蒙醫針刺療法治療干眼癥模型大鼠的實驗研究*

吳薩日娜，李常勝，吳斯琴畢力格，嘎拉臺，新吉夫，桂 芝，劉 彬，何宇紅

（1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010050）

干眼癥是一種常見的眼部疾病，其發病率呈逐年升高趨勢[1]，病因復雜，臨床表現多種多樣。病情發展到一定程度，可明顯降低人的視覺，影響患者工作和生活[2]。美國的一項研究表明，全球有10%～15%的成人患有干眼癥，其中日本的發病率為17.0%，澳大利亞為10.3%。目前我國還沒有確切的干眼癥流行病學資料，根據我國的衛生狀況和環境狀況，干眼的患病率要高于美國[3]。已有研究[4-5]顯示，干眼癥的發生與患者自身免疫疾病、激素分泌水平降低、細胞過度自噬、炎癥反應和細胞凋亡等因素有關。一項研究[6]表明，過度的炎癥應激反應是引起干眼癥的重要原因。

根據干眼癥的臨床癥狀，蒙醫將其歸屬于“寒風赤眼癥”范疇。蒙醫學認為，人體是由三根（赫依、希拉、巴達干）與七素相互依賴所構成的整體，三根失去平衡是一切疾病發生的根本原因。干眼癥是體內因赫依偏勝，并與希拉、巴達干相博，侵襲肝和白脈系統，引發肝、眼血行障礙，阻塞白脈之傳導所致。蒙醫學認為，干眼癥病位在于肝和白脈，肝位于希拉區，也是赫依的主要竄行之道。因此，本課題選取赫依穴、希拉穴和肝穴，而不是干眼癥發作密切相關的眼部穴位。蒙醫針刺療法具有鎮赫依、調節三根、鎮痛、疏通白脈、調整臟腑功能，可以達到抗干眼效果。本研究采用蒙醫針刺療法干預阿托品誘導的干眼癥模型大鼠，觀察針刺對角結膜炎癥因子的干預作用，闡述“調節三根，精充目明”的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，6～8周齡，體質量210～230 g，合格證號：110324210106503772，由蘇州西山生物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。動物進駐動物房后適應性喂養1周，期間自由食水，溫度（24±2）℃，濕度48%，12 h光照、12 h黑暗。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2 藥物與試劑 1%硫酸鹽阿托品眼用凝膠（批號210801）、玻璃酸鈉滴眼液（批號：ID210502）均由沈陽興齊眼藥股份有限公司生產。Anti-IL-1β antibody（批號：ab234527）、Anti-IL-6 antibody（批號：ab281013）、Anti-TNF-α（批號：2150188）均購自Abcam公司；HRP標記的羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZB-2301），Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG（thermos fisher 公司，批號：R37115）。

1.3 模型制作與針刺干預 大鼠適應性喂養1周后，采用隨機數表法進行分組，分為正常組、模型組、玻璃酸鈉滴眼液組、蒙醫針刺療法組，每組15只，雌雄各半。除正常組外，其他3組以1%硫酸阿托品眼用凝膠滴眼，每日4次（08:00、12:00、16:00、20:00）、每次每眼5 μL，直至實驗結束，共4周。滴藥3 d后進行淚液分泌量及淚膜破裂時間（tear break-up time,BUT）檢測判斷大鼠成模情況，剔除不合格大鼠。成模后，模型組不做處理；玻璃酸鈉滴眼液組給予玻璃酸鈉滴眼，3次/d，共4周；蒙醫針刺療法組則根據全國針灸學會實驗研究學術會制定的“實驗動物針灸穴位圖譜”選取相當于人體解剖部位的相應穴位，取大鼠赫依穴（第1胸椎下凹正中）、希拉穴（第2胸椎下凹正中）、肝穴（第9胸椎下凹正中）行針刺，1次/d，共4周。

1.4 對淚液質量的影響

1.4.1 淚液分泌量 造模后，使用淚液分泌試紙進行淚液分泌量（Schirmer test，SIT）[7]檢測，判斷是否成模。針刺后第2、4周再次檢測淚液分泌量，判斷針刺對大鼠淚液分泌的影響。

1.4.2 淚膜破裂時間測定 造模后，采用熒光素染色法觀察大鼠淚膜破裂時間（BUT）[8]，判斷是否成模。針刺后第2、4周再次檢測BUT，判斷針刺對大鼠淚液分泌的影響。

1.5 HE染色法判斷大鼠角膜形態學變化 末次針刺2 h后，以過量麻醉法（過量水合氯醛）處死。4 min內，在手術顯微鏡下與鞏膜分離，并完整取下大鼠右眼角膜，4%多聚甲醛固定。對前固定的角膜30%蔗糖脫水，常規石蠟包埋，5 μm連續切片，以備進行HE染色，洗片后滴加蘇木素復染細胞核，最后使用鹽酸酒精分化后封片觀察。

1.6 RT-PCR法檢測大鼠角膜組織白細胞介素（interleukin，IL）-1β mRNA、IL-6 mRNA、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-a, TNF-α）mRNA表達水平 采用4組20 mg左右的冰凍角膜。用液氮將試樣粉碎，加入1 mL Trizol，在室溫下放置2 min，將Trizol轉到沒有RNA酶的EP管內。添加200 μL的氯仿，大力搖動15 s，室溫放置15 min，然后離心（4 ℃，12 000×g，15 min）。離心后，將液體分成三層，取上部無色液體至新的EP管中。加入等體積的異丙醇，將其上下混合，在室溫下放置5 min，然后離心（4 ℃，12 000×g，10 min）。去上清，沉淀，加入1 mL 75%的酒精，稍搖15 s，然后離心（4 ℃，7 500×g，5 min）。注意清除上清液，將管道中的沉淀置于超凈臺中，吹氣靜置3～5min。提取上清后，用50 μL的DEPC溶解，用UV測定，-80 ℃冷藏。根據反轉錄試劑盒的指示進行反轉錄試驗。引物序列見表1。

表1 RT-q PCR 引物序列

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism-6統計軟件進行數據統計，并且繪制統計圖表。計量資料用（）表示，采用One-way ANOVA 及T-test進行檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 針刺干預前后各組SIT檢測結果 阿托品滴眼3 d后，與正常組比較，模型組、玻璃酸鈉滴眼液組、蒙醫針刺療法組大鼠淚液試紙長度明顯縮短（P＜0.01）。針刺干預后2周時，與模型組比較，蒙醫針刺療法組與玻璃酸鈉滴眼液組大鼠SIT明顯增長（P＜0.01）；與蒙醫針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠SIT明顯縮短（P＜0.01）。針刺干預后4周時，與模型組比較，蒙醫針刺療法組與玻璃酸鈉滴眼液組大鼠SIT明顯增長（P＜0.01）；與蒙醫針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠SIT明顯縮短（P＜0.01）；與正常組比較，蒙醫針刺療法組大鼠SIT無明顯改變（P＞0.05）。蒙醫針刺療法組4周與蒙醫針刺療法組2周比較，SIT明顯增長（P＜0.01）；玻璃酸鈉滴眼液組4周與玻璃酸鈉滴眼液組2周比較，SIT無明顯改變（P＞0.05）。（見圖1、表2）

圖1 SIT 評分交互效應輪廓圖

表2 干預前后各組SIT 比較 （，mm）

注：F時間主效應=431.2，P時間主效應=0.000；F分組主效應=129.5，P分組主效應=0.000；F交互效應=61.98，P交互效應=0.000。

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2.2 針刺干預前后各組BUT檢測結果 阿托品滴眼3 d后，與正常組比較，模型組、玻璃酸鈉滴眼液組、蒙醫針刺療法組大鼠BUT明顯縮短（P＜0.01）。針刺干預后2周時，與模型組比較，蒙醫針刺療法組與玻璃酸鈉滴眼液組大鼠BUT明顯增長（P＜0.01）；與蒙醫針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠BUT明顯縮短（P＜0.01）。針刺干預后4周時，與模型組比較，蒙醫針刺療法組與玻璃酸鈉滴眼液組大鼠BUT明顯增長（P＜0.01）；與蒙醫針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠BUT明顯縮短（P＜0.01）；與正常組比較，蒙醫針刺療法組大鼠BUT明顯縮短（P＜0.05）。蒙醫針刺療法組4周與蒙醫針刺療法組2周比較，BUT明顯增長（P＜0.01）；玻璃酸鈉滴眼液組4周與玻璃酸鈉滴眼液組2周比較，BUT無明顯改變（P＞0.05）。（見表3、圖2）

圖2 BUT 評分交互效應輪廓

表3 干預前后各組BUT 比較 （，s）

表3 干預前后各組BUT 比較 （，s）

注：F時間主效應=280.3，P時間主效應=0.000；F分組主效應=61.89，P分組主效應=0.000；F交互效應=23.27，P交互效應=0.000。

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2.3 HE染色法觀察大鼠角膜細胞形態 正常組角膜上皮細胞發育良好，無明顯炎癥細胞浸潤。模型組大鼠的角膜上皮細胞增殖，基底層細胞的排列不整齊，表面有凹凸不平的感覺，而蒙醫針刺療法組則表現為上皮細胞的增殖和基底層的排列紊亂；但與模型組相比，增殖程度仍存在一定的差別，蒙醫針刺療法組明顯好于模型組，而玻璃酸鈉滴眼液組則可見上皮細胞的增殖，胞索間的排列紊亂。（見圖3）

圖3 各組大鼠角膜HE 染色照片 （×40）

2.4 RT-PCR法檢測各組大鼠角膜組織中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達水平 針刺干預后2周，與模型組比較，蒙醫針刺療法組大鼠角膜組織中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達明顯降低（P＜0.05）；與蒙醫針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠角膜組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA的表達明顯增加（P＜0.05）。針刺干預后4周，與模型組比較，蒙醫針刺療法組大鼠角膜組織中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達明顯降低（P＜0.01）；與蒙醫針刺療法組比較，玻璃酸鈉滴眼液組大鼠角膜組織中IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達明顯增加（P＜0.01）；與正常組比較，蒙醫針刺療法組大鼠IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達無明顯改變（P＞0.05）。蒙醫針刺療法組4周與蒙醫針刺療法組2周比較，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達明顯減少（P＜0.01）；玻璃酸鈉滴眼液組4周與玻璃酸鈉滴眼液組2周比較，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表達無明顯改變（P＞0.05）。（見表4）

表4 干預后各組IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNT-α mRNA 比較 （）

表4 干預后各組IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNT-α mRNA 比較 （）

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3 討論

干眼癥是一種由各種原因導致的淚液質或數量的異常，或者由于動態變化而導致的淚膜穩定性降低，同時還伴有眼部不適，以及/或眼表組織的損傷[9-10]。據流行病學調查，約75%的40歲及以上的成人患有干眼癥，其中女性更容易患干眼癥[11-12]。目前，臨床上治療干眼癥一般采用人工淚液，玻璃酸鈉滴眼液作為一種優質的人工淚液，具有加快角膜細胞修復、改善眼角膜保濕能力的作用[13-14]，能有效改善患者癥狀，但患者易出現依賴現象，綜合臨床效果有待提升。

阿托品是一種常見的副交感神經受體阻斷劑，可使淚腺乙酰膽堿含量減少，導致淚液分泌明顯下降，繼發角膜細胞出現鱗狀上皮細胞化生及炎細胞浸潤的情況。研究[15]表明，采用阿托品滴眼液局部滴眼3 d能夠誘導出比較穩定的干眼癥模型，用藥后1周左右干眼體征最為明顯。與單純的淚腺切除術比較，阿托品干眼模型具有可逆、合理、簡單、快速、經濟的特點。本實驗采用阿托品誘導的大鼠模型進行淚液分泌和淚膜破裂時間的測定，結果表明阿托品能有效地誘發干眼癥。應用蒙醫針刺對阿托品誘發的干眼癥大鼠進行干預后，角膜細胞活動旺盛，上皮細胞擴張飽滿，BUT明顯降低，淚液分泌增加。研究表明針刺可通過促進角膜代謝及調節神經反射敏感性以增加淚液分泌，說明蒙醫針刺對阿托品引起的干眼大鼠具有良好的療效。

由于干眼癥的發病率逐年升高，并且趨于年輕化，有關干眼癥的研究成果也頗為豐富。研究表明，干眼癥的發病機制包括激素分泌水平降低、維生素缺乏[16]、自身免疫疾病、神經體液調節異常、細胞過度自噬、細胞凋亡[17]和炎癥反應等，其中炎癥反應是主導環節和起始因素[18-20]。炎癥反應以中性粒細胞浸潤為主，伴有多種炎癥介質和細胞因子參與。淋巴細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等細胞在體內炎癥反應高時，會分泌大量的細胞因子IL-2、CRP、TNF-α等，而TNF-α是引起腫瘤細胞在炎癥過程中死亡的重要因素[21]。同時，IL-2和CRP能促進炎癥細胞的聚集、活化、炎癥介質的釋放，從而導致局部的炎癥反應。LIN X T等[22]通過對大鼠進行IFN-γ和TNF-α的實驗，發現了一定程度的炎癥反應對免疫功能有影響，說明血清相關因子能促進炎癥反應，從而降低機體的免疫功能。實驗結果顯示，在大鼠模型中，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA均有較高的表達，說明在干眼癥的發病過程中，存在與炎癥有關的基因表達。經過蒙醫針刺治療后，IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的含量明顯下降，表明蒙醫針刺療法對阿托品誘導的干眼大鼠有抑制炎癥發生的作用。

蒙醫認為眼與全身其他臟器之間的聯系，要依靠白脈為之連接貫通。眼不斷得到白脈輸送的氣、血的濡養，才能維持正常的功能。針刺調節三根，陣痛，疏通白脈，調整臟腑功能，可以達到抗干眼效果。綜上，本研究結果顯示蒙醫針刺療法的調節三根，疏通白脈的作用可通過調控炎癥因子的表達而實現。但現階段也存在一定的局限性，蒙醫針刺療法如何從更深層次的分子機制調控干眼癥的發生還需要進一步研究。