生麥芽藥材適量，加水至超過藥物表面3～5 cm，浸泡30 min，武火煮沸，然后用文火煎煮30 min，取煎液。繼續(xù)加水至超過藥渣表面約3 cm，按上述方法重復煎煮1次，混合兩次煎液，過濾，將煎煮液濃縮至質(zhì)量濃度為2.5 g/mL的流浸膏，放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用時稀釋。

1.3 實驗動物 SPF級雌性（未孕）SD大鼠40只，體質(zhì)量（203.2±3.7）g，購自三峽大學實驗動物中心，動物合格證號：42010200 004627，實驗動物許可證號：SCXK（鄂）2017-0012。所有大鼠飼養(yǎng)在華中科技大學實驗動物中心SPF級動物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在20～26 ℃，相對濕度保持在40%～70%，晝夜各半循環(huán)照明，飼養(yǎng)期間大鼠自由飲水飲食。實驗過程中所有操作均符合科學技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的要求。

2 方法

2.1 模型建立、分組及給藥 隨機取8只大鼠作為正常組，其余大鼠為造模組。造模組大鼠背部皮下注射鹽酸甲氧氯普胺注射液（50 mg/kg），2次/d，連續(xù)注射7 d[19]。7 d后取血清檢測泌乳素（PRL），造模組大鼠PRL明顯高于正常組（P＜0.05），說明造模成功。采用隨機數(shù)字表法將造模成功的32只大鼠分為模型組、芍藥甘草湯組、生麥芽組和溴隱亭組，每組8只。大鼠給藥劑量以實驗動物與人的體表面積比換算，人和大鼠按體表面積折算的等效劑量比值為0.018，計算大鼠劑量（mg/kg）=系數(shù)（6.3）×人的劑量（mg/kg）。芍藥甘草湯組給藥劑量為12.6 g/（kg·d），生麥芽組給藥劑量為31.5 g/（kg·d），溴隱組給藥劑量為0.53 mg/（kg·d），正常組和模型組給予等體積蒸餾水，各組均采用灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥30 d。

2.2 觀察指標

2.2.1 樣本采集與樣品制備 于末次給藥結(jié)束12 h后，以10%水合氯醛腹腔注射行大鼠麻醉術(shù)，麻醉劑量按照0.3 mL/100 g計，麻醉后腹主動脈采血，所取血液用高速離心機離心（3 000 r/min，10 min，離心半徑為8.55 cm）取上層血清；同時剝離每組大鼠的乳腺，分離其第2、3對乳腺組織，備用。

2.2.2 檢查方法與檢測指標

2.2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清激素水平 將得血液樣本經(jīng)高速離心（3000r/min，10min，離心半徑為8.55cm）取上層血清，采用酶聯(lián)免疫分析法測定泌乳素（PRL）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（Pg）、促卵泡素（FSH）水平，實驗操作流程嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟進行，于450 nm波長下用酶標儀讀取光密度（OD值），通過標準曲線計算各樣品中上述指標的含量。

2.2.2.2 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測大鼠乳腺組織中自噬相關(guān)因子表達 取乳腺組織塊于4 ℃預冷的勻漿緩沖液中勻漿，高速離心（12000r/min，5min，離心半徑為8.55 cm），取上清液作為樣品，BCA法測定其蛋白質(zhì)濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，加樣后電泳轉(zhuǎn)模，室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗GAPDH（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶2 000）、mTOR（1∶500）、p-mTOR（1∶1 000）。4 ℃孵育過夜，洗膜；加入HRP標記羊抗兔二抗（1∶50 000）37 ℃孵育2 h，ECL發(fā)光液孵育后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，使用Gel-Proanalyzer 4圖像分析軟件讀取灰度值并統(tǒng)計分析，檢測各組大鼠乳腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表達水平。

2.2.2.3 免疫組化檢測大鼠乳腺組織中自噬相關(guān)因子表達分別取各組大鼠乳腺組織包埋、切片、脫蠟，抗原修復，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，加一抗mTOR（1∶100）、PhosphomTOR（Ser2448）（1∶100）、Akt（1∶200）、Phospho-Akt（Ser473）（1∶200）、LC3（1∶100）；加酶標二抗HRP標記羊抗兔二抗（1∶100），加顯色劑，復染、脫水、封片，將晾干的切片在顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.2.2.4 乳腺組織病理特征 分別取各組大鼠乳腺組織，用甲醛固定，石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色，于高倍顯微鏡下觀察各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)變化。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以（）表示。若計量資料滿足正態(tài)分布和方差齊性，則多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；不滿足方差齊性的情況下采用Games-Howell法比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清激素水平比較 模型組大鼠血清PRL水平高于正常組（P＜0.01），F(xiàn)SH、LH、Pg、E2水平低于正常組（P＜0.01），表明造模成功。溴隱亭組大鼠血清PRL水平低于模型組（P＜0.01），LH、FSH、Pg和E2水平高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；芍藥甘草湯組、生麥芽組大鼠血清PRL水平低于模型組（P＜0.01），芍藥甘草湯組大鼠血清FSH、Pg水平高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），生麥芽組大鼠血清FSH、Pg和E2水平高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。（見表1）

表1 各組大鼠血清激素水平比較 （）

表1 各組大鼠血清激素水平比較 （）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＞0.05，cP＜0.01，dP＜0.05。

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3.2 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)學比較 正常組大鼠乳腺組織未呈現(xiàn)增生狀，乳腺小葉數(shù)量少、體積小、分布均勻，乳腺腺泡和導管無增生，腔內(nèi)無分泌物。與正常組比較，模型組大鼠乳腺小葉數(shù)量明顯增多、體積增大，小葉腺泡數(shù)量增多，腺泡和導管明顯擴張，腔內(nèi)有大量分泌物；與模型組比較，芍藥甘草湯組和生麥芽組大鼠乳腺增生情況均改善，乳腺小葉、腺泡和導管增生減少，腔內(nèi)無分泌物或僅有少量分泌物出現(xiàn)。（見圖1）

圖1 各組大鼠乳腺組織切片圖 （HE，×400）

3.3 Western blotting檢測各組大鼠乳腺組織中自噬相關(guān)因子表達情況 模型組大鼠乳腺組織中LC3-Ⅱ/Ⅰ高于正常組（P＜0.01），說明模型組大鼠乳腺組織中自噬水平較高；芍藥甘草湯組、生麥芽組和溴隱亭組大鼠乳腺組織中及LC3-Ⅱ/Ⅰ均低于模型組（P＜0.01），表明芍藥甘草湯、生麥芽和溴隱亭可以抑制甲氧氯普胺注射造成的自噬水平提升。模型組大鼠乳腺組織p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達量高于正常組（P＜0.01），芍藥甘草湯組、生麥芽組和溴隱亭組大鼠乳腺組織p-Akt和p-mTOR蛋白相對表達量均低于模型組（P＜0.01），表明芍藥甘草湯、生麥芽和溴隱亭可抑制p-Akt和p-mTOR蛋白表達。（見圖2、表2）

圖2 各組大鼠乳腺組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達Western blotting 圖

表2 各組大鼠乳腺組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 相對表達量及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值比較 （）

表2 各組大鼠乳腺組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 相對表達量及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值比較 （）

注：與正常組比較，aP＞0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＞0.05，dP＜0.01。

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3.4 IHC檢測各組大鼠乳腺組織中自噬相關(guān)因子表達情況 模型組大鼠乳腺組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表達水平高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果與Western blotting檢測結(jié)果相互佐證。芍藥甘草湯組、生麥芽組、溴隱亭組大鼠乳腺組織中p-Akt、p-mTOR、LC3蛋白表達水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；芍藥甘草湯組、溴隱亭組大鼠乳腺組織中mTOR蛋白表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖3、表3）

圖3 各組大鼠乳腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表達 （免疫組化，×400）

表3 各組大鼠乳腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表達水平比較 （）

表3 各組大鼠乳腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表達水平比較 （）

注：與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＞0.05，dP＜0.05，eP＜0.01。

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4 討論

高泌乳素血癥在中醫(yī)學上屬于“閉經(jīng)”“月經(jīng)失調(diào)”“乳泣”等范疇[20]。女性月經(jīng)、胎孕、乳汁均與臟腑氣血化生密切相關(guān)。腎藏精，肝藏血，肝腎同源。腎精虧則肝木無所涵養(yǎng)、氣血不足，血無法下行胞宮為月經(jīng)，反上逆為乳汁，因而表現(xiàn)為溢乳、閉經(jīng)等[21]。腎虛精虧、肝失疏泄而致氣血失和、瘀血內(nèi)阻，可見肝、脾、腎三臟功能失調(diào)為高泌乳素血癥主要病因，氣滯、肝郁、痰濁、瘀血為主要病機。高泌乳素血癥主要辨證為肝郁氣滯證、肝郁腎虛證、痰濕阻滯證、脾虛血瘀證4個證型[22]。芍藥甘草湯對肝郁氣滯證、肝郁腎虛證、痰濕阻滯證和脾虛血瘀證均有較好的調(diào)理作用。方中白芍苦、酸、微寒，歸肝、脾經(jīng)，可治療肝血虧虛、月經(jīng)不調(diào)、肝脾不和和胸脅脘腹疼等。其作用特點在于能補能瀉，專行血海，女人調(diào)經(jīng)胎產(chǎn)，一切肝病，皆宜用之。甘草甘平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，可治療脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸氣短、咳嗽痰多、癰腫瘡毒等。其作用在于補脾益氣、祛痰止咳、調(diào)和諸藥，脾、胃、肺、心四臟同調(diào)。白芍、甘草相合，共奏酸甘化陰、滋陰柔肝、調(diào)合營衛(wèi)、調(diào)氣疏郁之功，對氣滯、肝郁、痰濁、瘀血等為主要病機的高泌乳素血癥有較好地緩解作用。因而芍藥甘草湯在高泌乳素血癥相關(guān)癥狀的緩解和治療上具有其獨到之處。基于此本研究考察芍藥甘草湯對高泌乳素血癥相關(guān)癥狀的緩解和治療作用，并結(jié)合相關(guān)技術(shù)手段探究其作用機制。

芍藥甘草湯（質(zhì)量比為3∶1）和生麥芽均可降低泌乳素水平，但生麥芽在降低HPRL的同時，能夠同時升高FSH、Pg、E2水平，且升高三者的幅度較芍藥甘草湯更明顯，尤其是升高E2水平幾乎與溴隱亭療效相當。這在臨床上具有重要意義，從而印證了生麥芽在治療乳汁異常分泌、不孕癥、高泌乳素血癥方面有其獨特優(yōu)勢。

研究發(fā)現(xiàn)，PRL對乳腺組織有直接刺激作用，可抑制Pg、FSH、LH的分泌，從而加速乳腺組織的過度增殖；此外，PRL還可與雌激素和Pg一起促進乳腺上皮細胞生長，導致乳腺增生[23]。本研究結(jié)果表明，芍藥甘草湯和生麥芽均可改善大鼠乳腺增生，在改善增生形態(tài)、減少增生數(shù)量、抑制分泌物形成等方面都表現(xiàn)出一定優(yōu)勢。同時，蛋白免疫印跡實驗及免疫組化實驗結(jié)果顯示，芍藥甘草湯組和生麥芽組大鼠乳腺組織中p-AKT、p-mTOR、LC3-Ⅱ/Ⅰ水平顯著低于模型組，進一步印證了芍藥甘草湯與生麥芽可能通過調(diào)控乳腺組織自噬相關(guān)蛋白水平而治療高泌乳素血癥。

孟延兵[11]研究認為升高FSH、抑制垂體PRL mRNA、泌乳素調(diào)節(jié)元結(jié)合蛋白（PREB）mRNA表達是芍藥甘草湯治療高泌乳素血癥作用機制。龔曉云[13]研究發(fā)現(xiàn)麥芽治療高泌乳素血癥作用機制包括3個方面：（1）通過依賴于多巴胺D2受體的單靶點途徑發(fā)揮抗高泌乳素血癥作用；（2）直接作用于PKA，通過抑制PKA活性降低PRL水平；（3）上調(diào)DRD2與DAT受體水平啟動cAMP/PKA/CREB信號通路。曹鈺羚等[24]研究表明麥芽治療高泌乳素血癥作用機制與多巴胺介導的泌乳素通路調(diào)控相關(guān)。郭潤竹[25]研究認為麥芽治療高泌乳素血癥作用機制與抑制TLR4/NF-κB/MAPK12信號通路的活化有關(guān)。朱夢軍等[26]研究表明麥芽治療高泌乳素血癥作用機制是通過降低高泌乳素血癥大鼠腦垂體PRL的表達而達到治療作用。前期研究[27]表明，芍藥甘草湯可能通過調(diào)控FoxO、HIF-1、PRL、Jak-STAT、PI3K-Akt和MAPK等信號通路發(fā)揮治療HPRL的作用。本研究證實芍藥甘草湯和生麥芽均能通過降低大鼠乳腺組織中p-Akt、p-mTOR、LC3蛋白表達水平而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，芍藥甘草湯、生麥芽可通過多靶點、多通路的相互作用治療高泌乳素血癥。研究結(jié)果體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療多部位、多靶點和整體調(diào)節(jié)的治療特色。

芍藥甘草湯、生麥芽在治療劑量下降低高泌乳素血癥大鼠血清PRL水平的效果相當，且能夠不同程度抑制乳腺組織p-Akt、p-mTOR及LC3-Ⅱ/Ⅰ的水平，其作用機制可能與減輕乳腺組織中自噬作用相關(guān)。本研究結(jié)果可為芍藥甘草湯和生麥芽治療高泌乳素血癥提供實驗依據(jù)。