鱖miR-25 的時空表達特征及其靶向核心生物鐘基因的預測分析

周 儀，米 鍇，馮曉麗

（昆明醫科大學基礎醫學院，云南 昆明 650500）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長約22 個核苷酸的非編碼RNA[1]，可通過加速mRNA 降解或抑制其翻譯，進而抑制許多基因的表達，導致蛋白質水平降低[2]。miR-25 屬于miR-106b-25 簇，其中還包括miR-93 和miR-106b。它在人類中定位于7 號染色體長臂（7q22.1）上的微染色體維持蛋白7（MCM7）基因的內含子上[3]。miR-25 在細胞增殖、分化、凋亡、氧化應激、炎癥等生物過程起著非常重要的調控作用[4]。當前關于miR-25 的研究主要集中在癌癥方面，其在胃癌、食管癌、乳腺癌等癌癥組織中的表達要高于其他正常的組織，因此miR-25 也被認為是一種誘癌基因[5-7]。王博等[8]的研究發現miR-25 在鱖肌肉組織中有一定的表達量，但其在鱖中的時空表達特征以及作用機制還未明確，因此本研究對miR-25 在鱖組織和胚胎中的表達水平進行初步分析。

生物節律是生物為了能夠適應以地球自轉一圈（約為24 h）為規律的晝夜交替變化，而進化出了一種內在的調控機制。機體的各項功能活動都會受到生物節律的影響，其紊亂會導致肥胖、糖尿病等代謝類疾病的增加[9]。急性的晝夜節律紊亂還可能導致大腦炎癥[10]。miRNAs 可與節律基因靶向結合從而參與生物節律的調控過程。有研究表明在小鼠中，miR-25-3p 能與節律基因Per的3’UTR 靶向結合，從而調節其震蕩[11]。可見，miR-25 在節律調控方面也有著重要的作用。在饑餓條件下，miR-21、miR-125b 在鱖（Siniperca chuatsi）肌肉組織中均表現出晝夜節律性，并且可能通過調節生物節律參與饑餓脅迫下的動態調節過程[12-13]，因此miRNAs 對魚類節律的調節具有重要的意義，但是其相關研究還較少，并且目前還未發現miR-25 在鱖節律方面的研究，因此本研究初步對miR-25 在鱖中的靶向核心生物鐘基因進行預測分析。

鱖屬于鱸形目、真鱸科、鱖屬，具有非常高的營養價值，是一種名貴的淡水經濟魚類。Jeffrey 等[14]的研究表明肌肉的代謝和生長會直接受到生物鐘的調節。正常的生物節律可以降低鱖炎癥以及代謝類疾病的發生，并且促進肌肉的正常發育和生長。為了探究miR-25 在鱖的時空表達特征與其對生物節律基因的調控作用，該研究采用實時熒光定量PCR 技術，分析了鱖不同組織和胚胎中miR-25 的表達差異性，同時預測其靶向核心生物鐘基因，用來初步揭示miR-25 對鱖生物鐘的影響，并且為后續研究miR-25 的生理作用以及在生物節律方面的調節機制提供一些參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RNA 提取（TRIzol）試劑、One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Kit 試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMII 均購自寶日醫生物技術有限公司。熒光定量PCR 儀購自美國伯樂公司（BioRad）。

1.2 樣品來源

本次實驗所用的鱖及胚胎均來自于湖南省水產科學研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 鱖不同組織取樣隨機挑選健康、體重相近（約為200 g）的幼齡鱖3 尾，將其麻醉后置于冰上進行解剖，收集其脾、心、腸、肝、腎、白肌以及紅肌組織，用液氮將組織迅速冷凍后置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 鱖不同時期胚胎取樣鱖人工繁殖與胚胎孵化技術參照劉希良等[15]的方法。收集培養至2細胞、囊胚早、囊胚晚、原腸早、原腸晚、神經胚、視泡期、尾芽期、腦分化期、肌效期、心搏期以及出膜期的鱖胚胎各30 枚，分別保存于1 mL Trizol 溶液中，用液氮將其速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3 總RNA 提取使用Trizol 試劑（中國，寶日醫生物技術有限公司）提取鱖組織和胚胎樣品的總RNA，將提取出的RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，用核酸檢測儀檢測其濃度及純度。

1.3.4 cDNA 合成cDNA 合成使用One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit 試劑盒（中國，寶日醫生物技術有限公司）。總反應體系為20 μL，具體操作過程及反應條件都按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 引物設計及合成按照鱖miRNA 數據庫[16]，使用 Primer 5.0 軟件對miR-25 的熒光定量 PCR 引物進行設計，見表1，熒光定量內參基因為U6基因。引物合成由北京擎科生物科技有限公司完成。

表1 實時熒光定量PCR 引物Tab.1 The Primer Sequences for RT-qPCR

1.3.6 熒光定量PCR熒光定量PCR 反應體系包括cDNA 模板1 μL、SYBR Premix Ex TaqTMII（中國，寶日醫生物有限公司）6 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，無酶水補足總體系12.5 μL。反應程序參照朱鑫等[12]的方法。每個樣品3 次重復。

1.3.7 靶向核心生物鐘基因預測本實驗采用的是TargetScan 預測軟件對miR-25 在鱖中的靶向核心生物鐘基因進行預測分析。TargetScan 能鏈接microRNA 相應靶基因的研究數據，并能提供靶基因3’UTR 的相關信息。在TargetScan（www.targetscan.org）中搜索獲得可能與miR-25 靶向互補配對的靶基因，從這些靶基因中篩選出與生物鐘調控有關的靶mRNA，再利用鱖基因組和轉錄組的數據庫獲得它們3’UTR 的序列，最后依照堿基之間的互補配對原則，查找這些靶mRNA 中是否有能夠與miR-25 結合的靶點。

1.4 統計學處理

根據所得到的內參基因以及目的基因的Ct 值，采用2-??Ct方法計算目的基因在不同樣品中的表達[17]。使用SPSS 16.0 對實驗數據進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），再采用Duncan 檢驗對樣本進行兩兩比較。分析結果表示為平均值±標準差（）。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-25 在鱖不同組織中的表達分析

采用RT-qPCR 技術檢測miR-25 在鱖各組織中的相對表達水平。miR-25 在所檢測的紅肌、白肌、心等7 個樣品組織中都有表達。在鱖紅肌中的相對表達量最高，與其他組織相比，差異有統計學意義（P<0.05）；在心肌中次之（P<0.05）；在脾、腎、腸以及肝中的相對表達量較低，差異無統計學意義（P>0.05），見圖1。

圖1 miR-25 在鱖不同組織中的相對表達量Fig.1 Relative expression of miR-25 in different tissues of Siniperca chuatsi

2.2 miR-25 在鱖不同發育時期胚胎中的表達分析

使用RT-qPCR 檢測miR-25 在處于12 個不同發育階段的鱖胚胎中的表達特征。miR-25 在所檢測的胚胎中均有表達，其在鱖胚胎的2 細胞期表達量最高，與其他時期胚胎相比，差異有統計學意義（P<0.05），并且隨著胚胎發育的進行，其表達量逐漸降低，且在原腸早期后，除神經胚期外各時期胚胎間差異無統計學意義（P>0.05），見圖2。

2.3 miR-25 靶向核心生物鐘基因預測分析

利用與鱖成熟序列互補配對的反向互補序列中的種子序列，在鱖基因組和轉錄組數據庫中尋找與miR-25 種子序列互補配對的靶基因序列。在數據庫中找到miR-25 種子序列的第2-8 位堿基能夠與節律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 的3’UTR 互補配對，見圖3、圖4。在TargetScan 數據庫中搜索發現，在斑馬魚中與miR-25 有結合位點的靶基因有5 087 個，并且在斑馬魚中，節律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 同樣有一段與miR-25 互補配對的堿基序列即靶點。由此推測在鱖和斑馬魚體內，miR-25 調控Arntl2、Nr1d2b的表達具有保守性，在鱖體內miR-25 可能通過對這2個核心生物鐘基因的靶向調控來參與鱖生物節律的調控。

圖3 miR-25 與Arntl2 結合靶位點預測Fig.3 The prediction of target site on target gene Arntl2 of miR-25

圖4 miR-25 與Nr1d2b 結合靶位點預測Fig.4 The prediction of target site on target gene Nr1d2b of miR-25

3 討論

組織內高表達的miRNA 往往發揮著重要的作用，本研究通過對miR-25 在鱖紅肌、白肌、心、肝、脾、腎、腸中的表達進行研究，發現其在這些組織中均有表達，并且在紅肌和心肌組織中呈高水平表達。Wang 等[18]研究表明，在斑馬魚中過表達的miR-25 可通過靶向FBXW7基因來促進心肌細胞的增殖，然而Li 等[19]研究表明，miR-25 在正常小鼠中過表達可通過靶點改變導致心肌細胞纖維化和凋亡。miR-25 在鱖心肌組織中的高水平表達，筆者推測miR-25 可能參與調控鱖心肌組織的生長、增殖或凋亡等生理過程，但其具體作用、功能及機制還需進一步研究。miR-25 在不同物種的心肌組織中可能發揮著不同的作用，但其對心肌組織產生的影響不可忽視，這凸顯了miR-25 對治療心臟相關疾病進一步研究的必要性。此外，在本研究中發現miR-25 在鱖紅肌組織中表達水平較高，表明其在鱖紅肌發育生長過程中同樣發揮著非常重要的調控作用，但其目前關于miR-25 在鱖紅肌中的功能及作用機理還未明確，有待進一步研究。

miRNA 的調控可以在胚胎發育過程中發揮重要作用。有研究表明，miR-449b 在綿羊精子中高表達，且能顯著提高綿羊早期胚胎的發育率[20]。miR-430 能使斑馬魚早期胚胎發生期間的母體mRNA 去烯化和清除加速[21]。此外，在小鼠和人類卵母細胞中，miR-451 的下調會影響著床前胚胎的發生[22]。在鱖中發現，miR-21 在其胚胎2細胞時期的表達水平最高，表明其具有母源性，并在胚胎早期發揮抑制靶基因的功能[12]。本研究通過對miR-25 在鱖胚胎的不同發育時期進行表達水平的檢測，發現miR-25 同樣在鱖胚胎的2細胞期的表達水平最高，并且隨著發育的進行，其表達水平不斷降低，說明miR-25 具有母源性，這也表明了miR-25 在鱖胚胎中以母源性因子的形式發揮著重要的作用，但其具體的作用機制還未明確。

在生物的晝夜節律調控過程中，miRNAs 可與靶向生物鐘基因結合而發揮重要作用。Park等[11]研究表明在小鼠中，miR-25-3p 在轉錄后水平調控時鐘基因Per2振蕩，參與晝夜節律的調控，并且可與miR-24-3p 協同作用來影響Per2的振蕩。本研究通過堿基互補配對原則，在鱖基因組和轉錄組數據庫中尋找與miR-25 種子序列互補配對的靶基因序列，結果表明節律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 的3’UTR 有miR-25 的靶點。此外，筆者通過TargetScan 數據庫查找發現，在斑馬魚中節律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 同樣有一段與miR-25 互補配對的堿基序列，這更加說明了在鱖中，miR-25 可能通過靶向結合Arntl2、Nr1d2b來參與其節律的調控，但miR-25 在鱖中的晝夜節律性以及調控機制仍需進一步研究。目前miR-25 在節律方面的研究極少，但從當前研究可看出，miR-25 在節律調控方面同樣有著重要的意義，進一步研究其在生物節律方面的作用可能對減少許多健康風險的增加有著積極的作用。

本研究利用實時熒光定量PCR 的方法首次對miR-25 在鱖中的時空表達特性進行檢測分析，并且對其靶向核心生物鐘基因進行預測分析。結果表明，miR-25 在鱖不同組織以及不同發育階段中的表達具有差異性，在鱖心肌、紅肌以及胚胎發育早期可能具有重要的調控作用。通過靶基因預測分析，推測miR-25 可通過調控節律基因Arntl2、Nr1d2b的表達，從而參與鱖生長發育等生理過程的調節。本研究通過對miR-25 在鱖中的時空表達特征以及靶向核心生物鐘基因進行初步研究，為后續研究其生理功能以及調控晝夜節律從而預防相關疾病提供參考依據。