運動康復對心肌梗死大鼠心臟纖維化及心功能的影響

吳長勇，王 睿，保蘇麗，李銳潔，孫 煌，葉雨佳，徐 菲，彭云珠

（昆明醫科大學第一附屬醫院心內科，云南 昆明 650032）

心血管疾病是全球人類死亡的主要原因之一[1]，位于我國城鄉居民疾病死亡構成比首位，患病人數高達3.3 億，其中冠心病達1 139 萬，仍處于持續上升階段[2]。心肌梗死（myocardial infarction，MI）以高患病率、高住院率和高死亡率為特點，明顯增加了患者家庭和社會的經濟與精神負擔。目前冠狀動脈介入治療仍是MI 最主要的治療手段，隨著醫療器械和診治水平提高，MI患者生存率不斷提高，但術后的管理尤為重要。目前國內外指南均指出心臟康復是二級預防的重要指標[3-4]，且運動康復作為中心元素，是一種非藥物性和非創傷性的干預措施，通過減少活性氧產生及炎癥反應、增加梗死灶周圍血管生成，減少梗死面積和心臟纖維化，改善心功能，提高心血管疾病事件后的生存率[5]。研究表明，自噬是心血管疾病預后的重要調節機制，過度的自噬或自噬不足將導致心血管事件發生[6]。因此，本研究基于MI 大鼠模型，探究運動康復對心肌梗死大鼠心臟纖維化及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物選取3～4 個月、體重180～220 g 雄性SD 大鼠30 只，購于昆明醫科大學實驗動物學部[許可證號：SYXK（滇）K2020-0006]，其中構建MI 模型中因心室顫動和氣胸死亡2 只；術后1 周內因肺部感染死亡2 只；實驗過程中因MI 后心力衰竭死亡2 只，最終共納入24 只大鼠。分籠飼養（每籠3～4 只），保持恒定的12 h 光－暗周期，隨意進食和飲水。飼養1 周適應環境。本研究通過昆明醫科大學實驗動物中心及實驗倫理委員會批準（倫理批號：kmmu20221866）。

1.1.2 主要儀器設備大鼠輪轉式跑步機（YLS-15A，濟南益延科技發展有限公司）、超高分辨率小動物超聲成像系統（Vevo3100，FUJIFILM VisualSonics 公司）、小動物呼吸機（ALC-V8S，上海奧爾科特生物科技有限公司）、全息掃描顯微鏡（Pannoramic Confocal，丹吉爾3DHISTECH 公司）、透射電子顯微鏡（CM101，荷蘭Philips）。

1.1.3 主要試劑蘇木素（Sigma，H31316）、伊紅（Sigma，230251）、Masson 染色試劑盒（Solarbio，G1340）、Tunel 檢測試劑盒（ThermoFisher，C10617）。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建MI 模型建模前禁食4～6 h，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉，固定，連接小動物呼吸機和心電監護儀，呼吸機參數：潮氣量（3 mL/100 g）、呼吸頻率60～80 次/min、呼吸比2∶1。常規消毒鋪巾，開胸暴露心臟，6-0 絲線于左冠狀靜脈主干肺動脈圓錐下緣2～3 mm 處結扎LAD，建模成功的指標：肉眼可見結扎遠端心肌顏色變淺或變白，心電圖ST 段弓背向上抬高或T波倒置。探查胸腔無出血后逐層關胸。假手術組只穿針引線，余步驟同MI 組。大鼠自主呼吸恢復后撤離呼吸機，術后抗感染治療3 d。

1.2.2 實驗分組術后1 周大鼠處于穩定期，隨機分為4 組：MI-E 組（n=6）、MI-Sed 組（n=7）、Sham-E 組（n=6）和Sham-Sed 組（n=5）。

1.2.3 運動方案參照既往研究與前期預實驗共同制定[5]：適應性運動1 周：10 m/min×10 min，20 min/d，5 d/周；正式運動4 周：每次開始前以10 m/min×10 min 為熱身運動，再以20 m/min×7 min 和15 m/min×3 min 交替運動3 組，40 min/d，5 d/周。不運動組全程不參與運動訓練。

1.2.4 左心室結構與功能檢查運動訓練結束后1 d 行超聲心動圖檢查[7]。心前區褪毛，七氟烷吸入麻醉，固定，連接心電監測，心率控制為350～400 次/min，用MX250 探頭，頻率為20 MHz于左室長軸切面M 型測量左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室前壁收縮末期和舒張末期厚度（AWTs，AWTd）和左心室后壁收縮末期和舒張末期厚度（PWTs，PWTd），所有測量值均至少從3 個代表性周期中進行，并取平均值。計算左心室射血分數（left ventricular eject fraction，LVEF）和短軸縮短率（fraction shortening，FS），其中LVEF%=（LVEDD^2-LVESD^2）/LVEDD^2 ×100+[100-（LVEDD^2-LVESD^2）/LVEDD^2 ×100] × 0.15，FS%=（LVEDD-LVESD）/LVEDD ×100。

1.2.5 心臟標本制備和保存摘取心臟，修剪殘余組織及清洗殘血，沿結扎線以下從心尖到心底垂直方向橫切（即沿左室短軸切面橫切）取部分組織于4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋固定，用于HE、Masson 和Tunel 染色；取心肌梗死與正常組織交界區于電鏡液保存，用于透射電鏡檢測。

1.2.6 組織學檢測石蠟脫水及包埋固定，HE染色拍照后用3DHISTECH/Case Viewer 圖像軟件觀察心肌細胞損傷；Masson 染色分析心肌纖維化水平，通過Image J 圖像處理軟件計算心肌梗死面積比即膠原容積分數（collage volume fraction，CVF），CVF%=（藍色膠原纖維面積/心肌切面總面積）× 100%，可表示心肌纖維化水平；Tunel 染色觀察心肌細胞凋亡，每張切片取3 個高倍鏡視野，計算細胞凋亡指數=（陽性凋亡心肌細胞核數/總細胞核數）× 100%，并取平均值。

1.2.7 自噬小體檢測將組織切成1 mm×1 mm×1 mm 的小塊，通過固定（2.5%戊二醛和1%鋨酸溶液）、脫水（乙醇梯度和丙酮）、浸透（100%丙酮∶樹脂）、包埋（Epon 812 樹脂）、烘箱聚合（37℃12 h，45℃ 12 h，60℃ 48 h）步驟制作成50～70 nm超薄切片，使用醋酸雙氧鈾染色15 min、檸檬酸鉛染色10 min 染色干燥后在透射電鏡下觀察自噬小體和心肌細胞超微結構。

1.3 統計學處理

采用SPSS 25.0 統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示。行方差性檢測，若方差齊（P>0.05）則采用ANOVA 單因素方差分析，LSD-t檢驗比較兩兩之間差異；若方差不齊（P<0.05），則采用近似檢驗DunnettT3 進行統計推斷，以P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 分析4 組大鼠超聲心動圖指標

與Sham 組比較，MI 組AWTd、AWTs、PWTd、PWTs、LVEF 和FS 降低，LVEDD 和LVESD 增大，以MI-Sed 組明顯（P<0.05）；MI-E 組與MI-Sed組比較，LVESD、LVEF 和FS 差異有統計學意義（P<0.05）；Sham-E 組與Sham-Sed 組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 4 組大鼠超聲心動圖指標（）Tab.1 Parameters of echocardiography in four groups of rats（）

表1 4 組大鼠超聲心動圖指標（）Tab.1 Parameters of echocardiography in four groups of rats（）

組間比較，aP <0.05；與MI-E組比較，*P <0.05；與MI-Sed組比較，#P <0.05。

2.2 HE 染色結果

Sham 組心肌細胞結構完整和排列緊密有序，肌纖維方向走形一致，局部呈灶狀的炎性反應；MI 組出現不同程度的心肌細胞溶解，細胞結構模糊和邊界不清，伴炎性細胞浸潤，成纖維細胞增生，而MI-E 組心肌細胞損傷程度較輕，見圖1。

圖1 心臟組織HE 染色（×400）Fig.1 HE staining of heart tissue（×400）

2.3 Masson 染色結果

Sham 組心肌細胞排列緊密有序，局部呈灶狀纖維化改變；MI 組大鼠心肌細胞排列嚴重紊亂，心肌纖維化程度明顯增加。CVF%在4 組間兩兩比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其中MIE 組與MI-Sed 組、Sham-E 組與Sham-Sed 組相比較，CVF%降低（P<0.05），見圖2。

2.4 Tunel 染色結果

與Sham 相比，MI 組心肌細胞凋亡數量明顯增多（P<0.05）。而MI-E 組較MI-Sed 組心肌細胞凋亡數量減少（P<0.05）；Sham-E 組較Sham-Sed 組心肌細胞凋亡數量減少（P<0.05），見圖3和表2。

圖3 心臟組織Tunel 染色（×400）Fig.3 Tunel staining of heart tissue（×400）

表2 4 組大鼠細胞凋亡指數[（），%]Tab.2 A poptosis index in four groups of rats [（），%]

表2 4 組大鼠細胞凋亡指數[（），%]Tab.2 A poptosis index in four groups of rats [（），%]

組間比較，aP <0.05；與MI-E組比較，*P <0.05；與MI-Sed組比較，#P <0.05；與Sham-E組比較，+P <0.05。

2.5 透射電鏡檢測結果

Sham 組心肌細胞形態正常，線粒體結構完整，肌纖維束排列有序，視野下基本未見自噬小體。MI 組心肌細胞損傷嚴重，細胞結構紊亂，線粒體嵴中斷、排列紊亂，肌纖維束疏松紊亂，間質水腫，視野下可見自噬小體形成；而MI-E 組的自噬小體較MI-Sed 組稍多，見圖4。

3 討論

本實驗通過制作大鼠MI 模型，運動訓練5 周發現，與Sham 組比較，MI-E 組和MI-Sed 組大鼠AWT、PWT、LVEF 和FS 降低，LVEDD 和LVESD 升高，差異具有統計學意義，提示MI 后大鼠左心室結構與功能發生改變。但實驗也發現MI-E 組大鼠左室壁厚度和收縮功能較MI-Sed 組有所改善，表明運動在一定程度上能改善MI 大鼠的左心室功能，見表1。

MI 后心肌細胞發生一系列病理生理反應，包括炎癥反應、缺血再灌注損傷和活性氧增加、心肌細胞再生與增殖、線粒體與能量代謝、神經激素激活、左心室幾何構型改變、心肌肥厚以及心肌纖維化形成，其中主要表現為左心室重塑[8]。左心室重塑是指心臟通過調節心室大小、形狀和功能對機械、激素的不良適應。目前，雖然通過血運重建、抗動脈粥樣硬化、抗心力衰竭以及增加微循環供血治療的同時具有改善心肌纖維化和調控心肌細胞的生長的作用，但不具有特異性和持續性。MI 后的不良重塑是發病率和死亡率的重要決定因素，導致了心臟傳導系統異常、順應性降低及心功能障礙，導致心律失常、心力衰竭甚至死亡，明顯降低了生存率。

3.1 運動減少心肌細胞凋亡及梗死面積，改善心臟纖維化和泵血功能

運動是一種非藥物性和非創傷性的干預措施，作為心臟康復的中心元素，有益于降低心血管疾病的再住院率及死亡率，提高心血管疾病事件后的生存率。本實驗發現與Sham 組相比較，MI 組CVF%和細胞凋亡指數明顯增加，差異具有統計學意義，這表明MI 后大鼠心肌纖維化和心肌細胞凋亡明顯增加，但運動訓練5 周后MI-E 組的心肌細胞損傷程度、CVF%和細胞凋亡指數低于MI-Sed 組，而LVEF 和FS 高于MI-Sed 組，差異具有統計學意義，見圖2 和表2。Lai 等[9]研究表明游泳運動可降低TNF-ɑ水平、caspase-3 活化，增強BCL-2 蛋白表達，減少心肌細胞凋亡數量，改善心肌損傷和梗死面積。間歇性有氧運動4 周可降低Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維表達，抑制心肌間質膠原沉積，明顯降低MI 大鼠的LVSP 和CVF%，明顯提高±dp/dt 和LVEDP，改善左心室的心臟纖維化及心功能[10-11]。Li 等[5]研究發現MI 大鼠分別通過有氧、抗阻和振動運動訓練8 周后，LVIDd 和LVIDs 較對照組明顯降低，而LVEF 明顯升高，其中抗阻運動訓練改善左心室結構與功能效果更明顯，以上研究表明運動可改善MI 后左心室重塑，進一步改善心功能。

3.2 運動減少心肌細胞超微結構損傷，誘導心臟自噬發揮保護作用

本研究也發現運動訓練可減少MI 大鼠心肌細胞和線粒體損傷，適度誘導自噬水平發揮心臟保護作用，見圖4。研究表明，運動可雙向、動態調節心臟自噬水平及通量，清除損傷的線粒體，增加心肌細胞能量代謝，抑制心臟纖維化并改善心功能，發揮心臟保護作用[12-13]。MI 大鼠通過跑臺、抗阻等運動訓練的研究表明，運動可上調自噬，增強抗氧化能力，抑制氧化應激，改善心功能[5]。此外，急性運動可激活心肌細胞自噬，上調自噬水平，保護心臟免受有害的刺激[14]；長期運動可適當改變心臟自噬及其蛋白水平，延緩心臟病理性重塑，改善左心室結構與功能[15-16]。

總之，本實驗基于心肌梗死大鼠模型研究發現，運動訓練可改善左心室室壁厚度及心腔大小，減輕心肌細胞和線粒體損傷，降低膠原容積分數和心肌細胞凋亡程度，改善左心室收縮功能。此外，本實驗還發現運動可誘導心肌梗死后的心臟自噬發揮心臟保護作用。但本實驗局限于心肌梗死大鼠心臟組織學檢測，后續仍需深入探究運動調控左心室重塑的病理生理作用及相關分子機制，并結合臨床心臟康復模式，為運動康復提供一定的理論依據，這也是本課題組未來研究的重要方向。