hsa-let-7a-5p 調控牙周膜干細胞增殖及凋亡

張曄琳 ，馬麗婭 ，彭旭暉 ，楊禾豐 ，佘 睿

（1）昆明醫科大學口腔醫學院，云南 昆明 650500;2）云南省口腔醫學重點實驗室，云南 昆明 650500;3）永善縣人民醫院，云南 昭通 657300;4）昆明醫科大學口腔醫院牙體牙髓科，云南 昆明 650500）

牙周炎（Periodontitis）是指由菌斑生物膜引起的感染性牙周疾病，導致牙周支持組織破壞、牙周袋形成、牙槽骨吸收，最終牙齒松動脫落，是成年人失牙的重要原因之一[1]。牙周炎不僅危害人類口腔健康，還與心血管疾病[2]、糖尿病[3]等全身性疾病有關聯。牙周韌帶組織中存在的一類具有自我更新、多向分化潛能的間充質干細胞即牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs），在特定的誘導環境下，可誘導分化成為牙周韌帶組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織等[4]。在炎癥條件下，PDLSCs 的生理功能受到了影響[5]。因此，探究PDLSCs 生理功能的調控機制是研究牙周炎致病機理的重要環節之一。

microRNA 是一類長度約為22nt 的短序列非編碼RNA，其發揮作用的方式主要是通過在細胞胞質中與Argonaute 蛋白家族結合形成RNA 誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），該復合體通過降解和翻譯抑制兩條途徑作用于mRNA 介導基因沉默[6]。microRNA 參與了生物生長發育、細胞分化凋亡、腫瘤的形成轉移等，并可作為慢性牙周炎的潛在診斷生物標志物，影響其發生發展[7]。其中，參與調控細胞生長分化的重要miRNA（let-7a）似乎同樣參與了牙周炎的進展。然而，其在牙周炎中的具體作用尚未完全明確，研究表明在牙周炎患者的牙齦組織中let-7a 表達上調[8-9]，而let-7a-5p 在侵襲性牙周炎患者的唾液中下調[10]。因此，為了進一步闡明let-7a-5p 參與牙周炎進展的可能機制，本研究通過過表達/抑制PDLSCs 中let-7a-5p 的表達水平，探究其對PDLSCs 增殖及凋亡的影響，旨在為闡明其在牙周炎中的調控機制提供思路。

1 材料與方法

1.1 試劑及設備

α-MEM 培養基、胎牛血清（FBS）、I 型膠原酶、0.25%胰蛋白酶、PBS、雙抗、riboFECT CP Transfection Kit（銳博生物，中國）、Cell Counting Kit-8（美侖生物，中國）、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（美侖生物，中國）、Cell-Light EdU Apollo488 In Vitro Kit（銳博生物，中國）、RNAiso for Small RNA（TaKaRa，日本）、PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time，Takara，日本）、TB Green? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus，Takara，日本）、BCA 蛋白檢測試劑盒（Beyotime，中國）、細胞凋亡試劑盒（凱基，中國）、has-let-7a-5p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC合成自中國銳博生物科技有限公司。

培養瓶、培養板（Corning，美國）、35 mm 激光共聚焦培養皿（NEST，中國）、潔凈操作臺（蘇凈凈化設備公司，中國）、離心機、QuantStudioTM Real-Time PCR System、酶標儀、超低溫冰箱、二氧化碳培養箱（Thermo，美國）、倒置相差顯微鏡（Leica，德國）、細胞計數儀（Countstar IC1000，中國）、TECHNE 梯度PCR 儀（TECHNE，英國）、Quawell Q3000 微量紫外分光光度計（QUAWELL，美國）、高速冷凍離心機（Eppendorf，德國）、Agilent NovoCyte 流式細胞儀（Agilent Technologies，美國）、激光共聚焦顯微鏡（Nikon，日本）。

本實驗獲昆明醫科大學附屬口腔醫院醫學倫理會批準（批準號：KYKQ2020MEC020）。在患者知情同意的情況下，于昆明醫科大學口腔醫院口腔頜面外科收集因為正畸治療需要拔除的無疾病的年輕前磨牙，共15 顆。

1.2 研究方法

1.2.1 牙周膜干細胞的原代培養按照課題組前期研究方法分離培養牙周膜干細胞[11]。酶消法消化牙周膜組織塊，1 000 r/min 離心2 min，棄上清。將含有牙周膜組織塊的混懸液均勻接種于25 cm2培養瓶，并加入1 mL 20%FBS 的α-MEM 培養基，于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。待細胞生長至80%左右，胰酶消化，細胞傳代。

1.2.2 hsa-let-7a-5p 轉染以1×105個/孔的密度接種PDLSCs 于6 孔板中，待細胞融合至30%～50%時利用riboFECT CP Transfection Kit將50 nM miRNA mimic，50 nM miRNA mimic nc，100 nM miRNA inhibitor，100 nM miRNA inhibitor nc 轉染至PDLSCs 中，將培養板置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養以便進行后續實驗。

1.2.3 RT-qPCR 測定轉染效率轉染48 h 后利用RNAiso for Small RNA 提取miRNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，設計合成hsa-let-7a-5p 引物（合成自廣州銳博生物技術有限公司），RTqPCR 檢測基因表達，實驗結果用2-ΔΔCt法進行分析，U6 作為內參：forward primer（5′-3′）CTCGCT TCGGCAGCACA；reverse primer（5′-3′ ）AACGC TTCACGAATTTGCGT。

1.2.4 CCK-8 實驗以3×103個/孔的密度接種PDLSCs 于96 孔培養板中，待細胞貼壁后，更換不含FBS 的α-MEM 培養基饑餓過夜。次日，按分組對細胞進行轉染。細胞培養0～7 d，每日同一時間，按10 μL/孔加入CCK-8 工作液，37℃避光孵育2 h，孵育結束后通過酶標儀在波長為450 nm 處測定OD 值。

1.2.5 細胞周期以1×105個/孔的密度接種PDLSCs 于6 孔板中，待細胞貼壁后更換不含FBS 的α-MEM 培養基饑餓過夜。細胞融合至30%～50%時按分組進行轉染。48 h 后，收集細胞至離心管，PBS 洗滌，75%乙醇固定細胞4℃靜置過夜，固定完成后PBS 洗滌細胞，2 900 r/min離心5 min 沉淀細胞，每個樣品加入500 μL 染色工作液（按照說明書配置），避光、37℃下繼續孵育0.5 h。24 h 內于流式細胞儀下將激發波長設置為488 nm 對紅色熒光及光散射情況進行檢測。

1.2.6 EdU 實驗以1×105個/孔的密度接種PDLSCs 于激光共聚焦皿中，待細胞貼壁后，更換不含FBS 的α-MEM 培養基饑餓過夜。細胞融合至30%～50%時按分組進行轉染。24 h 后進行EdU 標記即按100 μL/孔更換50 μM EdU 培養基，繼續孵育24 h。24 h 后棄舊培養基，并使用PBS洗滌細胞2 次，按50 μL/孔的劑量加入已配置好的細胞固定液，室溫下孵育30 min。配置2 mg/mL的甘氨酸對過量醛基進行中和，PBS 洗滌細胞，含0.5% TritonX-100 的PBS 脫色搖床孵育，PBS洗滌細胞，按500 μL/孔加入1×Apollo 染色反應液，避光室溫搖床孵育30 min，0.5% TritonX-100 的PBS 清洗細胞3 次，DAPI 染色2 min，PBS 洗滌細胞3 次，濕潤狀態下利用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察采圖。

1.2.7 細胞凋亡接種PDLSCs 于6 孔板中，密度為1×105個/孔，待細胞生長融合至30%～50%時按分組進行轉染。48 h 后，無EDTA 胰酶消化，PBS 洗滌細胞2 次，每管依次加入500 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC、5 μL Propidium Iodide 重懸細胞，混勻，室溫避光孵育15 min，1 h 內于流式細胞儀下進行檢測。

1.2.8 let-7a-5p 靶基因預測及功能分析通過TargetScan、miRDB、miRTarbase 3 個網站搜索let-7a-5p 的預測靶基因，取三者交集的靶基因進行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物通路富集分析，得到let-7a-5p靶基因的相關細胞功能和信號通路，使用R language package gplots 繪制GO 和KEGG 富集氣泡圖。

1.3 統計學處理

實驗數據采用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統計分析及作圖。選用Mean±SD對數據進行描述，采用獨立樣本t檢驗進行單一變量2 組資料間比較，采用單因素方差分析進行多組資料間比較，單因素方差分析有差異后選用tukey’s mutiple comparisons test 進行兩兩比較。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 let-7a-5p 轉染效率測定

將let-7a-5p mimics、mimics nc、let-7a-5p inhibitor、inhibitor nc 轉染至PDLSCs 24 h 后，激光共聚焦顯微鏡下觀察到大量綠色熒光顆粒分布于PDLSCs 胞質中，見圖1A。RT-qPCR 定量分析轉染效率結果顯示，轉染48 h 后，let-7a-5p mimics 組的表達量為mimics nc 組的20.62 倍（P<0.01）。let-7a-5p inhibitor 組的表達量為inhibitor nc 組的0.23 倍（P<0.000 1），見圖1B。提示let-7a-5p 成功且有效轉染至PDLSCs。

圖1 let-7a-5p 轉染效率測定Fig.1 Transfection efficiency of let-7a-5p

2.2 let-7a-5p 抑制牙周膜干細胞增殖

將let-7a-5pmimics 及inhibitor 轉染進PDLSCs后，通過CCK8、EdU、細胞周期實驗探究let-7a-5p 對PDLSCs 增殖能力的影響。CCK-8 實驗結果顯示，第3～7 天，let-7a-5p mimics 組的增殖能力明顯低于mimics nc 組（第3 天P<0.001，第4～7 天P<0.000 1），見圖2A；而在第7 天時，let-7a-5p inhibitor 組細胞增殖水平高于inhibitor nc 組（P<0.05），見圖2B。EdU 實驗結果顯示，轉染48 h 后，mimics 組細胞增殖比例低于mimics nc 組（P<0.05），見圖2C；inhibitor 組細胞增殖比例高于inhibitor nc 組（P<0.01），見圖2D。細胞周期實驗中，mimics 組的S 期+G2/M 期比例低于mimics nc 組，見圖2E；inhibitor 組的S 期+G2/M期比例高于inhibitor nc 組，見圖2F。綜上結果提示let-7a-5p 抑制牙周膜干細胞增殖。

圖2 let-7a-5p 抑制牙周膜干細胞增殖Fig.2 let-7a-5p inhibits periodontal ligament stem cell proliferation

2.3 let-7a-5p 促進牙周膜干細胞凋亡

細胞凋亡實驗結果顯示，在let-7a-5p 轉染PDLSCs 48 h 后，與let-7a-5p mimics nc 組相比，let-7a-5p mimics 組細胞凋亡率增高，且差異具有統計學意義（P<0.01），見圖3A。與let-7a-5p inhibitor nc 組相比，let-7a-5p inhibitor 組細胞凋亡率降低，且差異具有統計學意義（P<0.01），見圖3B。表明let-7a-5p 促進牙周膜干細胞凋亡。

2.4 let-7a-5p 靶基因預測及功能分析

利用TargetScan、miRDB、miRTarbase 預測let-7a-5p 的靶基因后取三者交集，得到157 個靶基因，見圖4A，將這157 個靶基因進行GO 功能注釋，得到其主要參與蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶的調控、細胞周期等，見圖4B。對靶基因進行KEGG 信號通路富集分析，得到富集度最高的信號通路為PI3K-Akt 通路，表明let-7a-5p 的靶基因可能激活該通路影響細胞的代謝、增殖、凋亡，見圖4C。

圖4 let-7a-5p 靶基因及功能預測Fig.4 let-7a-5p target gene and function prediction

3 討論

牙周炎在世界范圍內患病率高達45%至50%[12]，目前尚未找到根治手段，傳統療法僅能控制炎癥進展，難以實現受損牙周組織再生[13]。探究牙周炎發病機制，尋找治愈方法一直以來都是口腔醫學領域的研究熱點。本研究聚焦于健康者與牙周炎患者口腔中表達水平具有差異的miRNA let-7a-5p 對PDLSCs 生理功能的影響，從miRNA 調控牙周組織中干細胞的角度探究牙周病的發病機制。

細胞瞬時轉染是外源基因進入真核細胞的重要研究方法之一。本研究通過轉染試劑包裹let-7a-5p mimics/inhibitor，使其順利進入細胞，實現了let-7a-5p 表達水平的上調和抑制。此種方法將模仿成熟miRNA 雙鏈體的mimics 和可與成熟miRNA 形成不可逆結合的inhibitor 遞送至胞質，即實現了miRNA 表達水平的調控[14-16]。省去了構建質粒等載體的繁瑣操作，也未采用慢病毒，無需擔憂病毒防護。

miRNA 是一類非編碼RNA，可發揮轉錄后調控作用，let-7 家族屬于其中的一大類，多項研究提出let-7 可作為腫瘤抑制因子[17]。作為細胞增殖途徑的主要調節因子，參與細胞周期和細胞分裂功能的多個基因可被let-7 直接或間接抑制[18]。例如let-7a-5p 在宮頸癌細胞中表達下調，其可調控TGF-β1/ TGFBR1/pSmad3 通路，抑制宮頸癌細胞增殖[19]。let-7a 還可通過靶向aurora-B 抑制骨肉瘤細胞生長[20]。let-7a 亦可通過下調USP32 表達抑制乳腺癌細胞增殖[21]。在非腫瘤細胞中例如人哮喘氣道平滑肌細胞，let-7a 可抑制其增殖而促進凋亡[22]。然而let-7a-5p 對PDLSCs增殖能力的影響卻鮮有報道，本研究初步證實了let-7a-5p 抑制PDLSCs 增殖，這與以往let-7a-5p 對細胞功能影響的研究結果一致。

本研究通過CCK-8、細胞周期、EdU 實驗檢測了let-7a-5p 對PDLSCs 增殖的影響。CCK-8實驗發現自第3～4 天起各組細胞增殖水平出現明顯差異，EdU 及細胞周期實驗在細胞干預早期（48 h）即可觀察到。這歸因于3 種實驗的檢測原理不同，CCK-8 實驗是通過線粒體內脫氫酶將WST-8 還原成高度水溶性的橙黃色甲臜產物，其顏色的深淺與正在進行代謝活動的細胞數量成正比[23]，能間接檢測細胞總體增殖效果。然而，EdU 實驗是在DNA 合成過程中用可被熒光探針標記的核苷酸類似物EdU 替代胸腺嘧啶參與DNA合成，反應細胞增殖情況[24]。細胞周期實驗是通過檢測DNA 含量以此計算處于有絲分裂各個時期的細胞百分比來測定增殖率[25]。EdU 和細胞周期實驗的檢測對象均為正在進行DNA 合成的細胞，因此在時間和空間上早于檢測細胞代謝產物的CCK-8 實驗。

細胞凋亡是一種不引起炎癥反應的程序性細胞死亡，可參與到維持免疫系統的穩態中，異常的細胞凋亡亦會影響疾病的發展[26]。半乳糖凝集素-1 可抑制LPS 誘導的PDLSCs 自噬和凋亡，促進牙周組織再生[27]。既往多項研究表明，let-7a可促進多種癌癥細胞凋亡。例如let-7a-5p 可以通過降低BZW2 的表達來抑制肝癌細胞的增殖，促進細胞凋亡[28]。Let-7a 靶向EZH2 抑制鼻咽癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[29]。而在本研究中得到let-7a-5p 促進PDLSCs 凋亡的結果，與以往研究一致。

本研究中還對let-7a-5p 靶基因及其相關細胞功能、信號通路富集進行了生物學信息分析。GO 功能注釋以及KEGG 通路分析二者結合來看，let-7a-5p 靶基因與PI3K-Akt 通路關系密切。PI3K-Akt 通路與細胞增殖、凋亡有關[30]，亦有研究表明，可通過調節PI3K-Akt 信號通路對牙周炎進行治療[31]。因此在后續的實驗探究中本課題組將以PI3K-Akt 信號通路為研究對象進行相關試驗，探究let-7a-5p 影響PDLSCs 生理功能的具體機制。

綜上所述，本研究證實了let-7a-5p 抑制PDLSCs 增殖，促進其凋亡。為miRNA 調控牙周炎的發展增加了理論基礎，也為利用干細胞療法治療牙周炎提供了借鑒意義。當然，本研究僅局限于let-7a-5p 對PDLSCs 增殖、凋亡的影響，為了更完善地闡釋其對牙周炎的調控作用，還需進一步探究let-7a-5p 對PDLSCs 其它生理功能的影響和炎癥條件下let-7a-5p 對PDLSCs 的影響。