干姜中3種姜酚類成分提取工藝研究*

施麗君，楊韌強，嚴秋蘭，閻光宇，蔡樹蕓，楊 婷，陳偉珠,，張怡評,

（1.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發利用工程技術創新中心，福建 廈門 361005；2.福建中煙工業有限責任公司技術中心，福建 廈門 361021；3.廈門海洋職業技術學院海洋生物學院，福建 廈門 361100）

干姜（Zingiber officinaleRosc.）為姜科植物姜的干燥根莖[1]，其傳統優質資源分布廣泛。干姜始載于《神農本草經》，被列為中品[2]，具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效[3]。其主要含姜酚和揮發油等成分，可改善血液循環，對惡心嘔吐、炎癥、心腦血管系統疾病有較好的治療作用[4]。姜酚是干姜的主要生物活性物質，其中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量較高[5-6]。6-姜酚具有鎮痛、抗炎、抗菌、保肝利膽、抗氧化、改善心腦血管系統功能等多種藥理作用。研究發現，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚可加強心肌收縮力，并對腫瘤細胞活性有明顯的抑制作用[7-10]，并且其均具有β-羥基酮，結構不穩定[11-12]。這可對姜酚的提取、分離等研究造成影響，因此對姜酚的提取工藝考察具有一定的研究意義。目前尚未見干姜中以此3種姜酚成分為指標的提取工藝研究。故本研究以干姜中3種酚類成分為指標，采用超聲輔助提取法，考察乙醇濃度、提取時間及料液比等因素對干姜中姜酚類成分提取工藝的影響，建立干姜中姜酚類成分最佳的提取工藝，旨在為干姜的進一步開發應用提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器 e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ-500E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ME104E型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DFT-200A型手提式高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 試劑與試藥 干姜（批號：21090103）購自安國市一方藥業有限公司，經福建中醫藥大學黃鳴清教授鑒定為姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc.）的干燥根莖；6-姜酚對照品（批號：Y03D11Y132894）、8-姜酚對照品（批號：G24A10L96114）、10-姜酚對照品（批號：Z10701BC13）均購自上海源葉生物科技有限公司；乙醇（分析純）購自西隴科學股份有限公司；無水乙醚（批號：20191017）購自國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件 Thermo BDS Hypersil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（72∶28）；流速為1 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL。對照品與供試品色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 圖

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱定6-姜酚對照品10.41mg、8-姜酚對照品10.36 mg、10-姜酚對照品10.32 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，混勻，即得質量濃度為1.04 mg/mL的6-姜酚對照品溶液、1.04 mg/mL的8-姜酚對照品溶液、1.03 mg/mL的10-姜酚對照品溶液。分別精密吸取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚對照品溶液各0.25 mL，再加入0.25 mL色譜甲醇補齊至1 mL，即得混合對照品溶液，放置4 ℃冰箱儲藏，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱定干姜粉末（過三號篩）2.0 g，置100 mL無塞錐形瓶中，加入一定量、一定體積分數的乙醇溶劑，稱定質量，超聲（功率：500 W）提取一定時間后取出再次稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，放置片刻后，取上清液，溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 單因素試驗 采用超聲輔助提取法提取干姜中的6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚，分別考察不同乙醇濃度、提取時間、料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響。

2.5 響應面法優化提取試驗 在單因素試驗結果的基礎上，根據響應面法Box-Behnken設計原理，以乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）3個因素為響應因子，對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的提取工藝進行優化，采用3因素3水平的響應面分析法進行試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平表

3 結果

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 乙醇濃度對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響精密稱取干姜粉末（過三號篩）2.0 g，置于100 mL錐形瓶中，分別加入40、50、60、70、80%的乙醇溶液，固定超聲提取時間為40 min、料液比為1∶40（g/mL），提取結果見圖2。結果顯示，當提取時間與料液比固定時，隨著乙醇濃度的升高，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率也隨之升高。當乙醇濃度為40%～60%時對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響較為顯著；當乙醇濃度為60%時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高，為1.54%；當乙醇濃度超過60%時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率反而降低，之后趨于平穩。這可能是由于較低濃度的乙醇進入組織細胞內較容易，可大量溶解液泡中的水溶性酚類物質；而高濃度的乙醇則容易破壞蛋白質的結構，使酚類物質的提取受到阻礙[13]。隨著乙醇濃度的繼續增大，提取出的其他雜質成分與乙醇-水分子結合，形成了競爭性抑制劑，從而導致6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率降低[14]。因此優選乙醇濃度為60%。

圖2 乙醇濃度對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響

3.1.2 提取時間對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響精密稱取干姜粉末（過三號篩）2.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加入80 mL的60%乙醇溶液，分別超聲提取20、30、40、50、60 min，提取結果見圖3。結果顯示，當乙醇濃度與料液比固定時，隨著提取時間的延長，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率也隨之增加；當超聲提取時間為40 min時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高，為1.48%；當超聲提取時間為30～40 min時對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響最大，可能是因為超聲提取時間過短，空化作用尚未發生完全，酚類物質尚為完全溶解，所以6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率不高[15]。當超聲提取時間超過最佳提取時間時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率下降并且趨于平穩，可能是因為超聲提取時間太長，大分子酚類化合物在超聲波的持久強烈作用下，化學結構遭受破壞，緊接著其他雜質成分也慢慢溶解，從而阻擋了姜酚的溶解使6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率不高[16]。因此優選超聲提取時間為40min。

圖3 提取時間對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響

3.1.3 料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響精密稱取干姜粉末（過三號篩）2.0 g，置于100 mL錐形瓶中，分別選取料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，加入60%的乙醇溶液，固定超聲提取時間為40 min，提取結果見圖4。結果顯示，超聲提取時間和乙醇濃度固定時，隨著料液比的增加，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率也隨之增加。當料液比為1∶30（g/mL）時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高，為1.55%。料液比繼續增加，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率則不再提高，趨于平穩略呈下降趨勢。一般而言，料液比越大提取率越高，但達到一定值后，有效成分已提取完全，提取率則不再增加。而且料液比越大資源耗費越大，成本越高，操作也更不便[17]。綜合考慮最終優選料液比為1∶30（g/mL）。

圖4 料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響

3.2 響應面試驗結果

3.2.1 響應模型的建立與分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件，設計響應面優化試驗方案得試驗結果見表2。

表2 響應面優化提取干姜中姜酚的設計方案及結果

采用Design-Experts 8.0.6軟件對表2所得數據進行二次多項式回歸分析，得到干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率對乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）的回歸模型方程為：6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率（%）=1.73+0.049A+0.024B+0.015C-0.040AB-0.023AC-0.0025-003BC-0.12A2-0.069B2-0.016C2。通過響應面試驗得到的結果對干姜中姜酚提取工藝的回歸方程進行方差分析。結果見表3。

表3 干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚提取工藝回歸方程方差分析結果

根據方差分析表3可知，該方差模型F值為15.51，P值為0.0008，極顯著，失擬項F值為3.1，P值為0.151 3，不顯著。在此回歸方程模型中，只有乙醇濃度的P＜0.05，說明存在顯著性，其余兩個因素P＞0.05，不存在顯著性。二次項中，A2影響極顯著（P＜0.001），B2影響顯著（P＜0.05），C2影響不顯著（P＞0.05）。校正模型的相關系數R2=0.9523，可知試驗考察值和模擬預測值之間的相關性很高，表明該方程的模擬性較好。根據3種因素F值大小，可推斷出影響6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率大小因素的排序為A＞B＞C。

3.2.2 響應面優化結果與分析 根據擬合模型繪制干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率各因素交互作用圖見圖5～7。圖5～6顯示明顯橢圓形的等高線圖，表明乙醇濃度與料液比、料液比與提取時間之間交互作用顯著。圖7只顯示近似橢圓形的等高線圖，表明乙醇濃度與提取時間之間僅呈交互作用，但是不顯著。

圖5 乙醇濃度與料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的交互作用圖

通過圖5～7中響應面各因素交互作用圖可知，在所選范圍內存在響應面最高點。當乙醇濃度為61%，料液比為1∶34（g/mL）時，因提取時間充足使得6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高。（見圖5）當提取時間為41 min，料液比為1∶34（g/mL）時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高，時間過短或料液比過高都不利于酚類物質的提取。（見圖6）當乙醇濃度為61%，提取時間為41 min時，中等濃度的乙醇最適合姜酚的提取，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高。（見圖7）

圖6 提取時間與料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的交互作用圖

圖7 乙醇濃度與提取時間對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的交互作用圖

3.3 最佳工藝條件的確定與驗證試驗 通過響應面軟件解出方程，得出最優化提取工藝：乙醇濃度為61.4%，提取時間為41.2 min，料液比為1∶33.6（g/mL），結合實際試驗條件，將最優化提取工藝參數取整數得：乙醇濃度為61%，提取時間為41 min，料液比為1∶34（g/mL）。

采用確定的最優條件分別進行3組平行驗證試驗，通過驗證得出3組平行試驗的6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚平均總提取率為1.73%，該值與模型預測值1.74%基本一致，誤差為0.57%，說明建立的模擬回歸方程具有良好的預測性[18]，其優選出的最佳提取工藝重復性良好。

4 討論

干姜資源豐富，但其主要成分的研究較單一，研究大多集中于占比較大的揮發油上[19-20]。姜酚研究主要集中于6-姜酚的研究，而8-姜酚、10-姜酚及其他姜酚的研究很少。這可能是由于6-姜酚占總姜酚的比例更大[21]，藥理作用也十分廣泛。本試驗采用超聲輔助提取法進行單因素試驗，分別考察了乙醇濃度、提取時間、料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響，經響應面法優化得到最佳提取工藝條件：乙醇濃度為61%，提取時間為41 min，料液比為1∶34（g/mL）。用HPLC測定3種姜酚的含量，結合響應面法優化最佳提取工藝，以最佳提取工藝條件進行3次平行試驗，得到6-姜酚提取率為0.90%、8-姜酚提取率為0.30%、10-姜酚提取率為0.53%，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚平均總提取率為1.73%。