基于化學計量學及熵權TOPSIS分析聯合多組分定量的麩炒蒼術綜合質量評價*

晏明英，魏譚軍，趙 丹，魏 旭，陳 飛，王春龍，肖 成

（達州市中西醫結合醫院/達州市第二人民醫院，四川 達州 635000）

蒼術為菊科植物茅蒼術[Atractylodes lancea(Thunb.)DC.]或北蒼術[Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.]的干燥根莖，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目的功效[1]。蒼術臨床應用廣泛。麩炒蒼術為蒼術炮制品，是我院院內制劑神術合劑的君藥。開展對麩炒蒼術質量控制和品質評價研究對穩定神術合劑整體質量，確保臨床應用療效一致性具有重要意義。本研究收集江蘇、浙江、湖北、河南、四川、云南6省18批次茅蒼術藥材，按照2020年版《中華人民共和國藥典》一部蒼術項下規定除雜，洗凈，潤透，切厚片，干燥，麩炒至表面深黃色制備麩炒蒼術，采用HPLC法同時測定麩炒蒼術中白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅰ、蒼術素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術苷A、β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮含量，并通過化學計量學結合熵權優劣解距離法（EW-TOPSIS）對不同產地來源的麩炒蒼術進行質量評價，以期為麩炒蒼術的安全性、有效性綜合評價和內在質量的全面控制提供基礎。

1 材料

1.1 主要藥物與試劑 白術內酯Ⅲ對照品（批號：111978-201501）、白術內酯Ⅱ對照品（批號：111976-201501）、白術內酯Ⅰ對照品（批號：111975-201501）和蒼術素對照品（批號：111924-202207）均購于中國食品藥品檢定研究院，質量分數分別為99.7%、99.9%、99.9%和99.9%；β-桉葉醇對照品（批號：PRF8112042）、蒼術苷A對照品（批號：PRF21121721）和蒼術酮對照品（批號：PRF22061641）均購于成都普瑞法科技開發有限公司，質量分數分別為97.1%、98.0%和98.0%；蒼術素醇對照品（批號：Y54635）和(4E,6E,12E)-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯對照品（批號：B23334）均購于上海源葉生物科技有限公司，質量分數分別為95.0%和98.0%；蒼術藥材采集地信息見表1；乙腈、磷酸、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純；水為純凈水。

表1 蒼術藥材信息

1.2 主要儀器 LC-10AT型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；色譜柱為資生堂CAPCELL PAK C18柱、Agilent Extend C18柱、Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；CP225D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；SB-1000YDTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅰ、蒼術素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術苷A、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮對照品適量，以90%甲醇為溶劑，定量制成上述9種成分的質量濃度分別為0.138、0.072、0.276、0.730、1.316、0.492、9.870、5.018和2.854 mg/mL的混合對照品母液；精密吸取該母液1 mL置20 mL容量瓶中，用90%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取粉碎的麩炒蒼術粉末約2 g，精密稱定于25mL容量瓶中，加入90%甲醇20 mL，超聲處理45 min，常溫放至室溫，用同90%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18柱（250mm×4.6mm，5 μm），柱溫：30 ℃；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～18 min，13%A；18～25 min，13%A→25%A；25～43 min，25%A→48%A；43 ～61 min，48%A→75%A；61～70 min，75%A→13%A）；檢測波長：220 nm（0～25 min檢測白術內酯Ⅲ和白術內酯Ⅱ）[2-4]、270 nm[25～43 min檢測白術內酯Ⅰ、蒼術素醇和（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯][4-9]、203 nm（43～70 min檢測蒼術苷A、β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮）[9-10]；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

2.4 HPLC方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 取混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。（見圖1）結果顯示麩炒蒼術供試品溶液中白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅰ、蒼術素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術苷A、β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮9種成分的出峰位置與對照品基本一致，且陰性樣品對麩炒蒼術中多組分定量測定無干擾。

圖1 混合對照品（A）和麩炒蒼術（B）的HPLC 色譜圖

2.4.2 線性關系考察 精密吸取混合對照品母液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL，分別用90%甲醇稀釋至20 mL，搖勻制得系列混合對照品溶液1～6。取溶液1～6按“2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以對照品質量濃度（X）對峰面積（Y）進行線性回歸，得線性回歸方程。（見表2）

表2 麩炒蒼術中各成分的線性回歸結果

2.4.3 精密度試驗 取麩炒蒼術（編號：S1）供試品溶液1份，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，計算白術內酯Ⅲ等9個成分峰面積的RSD值分別為1.36%、1.50%、1.22%、1.31%、1.07%、1.22%、0.55%、0.83%、0.93%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取麩炒蒼術（編號：S1）樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、5、9、14、20、24 h時，按“2.3”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，9個成分峰面積的RSD值分別為1.39%、1.57%、1.23%、1.39%、1.14%、1.23%、0.55%、0.81%、1.02%，表明麩炒蒼術供試品溶液24 h內穩定。

2.4.5 重復性試驗 取麩炒蒼術（編號：S1）樣品，按“2.2”項下方法制備麩炒蒼術供試品溶液6份，在上述色譜條件下測定，記錄色譜圖，用外標法計算9個成分的含量，各成分含量的RSD值分別為1.74%、1.89%、1.61%、1.69%、1.59%、1.63%、1.08%、1.19%、1.28%，表明方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知含量的麩炒蒼術（編號：S1），粉碎，取細粉9份，每份約1 g，精密稱定，分別按已知各成分含量的80%、100%、120%加入混合對照品溶液[每1 mL含白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅰ、蒼術素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術苷A、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮對照品分別為0.102、0.038、0.189、0.394、0.671、0.235、8.679、3.417、1.512 mg]，每個水平3份，再按“2.2”項下方法制備加樣供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。9種成分的平均加樣回收率分別為97.96%、98.22%、96.87%、98.44%、97.79%、99.11%、100.26%、97.87%、98.43%；RSD分別為1.50%、1.20%、0.76%、1.46%、1.54%、1.21%、0.58%、1.33%、1.65%。

2.5 一測多評法的建立

2.5.1 相對校正因子（f）的計算取“2.4.1”項下6個混合對照品溶液，以β-桉葉醇為參照物，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，依公式計算f。式中f為相對校正因子、ρ為質量濃度、A為峰面積、i為參照物、s為其他待測成分。結果見表3。

表3 麩炒蒼術中8 種成分的f 值

2.5.2 相對校正因子（f）耐用性考察 選用液相色譜儀（LC-10AT型和Agilent 1260型）和色譜柱（CAPCELL PAK C18柱、Agilent Extend C18柱和Hypersil C18柱）。流速：（1.0±0.2）mL/min。柱溫：（30±5）℃。分別考察儀器、色譜柱、流速和柱溫的改變對f的影響。取混合對照品溶液依次進樣檢測，結果儀器與色譜柱、流速和柱溫對所建立的f均無較大影響。結果見表4～6。

表4 不同儀器及色譜柱條件下檢測的f 值

表5 不同流速下檢測的f 值

表6 不同柱溫條件下檢測的f 值

2.5.3 相對保留時間的測定 取“2.1”項下混合對照品溶液，考察液相色譜儀（LC-10AT型和Agilent 1260型）和色譜柱（資生堂CAPCELL PAK C18柱、Agilent Extend C18柱和Hypersil C18柱）對相對保留時間值（t）的影響，在上述色譜條件下測定，記錄色譜圖，采用t法對麩炒蒼術中多組分色譜峰進行定位。結果各成分t值的RSD均≤1.74%，表明采用相對保留時間值法可以對麩炒蒼術中多組分色譜峰進行準確定位。（見表7）

表7 不同儀器及色譜柱條件下檢測的t 值

2.6 含量測定 取18批麩炒蒼術（S1～S18），按“2.2”項下方法制備供試品溶液（每批平行制備3份），取各供試品溶液適量，依法進樣測定白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅰ、蒼術素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術苷A、β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮峰面積，采用ESM法計算麩炒蒼術中9種成分的含量；再依據“2.5.1”項下所得相對校正因子采用一測多評法計算各組分含量。對各組分兩種方法所得數據進行t檢驗。兩種方法結果比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表8）

表8 麩炒蒼術中9 種成分含量測定結果及比較 （n=3）

2.7 聚類分析 聚類分析可通過數據建模挖掘復雜數據間存在的關聯性，對數據進行簡化分類。以18批麩炒蒼術中9種成分QAMS法含量檢測數據為變量，將變量數據導入SPSS 26.0統計軟件中，采用系統聚類法以Euclidean距離為樣品度量標準進行分析。聚類分析樹狀圖見圖2。結果顯示當Euclidean距離為10時，18批麩炒蒼術樣品呈明顯的分類趨勢，樣品被分為3類：S9、S11、S12、S10和S8共5批樣品聚為一類，S2、S5、S4、S6、S3、S1和S7共7批樣品聚為一類，S14、S16、S15、S18、S13和S17共6批樣品聚為一類。

圖2 18 批麩炒蒼術樣品聚類分析樹狀圖

2.8 主成分分析 主成分分析通過挖掘多個變量間的相關性，篩選出重要性較強的幾個主成分，能盡可能多地保留原始變量的信息，以達到降維的目的。以18批麩炒蒼術中9種成分QAMS法含量檢測數據為變量構建9×18階矩陣。采用SPSS 26.0統計軟件中的降維方法對數據進行主成分提取，得各主成分方差分析表（見表9）和成分矩陣表（見表10）。選取特征值大于1的公因子為主成分，結果前2個主成分特征值分別為7.125和1.130，方差貢獻率分別為79.163%和12.554%，累積方差貢獻率為91.716%＞85%，表明前2個主成分因子能夠解釋91.716%的原始變量。

表9 麩炒蒼術中2 個主成分因子的特征值和方差貢獻率

表10 麩炒蒼術中9 種成分的初始因子載荷矩陣

第1主成分主要反映白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅱ、蒼術素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術苷A、β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮等成分的綜合信息，第2主成分主要反映白術內酯Ⅰ的信息。（見表10）同時將9×18階矩陣導入SIMCA 14.1統計軟件建立PCA模型，提取2個主成分，結果模型穩定、可靠。18批麩炒蒼術PCA得分圖見圖3。SIMCA 14.1和SPSS 26.0統計軟件PCA結果與CA結果基本一致，S1～S7、S8～S12及S13～S18分別呈現一定關聯性。

2.9 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA） 以18批麩炒蒼術中9種成分QAMS法含量檢測數據為變量，運用SIMCA 14.1統計軟件挖掘引起麩炒蒼術產品質量差異的主要潛在標志物，建立OPLS-DA模型。結果模型解釋和預測能力較好，且穩定可靠。18批麩炒蒼術樣品的OPLS-DA模型得分圖見圖4。可見18批麩炒蒼術樣品明顯分成3類：S16、S14、S17、S15、S13和S18聚為一類，位于得分圖左下方；S7、S2、S3、S4、S5、S1和S6聚為一類，位于得分圖中上方；S8、S10、S9、S11和S12聚為一類，位于得分圖右下方。以變量重要性投影（VIP）＞1為篩選標準，篩選出引起麩炒蒼術樣品質量差異的主要潛在標志物，VIP值越大，表明該成分對麩炒蒼術組間質量差異的影響越大。18批麩炒蒼術各成分VIP圖見圖5。結果顯示，β-桉葉醇（VIP=1.932 0）、蒼術素（VIP=1.368 0）、蒼術酮（VIP=1.034 0）和白術內酯Ⅰ（VIP=1.155 0）是影響麩炒蒼術產品質量的主要潛在標志物。

圖4 18 批麩炒蒼術樣品的OPLS-DA 模型得分圖

圖5 18 批麩炒蒼術的VIP 圖

2.10 EW-TOPSIS法分析 以18 批麩炒蒼術中9 種成分QAMS法含量檢測數據為變量建立初始化決策矩陣，采用越大越優型指標計算公式[Xij和Yij分別為原始含量數據和數據歸一化后數據，max（xj）和min（xj）分別為各成分含量數據的最大值和最小值]對原始含量數據進行歸一化處理。（見表11）以OPLS-DA分析中各成分的VIP值作為各指標權重（Wj），采用計算公式Zij＝Yij×Wj構建加權決策矩陣（見表12），得加權決策矩陣最優方案Z+j=0.196 0、0.137 0、1.155 0、0.476 0、0.783 0、0.308 0、1.932 0、1.368 0、1.034 0，最劣方案Z-j均為0。采用評價指標與正負理想解距離計算公式分別計算18批次麩炒蒼術樣品與正理想解距離（D+i）以及與負理想解的距離（D-i），再根據歐氏貼近度計算公式計算最優解的歐氏貼近度（Ci），即18批次麩炒蒼術樣品的綜合評分。Ci排名前6位的依次為S16、S14、S15、S18、S17和S13，其中4批（S13～S16）來自江蘇省，2批（S17、S18）來自浙江省，表明江蘇和浙江地區所得麩炒蒼術整體質量較佳。（見表13）

表11 18 批麩炒蒼術各指標歸一化處理結果

表12 18 批麩炒蒼術加權矩陣

表13 18 批麩炒蒼術藥材質量評價排序

3 討論

蒼術資源分布廣泛。茅蒼術適宜高溫、雨水充足、溫度適宜的南方地區，主要分布于秦嶺以南的江蘇、浙江、湖北、河南、四川、云南等地；北蒼術耐寒性強，喜冷涼，光照充足，喜晝夜溫差較大氣候，主要分布于秦嶺淮河以北的黑龍江、吉林、遼寧、河北、內蒙古等地。蒼術主要含有蒼術素、蒼術素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯等烯炔類成分，β-桉葉醇、茅術醇、蒼術酮、蒼術內酯等倍半萜類成分，以及寡糖、多糖、甾類化合等多種成分[11-12]。化學成分是中藥產生生物效應的物質基礎，活性成分含量及成分群之間的配比又與藥材產地、地域環境、種屬密切相關，不同產地、不同地域環境、不同種屬造成中藥材所含化學成分的種類和含量差異顯著[13]，同時中藥材炮制方法對產品質量也會存在影響[14-19]。而藥材的質量決定療效。中藥的化學成分復雜，其藥效并非是任何單一有效成分的作用，也不是幾種有效成分的簡單相加。成分間或協同或拮抗。蒼術現收載于2020年版《中華人民共和國藥典》一部，標準僅對蒼術素進行了定量分析。單一化學指標進行的定量分析評價藥材質量，易產生片面性，同時也達不到中醫藥理論的要求；多指標成分定量控制能更全面地表征藥材的整體質量。化學計量學[20-22]及熵權TOPSIS[23-25]分析通過對多指標性成分設置權重系數，避免了主觀因素造成的誤差，能更加直觀、客觀地判斷中藥材的整體質量，故越來越多地用于中藥材質量評價研究中。因此開展對蒼術質量控制和品質評價研究對確保臨床應用療效一致性具有重要意義。

本研究在制備供試品溶液時，同時以色譜峰峰形、分離度、靈敏度為評價指標，分別考察了溶劑（50%甲醇、90%甲醇、甲醇）、提取方式（超聲和加熱回流）及時間（40、45、60 min）。結果顯示90%甲醇超聲提取45 min時得到的9種成分色譜峰峰形、分離度較好，靈敏度最佳。本研究通過對9個指標成分溶液進行全波長掃描，觀察各成分光譜曲線中的最大吸收，結合《中華人民共和國藥典》及相關文獻，最終采用220 nm檢測白術內酯Ⅲ和白術內酯Ⅱ，270 nm檢測白術內酯Ⅰ、蒼術素醇和（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯，203 nm檢測蒼術苷A、β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮。各成分在該條件下有較大吸收，峰形尖銳，麩炒蒼術供試品溶液在該條件下檢測時基線相對平穩，且各成分分離度良好。本試驗在篩選流動相時，首先考察了甲醇-水和乙腈-水不同梯度洗脫程序，通過各洗脫程序下的色譜圖比較，發現以乙腈-水系統為流動相效果較好，但個別色譜圖拖尾嚴重，故考慮加入磷酸溶液（0.05%、0.10%、0.20%）進行改善，最終發現乙腈-0.10%磷酸溶液作為流動相系統時，洗脫效果最佳。

本試驗采用HPLC法對18批麩炒蒼術中白術內酯Ⅲ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅰ、蒼術素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術苷A、β-桉葉醇、蒼術素和蒼術酮進行定量測定，再結合化學計量學對檢測結果進行分析。結果18批不同產地麩炒蒼術呈明顯的分類趨勢，明顯聚為3類，呈現一定的產區差異，且CA與PCA分析結果基本一致。OPLS-DA分析發掘出影響麩炒蒼術產品質量的主要潛在標志物為β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮和白術內酯Ⅰ。EW-TOPSIS結果顯示，江蘇和浙江地區所得麩炒蒼術整體質量較好，其次為河南、湖北、四川和云南產地所得麩炒蒼術。

4 結論

本試驗采用化學計量學聯合EW-TOPSIS法和多組分定量法對不同產地的麩炒蒼術質量進行了綜合評價，建立的方法可操作性強，有效降低了檢驗成本，有利于多指標成分定量控制模式的普及應用，也為該藥材的道地性研究提供了基礎，進一步促進了蒼術優質種源的研究與開發。