過表達及敲減LncRNA RP11-521C20.3 的非小細胞肺癌A549穩轉細胞株的構建

李春桃，張雪梅，蘇琰迪，張劍青

（昆明醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學二科，云南 昆明 650032）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見的慢性呼吸系統疾病，是基因易感患者在接觸有害的氣體或顆粒后出現氣道和/或肺泡異常，最終出現呼吸道癥狀，如慢性咳嗽、咳痰、胸悶、氣促；胸部CT 影像提示肺部肺氣腫征象；肺功能檢測提示阻塞性通氣功能障礙；最終導致患者生活質量下降、致殘致死等不良結局，目前COPD 已成為全球死亡和住院的主要原因[1]。目前研究報道人類基因中只有1.5%左右的基因編碼蛋白質，其它大量基因轉錄為非編碼RNA。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）本身不具有編碼蛋白質的功能，但可以抑制或增強蛋白質編碼基因的表達[2]，從多個層面參與調節細胞分化和個體發生的生理過程，也可參與炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等病理過程[3]。

lncRNAs 已經被證實在COPD 發病過程中扮演了重要的角色[4-6]，但其在COPD 中的具體表達及其生物學功能仍未完全詮釋清楚，本課題組前期基因芯片的結果發現lncRNA RP11-521C20 與BMF mRNA 有負相關關系，可能在BMF 的基因轉錄和翻譯上有重要作用。另采用RT-qPCR 技術檢測吸煙COPD 合并肺癌及無COPD 肺癌的遠癌肺組織中基因表達量，結果顯示吸煙COPD 并肺癌患者肺組織中的BMF mRNA 表達量高于無COPD 肺癌者，相反lncRNARP11-521C20.3 表達下調，同時大鼠COPD 模型的肺組織檢測結果也證實了該表達關系，通過mRNA 和lncRNA 基因芯片的結果，分析lncRNA RP11-521C20.3 與BMF 的共表達關系，結果顯示兩者存在負相關[7]。據既往研究BMF 在細胞凋亡通路中發揮重要作用[8]，而lncRNA RP11-521C20.3 則是調控其表達的重要分子，這提示lncRNA RP11-521C20.3可能在COPD 的細胞凋亡機制中起重要作用。肺泡上皮細胞是肺的主要結構細胞，具有分泌肺表面活性物質、進行氣體交換等作用。肺泡上皮細胞凋亡在COPD 的發生、發展過程中起到了關鍵的作用，肺泡間隔內肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞進行性凋亡、細胞外基質丟失可導致肺泡腔擴大、肺泡間隔變薄，形成了COPD 的肺氣腫表現[9-13]。本研究擬構建lncRNA RP11-521C20.3慢病毒過表達及敲減質粒，包裝病毒后構建lncRNA RP11-521C20.3 過表達及敲減A549 穩轉細胞株，為進一步研究lncRNA RP11-521C20.3在COPD 肺泡上皮細胞凋亡的分子生物學機制提供開展體外細胞實驗的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

A549 和293T 細胞購自賽百慷上海生物技術股份有限公司；TriQuick Reagent 總RNA 提取試劑購自Solarbio 公司；Ham's F-12K 購自于Procell 公司；胎牛血清購自于Sigma 公司；嘌呤霉素購自于Beyotime 公司；PBS 1×、0.25%胰蛋白酶消化液（含EDTA）、2xSYBR Green qPCR Master mix、Servicebio RT First Strand cDNA Synthesis Kit 購自于Serivicebio 公司；TriQuick Reagent 總RNA 提取試劑購自Solarbio 公司；FastQuant RT Kit 購自TIANGEN 公司；異丙醇、無水乙醇、氯仿購自西隴化工公司；限制性內切酶SbfI/EcoRI、限制性內切酶AgeⅠ和EcoRⅠ購自天根生化科技（北京）有限公司；RP11-521C20抗體購自ABCAM 公司；GAPDH 抗體購自ABCAM 公司；PCR 儀購自Applied Biosystems 公司；凝膠成像分析儀購自培清科技公司；冷凍高速離心機購自ThermoFisher 公司；倒置顯微鏡購自Questar 公司；倒置熒光顯微鏡購自Mshot 公司；臺式低速離心機購自可成儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LncRNA RP11-521C20.3 過表達慢病毒質粒載體構建（1）PCR 擴增引物序列。在NCBI數據庫中檢索目的基因的mRNA 序列，選擇其CDS 序列采用Primer 5.0 引物設計軟件按照引物設計原則進行引物設計。獲得目的基因的上下游引物后在NCBI 數據庫中應用Primer-BLAST 在線工具進行引物特異性檢測，檢測合格的引物用于后續實驗。LncRNA RP11-521C20.3 PCR 擴增引物序列步驟，見表1。

表1 LncRNA RP11-521C20.3 PCR 擴增引物序列步驟Tab.1 LncRNA RP11-521C20.3 PCR amplification primer sequence

（2）LncRNA RP11-521C20.3 過表達慢病毒重組載體構建。采用SbfI/EcoRI 限制性內切酶對過表達載體進行酶切，酶切反應體系，見表2。

表2 過表達重組載體構建酶切反應體系Tab.2 Enzyme digestion reaction system for construction of overexpressed recombinant vectors

將上述試劑及材料混合，水浴鍋（37℃）孵育2 h 以上。瓊脂糖凝膠電泳用于檢測酶切產物的效果，瓊脂糖凝膠電泳后將目標載體條帶從凝膠上切下，回收凝膠。構建重組質粒（并設計1 組不含lncRNA RP11-521C20.3 片段的質粒作為對照組）。反應體系，見表3，過表達質粒圖譜，見圖1。

表3 過表達重組質粒反應體系Tab.3 Overexpressed recombinant plasmid reaction system

將上述試劑混合均勻，37℃孵育30 min，置于冰上5 min。將適量反應液轉移至DH5α 感受態細胞，培養結束后，取適量菌液均勻涂抹于含氨芐青霉素的平板上，倒置于恒溫培養箱中培養12～16 h。挑取1 μL 作為模板進行菌落PCR 鑒定。鑒定引物：Forward：5′-CCAGATCTGTTGACCAACT TTCAAGAGAAGTTGGTCAACAGATCTGG-3′，Reverse：5′-CCAGATCTGTTGACCAACTTCTCTTGAAAG TTGGTCAACAGATCTGG-3′。鑒定反應體系，見表4。PCR 反應（94℃ 3sec；55℃ 30sec；72℃1 min/kb，循環30 次）。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，選取陽性克隆轉化子轉化，挑菌，質粒抽提，并測序。目的質粒轉染293T 細胞后，RTqPCR 檢測表達。

表4 過表達重組質粒鑒定體系Tab.4 Identification system of overexpressed recombinant plasmid

（3）慢病毒包裝及滴度測定。轉染前24 h，將293T 細胞以5×106細胞數/15 mL 接種到10 cm培養皿中，待細胞密度達到70%后，在滅菌的離心管中加入試劑，見表5。室溫溫育15 min，然后將上述混合液加至293 T 細胞的培養基中，充分混勻后，細胞培養箱（5% CO2，37 ℃）6 h，換新鮮培養基轉染48 h，收集上清液，進行離心（半徑5 cm，4 000 r/min，4 ℃，10 min），采用0.45 μm濾器過濾上清液后，于40 mL 超速離心管中進行離心（25 000 r/min，離心半徑12 cm，離心120 min），棄上清液，加病毒保存液，充分溶解后再次離心（10 000 r/min，離心半徑10 cm，離心5 min），上清液分裝于試管中，-80℃保存。

表5 慢病毒包裝試劑Tab.5 Lentivirus packaging reagent

1.2.2 LncRNA RP11-521C20.3 慢病毒敲減重組載體構建（1）合成lncRNA RP11-521C20.3 shRNA 序列。根據lncRNA RP11-521C20.3（Gene ID：NM_005082.5）序列設計了shRNA 序列并進行合成設計，序列信息，見表6。

表6 shRNA 序列Tab.6 shRNA sequence

（2）LncRNA RP11-521C20.3 shRNA 載體構建

設計好siRNA 靶點，進行引物合成。用寡糖退火緩沖液將合成的寡核苷酸溶解于20 μM 溶液中，每條互補單鏈30 μL。然后將低聚核苷酸混合物在95℃的水浴鍋中加熱5 min，打開并在室溫下自然冷卻，形成雙鏈低聚核苷酸片段。載體pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE 進行AgeI 和EcoRI 雙酶切，酶切反應體系，見表7，敲減表達質粒圖譜，見圖2。

圖2 LncRNA RP11-521C20.3 敲減表達質粒圖譜Fig.2 LncRNA RP11-521C20.3 knockdown expression plasmid map

表7 敲減載體構建酶切反應體系Tab.7 Enzyme digestion reaction system for knockdown vector construction

將上述試劑混合，37℃水浴鍋孵育2 h 以上。酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠電泳后將目標載體條帶從凝膠中切斷，進行膠回收。敲除片段連接到表達載體上，在16℃下連接過夜。連接產物轉化至DH5α 感受態細胞。挑取平板上長出的轉化子于10 μL LB 培養液中，取1 μL 進行菌落PCR 鑒定。反應體系和PCR 循環條件，見表8。進行PCR 反應（94℃ 3sec；55℃ 30sec；72℃ 1 min/kb。共30 個循環）。對菌落鑒定得到的陽性克隆進行測序和驗證。

表8 敲減重組體PCR 鑒定體系Tab.8 Knock-down recombinant PCR identification system

（3）慢病毒包裝。將目的質粒轉染至293T 細胞并接種于10 cm 培養皿，6 h 后換液，繼續培養72h。將上清液離心（4 000 r/min，4 ℃，離心半徑5 cm）。對濃縮病毒溶液進行過濾、收集和包裝。將包裝好的慢病毒轉染293T 細胞后檢測病毒滴度。

1.2.3 慢病毒感染A549 細胞及穩轉細胞株建立在6 孔板中接種約1×105個細胞/孔（次日細胞融合達到30%～40%）。本次實驗MOI（感染復數推薦值w 為5。根據公式：病毒體積（μL）=細胞數×MOI/滴度（TU/mL）×1 000，即慢病毒添加量為：2.5/孔。加入病毒后混勻，繼續培養。感染后12 h 細胞形態良好，未發生不良反應，感染后24 h 后更換新鮮培養基，繼續培養。分別于感染48 h、72 h、96 h 后在熒光顯微鏡下觀察并作圖。根據分子實驗結果確認過表達/敲減慢病毒。在轉染細胞中加入2 μg/mL 嘌呤霉素清除未轉染的細胞及已轉染表達不正常的細胞。

1.2.4 RT-qPCR 檢測lncRNA RP11-521C20.3的表達取細胞樣品，按照說明提取總RNA，反轉錄得到cDNA，進行RT-qPCR 檢測，PCR 體系為：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，正反義鏈均各0.4 μL，cDNA 2 μL，加水至20 μL，95℃30sec，1 個循環進行預變性；95℃ 15sec，60℃30sec，40 個循環。數據采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism7300 SDS Software。lncRNA RP11-521C20.3 正向引物為5′CCCTGCTTTGGGGTTGT GA-3′，反向引物為 5′-GGAGGCTTTGTGGCTTGCT-3′。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0 處理分析數據，組間均數比較采用t檢驗。P<0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA RP11-521C20.3 重組載體構建及鑒定

以人胚腎293 細胞cDNA 為模板進行PCR 擴增得到全長lncRNA RP11-521C20.3 片段。載體pcSLenti-pA-MCS-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE 用SbfI/EcoRI 內切酶酶切后與lncRNA RP11-521C20.3 目的基因構建重組質粒，測序結果顯示，質粒基因序列與目的基因序列一致，見圖3。

圖3 lncRNA RP11-521C20.3 過表達重組質粒測序結果Fig.3 Sequencing results of lncRNA RP11-521C20.3 overexpressed recombinant plasmid

設計并合成了siRNA 核苷酸序列。將載體pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE 用AgeI 和EcoRI 雙酶切，與經過退火獲得的目的片段shRNA 連接并過夜，轉化DH5α 感受態細胞，涂板，挑菌，質粒抽提，測序鑒定，結果顯示插入的片段序列與設計合成的靶向lncRNA RP11-521C20.3 核苷酸序列一致，見圖4。

圖4 lncRNA RP11-521C20.3 敲減重組質粒測序結果Fig.4 Sequencing results of lncRNA RP11-521C20.3 knockdown recombinant plasmid

2.2 慢病毒包裝及滴度測定

對構建好的lncRNA RP11-521C20.3 重組載體進行包裝，包裝后的慢病毒轉染293T 細胞后，進行病毒滴度檢測。結果顯示：轉染72 h，100×熒光顯微鏡下可觀察到293T 細胞熒光數量明顯增加，見圖5。計算轉染時的細胞數、病毒稀釋倍數、稀釋后的病毒體積和每個基因組整合的平均病毒拷貝數，并計算病毒滴度。其中pcSLenti-pA-RP11-521C20.3-CMV-SFH-EGFPP2A-Puro-WPRE（RP11-521C20.3 過表達）滴度為：5.91E+08（Tu/mL），pcSLenti-pA-MCS–CMVSFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE（RP11-521C20.3 過表達對照）滴度為：6.64E+08（Tu/mL），pSLenti-U6-shRNA（RP11-521C20.3）-CMV-EGFP-F2APuro-WPRE（RP11-521C20.3 敲減）滴度為：5.34E +08（Tu/mL）。各慢病毒的滴度均大于1.0E +08（Tu/mL），能滿足后續實驗要求。

圖5 293T 細胞中慢病毒滴度檢測熒光圖片（100×）Fig.5 Fluorescent image of lentivirus titer detection in 293T cells（100×）

2.3 穩轉細胞株的篩選及鑒定

2.3.1 LncRNA RP11-521C20.3 過表達穩轉細胞株的篩選及鑒定將過表達lncRNA RP11-521C20.3 的慢病毒載體感染A549 細胞，在感染后24 h、48 h、72 h 在100×熒光顯微鏡下觀察轉染效率，并收集明場圖像和熒光圖像。結果表明lncRNA RP11-521C20.3 過表達的慢病毒感染A549 細胞72 h 后，細胞轉染效率大于90%，可以驗證lncRNA RP11-521C20.3 表達水平，見圖6。

圖6 LncRNA RP11-521C20.3 過表達慢病毒載體轉染A549 細胞明場圖像和熒光圖像（100×）Fig.6 LncRNA RP11-521C20.3 overexpressed lentiviral vector transfected A549 cells with bright field image and fluorescence image（100×）

為了驗證轉染后RP11-521C20.3 表達水平，轉染96h 后收集細胞樣品進行RT-qPCR 檢測。結果表明，OV-lncRNA RP11-521C20.3 組的lncRNA RP11-521C20.3 基因mRNA 表達量高于NC-lncRNA RP11-521C20.3 組（P<0.001），差異倍數為（20.43±0.69），見圖7。

圖7 RT-qPCR 檢測A549 穩轉株中lncRNA RP11-521C20.3 表達量Fig.7 The expression of lncRNA RP11-521C20.3 in stable A549 strain was detected by RT-qPCR

2.3.2 LncRNA RP11-521C20.3 敲減穩轉細胞株的篩選及鑒定分別用構建好的lncRNA RP11-521C20.3 敲減的慢病毒載體，感染A549 細胞，感染后24 h、48 h、72 h 在100×熒光顯微鏡下觀察轉染效率并采集明場圖像和熒光圖像。結果表明：lncRNA RP11-521C20.3 敲減的慢病毒感染A549 細胞72 h 后，細胞轉染效率大于90%，可以進行一步驗證lncRNA RP11-521C20.3 表達水平，見圖8。

圖8 RP11-521C20.3 敲減慢病毒載體轉染A549 細胞明場圖像和熒光圖像（100×）Fig.8 RP11-521C20.3 knockdown virus vector transfected A549 cells bright field image and fluorescence image（100×）

為了驗證轉染后lncRNA RP11-521C20.3 表達水平，轉染96 h 后收集細胞樣品進行RT-qPCR 檢測。結果表明，sh-lncRNA RP11-521C20.3 組的lncRNA RP11-521C20.3 基因mRNA 表達量低于sh-NC 組（P<0.001），差異倍數為（0.21±0.08），見圖9。

圖9 RT-qPCR 檢測A549 穩轉株中lncRNA RP11-521C20.3 表達量Fig.9 The expression of lncRNA RP11-521C20.3 in stable A549 strain detected by RT-qPCR

3 討論

lncRNAs 因其在調節多種生物過程中的作用而備受關注，其可以通過靶向mRNAs 調節不同的細胞過程，如增殖、凋亡、炎癥、遷移和上皮-間質轉化等，借此來調節慢性氣道疾病的發生和進展[14-15]。多研究[16-18]提示COPD 患者較健康者存在大量lncRNAs 差異表達，且在COPD 的相關發病機制如細胞增殖、細胞凋亡、炎癥、肺功能受損中具有重要作用。Tang 等[16]對COPD 和健康對照肺組織進行lncRNAs 基因芯片分析發現，差異表達的lncRNAs 有5，094 個，其中TUG1、BC038205、MEG3、LOC646329 和BC13059 顯著增加，SNHG5、LOC729178、LINC00229、LOC339529和PLAC 顯著減少，敲除lncRNA TUG1 可通過抑制纖維連接蛋白和α-SMA 的表達水平促進HFL1 和BEAS-2B 細胞增。Gu 等[19]發現lncRNA可能通過介導SIRT1/FoxO3a 和SIRT1/p53 信號通路，調控COPD 患者AEC II 的細胞衰老。CNVR_3425.1 通過抑制lncRNA FENDRR 水平，從而增加中國人群肺癌和COPD 的罹患風險[20]。lncRNA 在COPD 病理生理過程中的炎癥反應和肺功能受損中發揮重要關鍵作用，研究發現lnc-IL7R 表達降低不僅與氣道上皮細胞的炎癥有關，且能夠預測肺功能受損、COPD 惡化/加重[6]。Bi等[17]選取非COPD 吸煙者、COPD 吸煙者和健康不吸煙者的肺組織行全基因組lncRNAs 分析，發現誘導RNA175876|ENST00000554946 的表達可能影響炎癥反應的過程。運動對COPD 引起膈肌功能障礙的防治具有積極作用，劉等[21]對其進行進一步研究發現，運動可以降低COPD 誘導的lncRNA H19 表達，從而抑制lncRNA H19 通過靶向miR-181/PDCD4 軸促進與煙霧相關的慢性阻塞性肺病的進展。lncRNA CASC2 過表達可減輕香煙煙霧提取物誘導的細胞凋亡和炎癥反應，血清CASC2 在重度COPD 患者中過表達，且與非COPD 吸煙者相比，COPD 患者血清中CASC2 降低，與FEV1 呈正相關[22]。Lnc-NEAT1 的表達與GOLD 分期及IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α 水平呈正相關，在COPD 急性加重期患者中最高，其次是COPD 期患者和健康人群[18]。

慢病毒載體可以有效地將外源shRNA 或外源基因整合到宿主染色體中，長期表達目的基因序列，顯著提高目的shRNA 或目的基因的轉導效率，從而實現目的shRNA 或目的基因的穩定、長期表達[23]。本課題組前期發現，與非COPD 吸煙組相比，COPD 組的lncRNA RP11-521C20.3 表達下調，因此本研究擬構建lncRNA RP11-521C20.3 過表達及敲減的A549 細胞株，為研究lncRNA 在COPD 的凋亡機制中的具體機制作用做準備。AEC II 的凋亡，在COPD 的發病中具有重要作用，AEC II 的凋亡可造成肺泡正常結構破壞，肺氣腫形成[24-25]，本研究采用的A549 細胞為體外常用II 型肺泡上皮細胞模型，通過重組質粒載體制備了lncRNA RP11-521C20.3 過表達和敲減慢病毒，轉染A549 細胞后，成功獲得了lncRNA RP11-521C20.3 過表達和敲減的穩轉細胞株，最終用RT-qPCR 證明過表達組lncRNA RP11-521C20.3表達量較對照組上升，敲減組lncRNA RP11-521C20.3 則較對照組下降。為后續感染AECⅡ凋亡細胞模型，觀察lncRNA RP11-521C20.3 過表達或敲減對肺泡上皮細胞存活與凋亡的影響，從而進一步研究闡明lncRNA RP11-521C20.3-BMF信號通路調控COPD 中AEC Ⅱ凋亡的作用及機制提供部分實驗依據。