扁塑藤素通過調節自噬對口腔鱗狀細胞癌細胞CAL-27 增殖的影響

楊詩媛 ，張 昊 ，胡圖強

（1）湖北醫藥學院口腔醫學院，湖北 十堰 442000;2）十堰市人民醫院/湖北醫藥學院附屬人民醫院口腔醫學研究所，湖北 十堰 442000）

口腔癌，主要為口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），是第八大最常見的癌癥類型，僅在2018 年就有17 萬人死亡，新增病例超過35 萬例[1-2]。OSCC 不僅復發率高、侵襲性強，還易對傳統化療藥物產生耐藥性[3]。目前手術切除為主，放射治療和化學治療聯合為輔仍然是口腔鱗狀細胞癌的首要治療策略。盡管存在廣泛的多種治療模式，但是OSCC 5 a 總生存率仍然比較低，僅占50%～60%[4]。近幾年來，免疫系統在OSCC 的發展、侵襲、進展和轉移中起著重要作用[5]，因此需要一種新的治療模式，例如免疫靶點以及天然化合物與常規化療藥聯合使用等，以獲得最佳治療效果。綜上所述，探索OSCC 發生的生物分子機制、找尋新的治療關鍵、開發更有效治療方案、提前預防OSCC 發生從而降低患者死亡率迫在眉睫。

自噬是介導各種細胞代謝物遞送到溶酶體進行降解和回收的主要機制，能維持蛋白質穩態以及細胞器的完整性，其功能對于細胞穩態和細胞活力至關重要[6]。許多研究表明，自噬在不同的階段調控者腫瘤的成長、發展，在癌癥發展的早期階段，它阻止腫瘤啟動，但在完全發育的成熟腫瘤中，它則保護腫瘤細胞免受各種應激刺激[7-9]。在癌癥發展的晚期階段，由于癌細胞比正常細胞有更高的生物能量及營養需求，癌細胞通過誘導自噬在低營養和缺氧條件下存活[10]。自噬可以同時起到抑制腫瘤和促進腫瘤的作用，通常取決于腫瘤所處階段和突變背景[6]。

近些年來，草藥、天然化合物等作為單一療法或與常規化療藥物聯合使用，目前研究表明其在治療各種癌癥方面發揮著一定的作用。扁塑藤素是一種從雷公藤科和馬齒莧科中提取的醌甲酰胺類三萜類化合物[11]，可抗氧、抗炎、抗菌[12]，在結腸癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等許多癌癥種類中展現了強大的抗癌活性[13-15]。腫瘤相關抑制機制包括細胞周期停滯、蛋白酶體活性誘導的細胞凋亡和線粒體功能障礙等[16]。對于扁塑藤素在OSCC 中的抗癌機制，現在國內外關于這個問題的研究相對較少。

本實驗以口腔鱗狀細胞OSCC 細胞系CAL-27 為研究對象，將OSCC 細胞用不同濃度梯度的扁塑藤素干預，通過CCK-8 細胞增殖、集落形成實驗、蛋白質印跡法等一系列實驗探究扁塑藤素對OSCC 細胞增殖與自噬機制的關系，并探索其生物分子作用機制，為其應用于臨床提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人口腔鱗癌CAL-27 購自中國豐暉生物；扁塑藤素中國源葉生物；雷帕霉素購自中國MCE；高糖培養基、胰蛋白酶、胎牛血清FBS 購自美國Hyclone；酶標儀購自中國雷杜RT-6100；MAP1-LC3B、BECLI1、PCNA、蛋白印跡系統購自美國ChemiDocXRS+，BIO-RAD、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒購自中國Boster Bio；CCK-8 檢測試劑盒、RIPA 蛋白裂解液（強）、PMSF（100 mM）、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）、電化學發光液（ECL）購自中國上海碧云天生物。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養將人口腔鱗癌細胞系CAL-27（培養條件10%胎牛血清、10%FBS、1%雙抗的高糖DMEM 培養基）置于37℃、95%空氣、5%CO2細胞培養箱中，細胞長滿皿底面積80%～90%需進行傳代，第1 次傳代比例為1∶2。

1.2.2 CCK-8 檢測扁塑藤素對口腔鱗狀細胞癌的增殖作用在96 孔細胞培養板中按8 000 個細胞/孔接種對數生長期的CAL-27 細胞，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L（后續濃度分組相同）濃度扁塑藤素的培養液，每組5 個平行重復。設置扁塑藤素作用于Cal-27 細胞時間為24、48、72 h，每個細胞培養孔中，培養基與CCK-8 溶液比例為9∶1 混合后培養，酶標儀測各組OD 值，分析處理數據，繪制增殖曲線。根據細胞增殖抑制率公式計算細胞增殖抑制率，得出扁塑藤素干預OSCC 細胞的半抑制濃度IC50，基于此設置合適的扁塑藤素濃度范疇。

1.2.3 扁塑藤素對增殖相關蛋白表達的影響在6 孔板中接種CAL-27，以上述濃度扁塑藤素處理24 h，細胞在RIPA 緩沖液中溶解，并加入蛋白酶抑制劑，在冰上溶解30 min，冰浴、離心、提取、測濃度、定量、煮沸、變性；轉膜、封閉、孵育一抗（PCNA，1∶2 000），4℃過夜；孵育二抗（羊抗鼠，1∶5 000），內參蛋白β-actin。將ECL 顯色試劑A 液與B 液1∶1 充分混合，均勻加于膜上，于凝膠成像系統中顯影，ImageJ 軟件完成數據分析。實驗重復3 次。

1.2.4 細胞集落形成檢測不同濃度扁塑藤素處理人鱗狀細胞的增殖能力在6 孔板中按1 000 個/孔細胞接種狀態良好的CAL-27 單細胞懸液，與扁塑藤素聯合處理。按上述扁塑藤素濃度分組每3d 換一次液，待生長2 周后可見集落時終止培養，干燥固定、染色，倒置顯微鏡下記錄細胞集落數目并拍照留存。

1.2.5 扁塑藤素處理Cal-27 后總蛋白的提取和Western Blot 檢測相關自噬通量方法同“1.2.3”，一抗（MAP1LC3B，1∶500；BECLIN1，1∶5 000），二抗（羊抗兔：1∶5 000）。

1.2.6 CCK-8 法檢測雷帕霉素（RAPA）以及RAPA聯合扁塑藤素對Cal-27 細胞增殖抑制的影響為進一步研究自噬對扁塑藤素調節CAL-27 細胞增殖抑制的影響，本實驗分別設置0、62.5、125、250、500、1 000 nmol/L RAPA 濃度培養液，方法同“1.2.2”，使雷帕霉素干預24 h，計算各組細胞增殖抑制率。根據細胞增殖抑制率，計算分析雷帕霉素作用于OSCC 細胞的最小濃度，并根據最小雷帕霉素濃度設置后續實驗雷帕霉素的濃度。

1.2.7 細胞集落形成檢測RAPA 聯合扁塑藤素處理CAL-27 細胞后的增殖能力方法同“1.2.4”，分別設置0、0.6 μmol/L pristimerin、0.6 μmol/L Pri +125 nmol/L RAPA、125 nmol/L RAPA 組，檢測細胞增殖能力。

1.2.8 RAPA 聯合扁塑藤素處理CAL-27 細胞后總蛋白的提取和Western blot 檢測相關自噬通量的表達情況方法同“1.2.3”，分組同“1.2.7”，加入一抗（MAP1LC3B，1∶500；BECLNI1，1∶5 000；PCNA，1∶2 000），二抗（羊抗兔，1∶5 000；羊抗鼠：1∶5 000）。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 扁塑藤素對人口腔鱗狀細胞癌增殖活性的影響

2.1.1 不同濃度的扁塑藤素對人口腔鱗狀細胞癌增殖活性的影響檢測扁塑藤素對人口腔鱗狀細胞癌系CAL-27 作用的結果，CCK-8 結果顯示：扁塑藤素抑制CAL-27 細胞的增殖，并且這種抑制呈時間-濃度依賴作用，相同時間段內，當扁塑藤素濃度的升高，扁塑藤素對CAL-27 細胞系的抑制率也在不斷增強，見圖1A。且在同一濃度處理后，培養時間增加，CAL-27 細胞系的細胞抑制也更加顯著（P<0.05），見圖1B。根據結果計算得出CAL-27 的半抑制濃度約為（0.69±0.16）μmmol/L。根據半抑制濃度分設各組扁塑藤素濃度：0 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1.0 μmol/L。

圖1 扁塑藤素抑制口腔鱗狀癌Cal-27 細胞增殖Fig.1 Pristimerin suppresses proliferation of oral squamous cell carcinoma cell

2.1.2 不同濃度的扁塑藤素對人口腔鱗狀細胞癌增殖能力的影響通過集落形成實驗檢測不同濃度扁塑藤素處理CAL-27 細胞24 h 后培養14 d 增殖的長期毒性作用。結果顯示：與對照組比較，CAL-27 各實驗組的的細胞集落形成逐漸減少，并且抑制作用隨著扁塑藤素濃度增加而受到增強，1.0 μmol/L 組的抑制作用更為明顯，見圖2。提示扁塑藤素對人口腔鱗癌CAL-27 細胞系的長期細胞抑制同上述結果相一致，存在劑量-時間關系。

圖2 扁塑藤素對口腔鱗狀癌CAL-27 細胞克隆形成的影響Fig.2 The effect of Pristimerin on clonal formation of oral squamous cell carcinoma cell

2.1.3 扁塑藤素對增殖相關蛋白表達的影響PCNA是增殖相關蛋白。為進一步說明扁塑藤素對細胞增殖的影響，本實驗按2.1.1 分組的扁塑藤素分別處理CAL-27 細胞24 h，收取細胞蛋白后進行Western blot 實驗。結果顯示：當扁塑藤素濃度升高時，細胞增殖蛋白指標PCNA 蛋白相較于對照組表達量下調，但0.4 μmol/L 組蛋白表達量相較于0.2 μmol/L 組有所上調，提示扁塑藤素可以明顯抑制CAL-27 細胞增殖（P<0.05），促使細胞活性下降，見圖3。

圖3 扁塑藤素抑制相關增殖指標PCNAFig.3 Effect of Pristimerin on PCNA expression

2.2 扁塑藤素誘導口腔鱗狀細胞癌細胞發生自噬

運用Western blot 檢測不同濃度扁塑藤素處理CAL-27 細胞24 h 后，自噬相關蛋白BECLIN1、LC3B-II、LC3B-I 的表達量。結果顯示：實驗組顯示出，BECLIN1 蛋白的表達水平整體低于對照組，但0.4 μmol/L 組相較于對照組略有上升，LC3B-II/LC3B-I 蛋白的表達水平低于對照組，且隨著扁塑藤素濃度的升高，BECLIN1 和LC3BII/LC3B-I 蛋白的表達水平下調（P<0.05），提示扁塑藤素通過抑制CAL-27 細胞的自噬來抑制細胞的增殖，見圖4，說明CAL-27 的自噬可以被扁塑藤素激活，提示扁塑藤素抑制CAL-27 細胞的自噬。

圖4 扁塑藤素抑制自噬相關自噬蛋白BECLIN1、LC3B-IILC3B-IFig.4 Pristimerin inhibits apoptosis：BECLIN1and LC3B-II/LC3B-I protein expression

2.3 自噬激活劑雷帕霉素可激活扁塑藤素誘導的自噬機制

2.3.1 扁塑藤素聯合RAPA 對人口腔鱗狀細胞癌CAL-27 增殖活性的影響為進一步研究自噬對扁塑藤素調節CAL-27 細胞增殖抑制的關系，通過CCK-8 法檢測RAPA 各濃度組62.5、125、250、500、1 000 nmol/L 以及0.6 μmol/L 扁塑藤素聯合RAPA 處理CAL-27 細胞24 h 后的OD 值。結果顯示:不同濃度自噬激活劑RAPA 的細胞活力與對照組相比（未加入RAPA 組），RAPA 各分組的抑制率相較于空白組來說都呈出現了減低，提示RAPA 對CAL-27 細胞存在一定的影響，RAPA 可抑制CAL-27 細胞增殖，而且其抑制率隨RAPA濃度上升稍有增加（P<0.001），見圖5A。隨后，通過細胞增殖實驗檢測0.6 μmol/L 扁塑藤素聯合各濃度的自噬激活劑RAPA 處理CAL-27 細胞24 h 后的細胞活力，結果顯示：與0.6 μmol/L 扁塑藤素組相比，62.5 nmol/L RAPA 聯合0.6 μmol/L扁塑藤素組相比有統計學意義（P<0.05），見圖5B，說明加入自噬激活劑RAPA 可明顯提高細胞活力。細胞集落形成實驗也與上述一致，見圖6。提示RAPA 能夠激活細胞自噬，從而減小扁塑藤素對細胞的抑制作用，本研究選擇對CAL-27 細胞影響小的62.5 nmol/L RAPA 濃度進行后續實驗。

圖5 自噬激活劑RAPA 對口腔鱗狀癌細胞的影響Fig.5 Effect of autophagy activator RAPA on oral squamous carcinoma cells

圖6 扁塑藤素聯合雷帕霉素處理對口腔鱗狀癌CAL-27 細胞克隆形成的影響Fig.6 The effect of Pristimerin combined with RAPA on clonal formation of oral squamous carcinoma cells

2.3.2 扁塑藤素聯合RAPA 處理CAL-27 細胞24h 后細胞自噬的作用WB 結果顯示在CAL-27 細胞中，聯合處理組均顯示出BECLIN1 和LC3B 蛋白的表達水平高于對照組，扁塑藤素聯合RAPA 組相較于單純使用扁塑藤素組，BECLIN1 和LC3B 蛋白的表達水平均有上調（P<0.05），見圖7。提示RAPA 激活了CAL-27 的自噬，扁塑藤素通過抑制CAL-27 細胞的自噬來抑制細胞的增殖。

圖7 雷帕霉素可激活扁塑藤素誘導的自噬機制Fig.7 RAPA can activate the autophagy mechanism induced by Pristimerin

3 討論

口腔鱗狀細胞癌作為頭頸部鱗狀細胞癌中常見的類型之一，它起源于口腔黏膜上皮，由暴露于煙草致癌物、感染人乳頭瘤病毒和飲酒過度誘發。目前包括局部及全身治療，局部有手術、放射治療；全身有靶向、生物、免疫治療等。但其5 a 生存率較低，對于患者來說存在經濟負擔與面部畸形的雙重風險。

抗癌研究熱點之一的中草藥在醫學領域以及人類健康保健中持續發揮著重大作用。有較多研究表明扁塑藤素可對多種惡性腫瘤發揮發病、進展發揮抑制作用。扁塑藤素對乳腺癌細胞周期有抑制作用并且能引發細胞凋亡和自噬，可降低乳腺癌細胞在體外和異種移植物在體內的生長[18]；肺癌易發生化療耐藥，當順鉑聯合扁塑藤素時，其可增強肺癌細胞敏感性[19]；扁塑藤素可能通過調控 MEK/ERK 信號通路相關蛋白的磷酸化水平抑制膀胱癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[20]。因此，探討扁塑藤素對人口腔鱗狀細胞癌增殖潛力的影響及相關作用機制，是本研究的重點。本課題組研究發現扁塑藤素抑制口腔鱗癌細胞CAL-27 增殖，CCK-8 結果分析扁塑藤素與CAL-27 細胞呈時間-濃度依賴關系，細胞集落形成實驗結果也與上述一致。

迄今為止，有研究指出自噬參與了以下幾種疾病，包括肌病、神經退行性疾病、傳染病、自身免疫性疾病、心臟病、細胞死亡、衰老和癌癥[21]。其中，自噬蛋白水平在調節腫瘤細胞生長和進展方面起著重要作用[22]。LC3 屬于ATG8 家族，通過ATG3B 轉化為其胞質亞型LC1，再與磷脂酰乙醇胺（PE）結合，轉化為膜結合形式LC3 II[23]，故LC3 蛋白可以直接監測自噬活性[24]；VPS34 及其結合物Beclin1 和VPS15 可靶向調節自噬，可促進自噬小體形成[25]，因此LC3 與Beclin1 蛋白都是自噬相關特異性指標。為了探尋扁塑藤素對OSCC 中Cal-27 細胞自噬機制的關系，本實驗運用扁塑藤素分別在調控相關自噬通量，激活自噬對扁塑藤素調控OSCC 中CAL-27 細胞發生增殖抑制作用以及對相關自噬通量的影響等3 個方面進行檢測，結果顯示，扁塑藤素可顯著減少CAL-27 的LC3-Ⅱ等自噬相關蛋白的表達量。這提示扁塑藤素調節CAL-27 細胞自噬是其抑制OSCC 增殖的關鍵機制之一。

目前各種合成的自噬調節劑，如絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的哺乳動物靶點雷帕霉素（mTOR），已被確定為治療癌癥的首選藥物，包含mTORC1、mTORC2 兩種復合物，而mTORC1 被雷帕霉素（RAPA）抑制后從而啟動自噬，是自噬的強誘導劑[26]。本文檢測了相關自噬通量BECLIN1、LC3B-II/LC3B-I 表達量，發現扁塑藤素聯合RAPA 相較于僅用扁塑藤素處理CAL-27 細胞其表達量有所上調，表明RAPA 可以逆轉扁塑藤素對CAL-27 細胞的增殖抑制，即激活CAL-27 自噬，且自噬流通暢。最后檢測了增殖指標PCNA，這與上述結果也是一致的。進而證明，扁塑藤素通過抑制OSCC 自噬導致細胞增殖活性減弱。

綜上所述，扁塑藤素可以抑制CAL-27 細胞的增殖，且隨著扁塑藤素濃度的升高，抑制作用越明顯，這可能與其下調自噬相關基因BECLIN1、LC3B-II、LC3B-I 的表達相關。本研究初步探討了扁塑藤素對口腔鱗狀細胞癌細胞的抑制作用及其自噬機制，這可能是一種潛在的抗癌策略，但本實驗細胞系單一、缺乏動物實驗佐證，還需大量的自噬檢測技術支持驗證。