化痰散結法對ApoE-/-小鼠血脂及動脈粥樣硬化的影響*

李賀，姬寒蕊，杜雅薇，吳圣賢

（1．山東中醫藥大學第一臨床醫學院，濟南 250355；2．北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

動脈粥樣硬化（AS）是一種慢性多因素血管性疾病，是心腦血管疾病的重要病理基礎[1]。頸動脈粥樣硬化與冠狀動脈粥樣硬化分別是AS 在頸動脈和冠狀動脈的體現，與缺血性腦卒中、急性冠脈綜合征的風險和嚴重程度直接相關[1-3]，大幅增加了居民病死率，已成為影響居民身體健康的主要因素，消退AS 斑塊對維護居民的健康和減輕社會醫療負擔具有重要意義。高脂血癥是AS 的主要危險因素，降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）是改善AS，預防心腦血管疾病并發癥的關鍵手段[4-5]。中藥有著多靶點、副作用小的優勢，或能成為改善AS 的重要替代或補充方案。內消軟脈湯2 號是在課題組“脈生痰核”理論[6-7]指導下，以化痰散結為主要治法，選用大量的化痰散結藥化裁而來的自擬方劑，內消軟脈湯2 號在臨床上治療頸動脈粥樣硬化及高脂血癥獲得了良好療效。前期實用性隨機對照試驗發現，該方可使頸動脈橫切斑塊厚度平均下降11．48%[8]，但其內在機制尚不明確。故研究以內消軟脈湯2 號為基礎治療方案，通過建立ApoE-/-小鼠的AS 模型，探究內消軟脈湯2 號對AS、高脂血癥的改善效果，并初步探究其作用機制。

1 材料及方法

1.1 動物6 周齡雄性ApoE-/-小鼠30 只，基因背景為C57BL/6J，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2020-0004。實驗動物飼養于北京中醫藥大學東直門醫院SPF 級標準化實驗動物室，環境溫度為22 ℃，相對濕度45%～55%，12 h 光照與12 h 黑夜循環，動物自由進食水。

1.2 藥劑與試劑內消軟脈湯2 號顆粒劑組成：靈芝30 g、玄參15 g、丹參15 g、黃連9 g、浙貝母9 g、生牡蠣9 g、當歸9 g、制乳香9 g、制沒藥9 g，本次實驗所需顆粒劑由東直門醫院顆粒劑藥房全成分提取制作。磷酸鹽緩沖液粉末（pH 7．3，中杉金橋公司）；4%多聚甲醛溶液（東都凱源有限公司）；中性快干膠；油紅O 染液；蛋白酶抑制劑；二奎啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒；丙烯酰胺；三羥基氨基甲烷Tris 堿；甘氨酸；1 mol/L Tris-HCl（pH 7．4）緩沖液；1．5 mol/L Tris- HCl（pH 8．8）緩沖液；1 mol/L Tris-HCl（pH 6．8）緩沖液；吐溫-20；SDS；過硫酸銨（普利萊公司）；TEMED（Sigma 公司）；預染蛋白Maker（普利萊公司）；麗春紅染色液（普利萊公司）；硝酸纖維素膜（NC 膜）（普利萊公司）；封閉專用脫脂奶粉（普利萊公司）；蛋白免疫印跡法（Western Blot）專用雜交袋（普利萊公司）；發光液（碧云天公司）；EASYBIO 易杰膜（易杰公司）；GADPH 抗體（Abcam 公司）；解偶聯蛋白1（UCP1）抗體（Abcam 公司）；LDLR 抗體（Abcam 公司）；戊巴比妥鈉（北京東都凱源生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器動物恒溫飼養箱（北京福意聯公司）；制冰機（型號：MV600，Scotsman 公司）；多功能酶標儀（BIO-RAD 公司）；光學顯微鏡（Olympus BX60，Olympus 公司）；-20 ℃冰箱（德國Siemens 公司）；精密電子稱（JA1003N，上海精密科學儀器有限公司）；電泳槽及電泳儀（北京六一儀器廠）；塑料薄膜封口機（SF-200/250 型，溫州市興業機械設備有限公司）；低溫離心機[5424/5424R（FA-45-24-11，Eppendorf 公司]。

1.4 模型制備、分組和干預30 只ApoE-/-小鼠常溫適應性飼養1 周后，隨機將小鼠平均分為3 組，每組10 只，分別為對照組、內消軟脈湯2 號低劑量組、高劑量組。每組均給予高脂飲食（配方：21%脂肪+0．15%膽固醇，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司）喂養16 周，以建立AS 模型[9]。各組在造模之初分別給予蒸餾水灌胃、內消軟脈湯2 號低劑量[2．1 g/（kg·d）]灌胃、內消軟脈湯2 號高劑量[4．2 g/（kg·d）]灌胃，以蒸餾水灌胃組作為對照，干預16 周后取材，取材前禁食水12 h。干預期間各組小鼠繼續接受高脂飲食（HFD）喂養。鑒于環境溫度對脂解作用有明顯影響，本研究將采用環境動物飼養箱，全程控制并恒定飼養溫度。

實驗中所有動物飼養條件以及動物實驗操作均嚴格遵守北京中醫藥大學東直門醫院重點學科實驗室動物實驗倫理委員會制定的制度規定。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 主動脈AS 斑塊采用油紅O 染色及改良Movat 五色套染的方法進行觀察。小鼠在處死前保持空腹8 h。使用生理鹽水配制好6．7 mg/mL 的戊巴比妥鈉，以0．01 mL/g 小鼠體重的劑量進行腹腔注射，待麻醉成功后進行手術處理，自心臟開始，小心地將主動脈于脊柱進行剝離，將小鼠主動脈與心臟一起取下，放于4%的多聚甲醛固定液中加以固定。根據油紅O 染液試劑盒說明書步驟進行整根動脈染色。在主動脈根部切下大約5 mm 的長度并將其與心臟組織分離并置于石蠟組織的包埋盒中，通過自動脫水石蠟組織制作儀、石蠟切片器進行血管的石蠟切片制備，后按照改良Movat 五色套染的試劑盒說明書進行染色。

1.5.2 血脂4 項采用摘眼球取血法采集小鼠血液，室溫靜置1 h，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8．4 cm，收集上層血清。每只小鼠取200～300 μL 血清，采用生化法檢測TG、LDL-C、HDL-C及總膽固醇（TC）。

1.5.3 肝臟脂肪變性程度采用油紅O 染色的方法進行觀察。取小鼠新鮮肝臟置于軟塑瓶蓋中，并添加適當的OCT 包埋劑，之后再把小盒慢慢地放入液態氮里，當組織結冰成小塊狀，將已結冰的組織置入恒冷箱切片機中進行冷凍切片制備。按照油紅O 染液試劑盒說明書步驟進行染色。

1.5.4 肩胛脂肪組織活化情況采用蘇木素-伊紅（HE）染色的方法進行觀察。將小鼠肩胛脂肪組織取出，置于石蠟組織的包埋盒中，通過自動脫水石蠟組織制作儀、石蠟切片器進行血管的石蠟切片制備，進行HE 染色。

1.5.5 組織病理學圖片采集通過對各樣品的病理染色，得到了血管斑塊區域的切片、肝臟切片、脂肪組織切片等。采用高倍顯微鏡對切片進行拍照，在每張切片上觀察到多個區域后，確定最接近平均水平的區域進行拍照并保存圖像，各個圖像的全部參數都經過均一化處理。

1.5.6 肩胛脂肪組織UCP1 及肝臟低密度脂蛋白受體（LDLR）的表達采用Western Blot 法檢測小鼠肩胛脂肪組織UCP1 及LDLR 的表達。將組織蛋白裂解液加入各組小鼠的肝臟及肩胛脂肪組織中，快速研磨，置冰上20 min，然后置于4 ℃低溫離心機中、12 000 r/min 離心10 min，離心半徑8．4 cm，取上清，采用BCA 法測定組織蛋白含量后加上樣緩沖液，置于沸水中煮5 min；分別取40 μg 蛋白量的組織總蛋白樣品上樣，80 V 濃縮膠電泳，100 V 分離膠電泳；采用半干電轉移儀進行蛋白質的電轉移，恒流30 mA，90 min，5%TBS-T 脫脂奶粉封閉1 h，用UCP1 和LDLR 一抗稀釋后孵育過夜（UCP1 抗體稀釋倍數：1∶500；LDLR 抗體稀釋倍數：1∶500），二抗稀釋后孵育1 h（稀釋倍數：1∶5 000），洗膜后加入ECL 混合液中5 min 溫育，置于X 光片盒中；將已曝光的膠片放入顯影液中顯影，直至出現清晰影像，再將膠片放入定影液中定影，清水沖洗，晾干保存，掃描。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析。

1.6 統計學方法應用SPSS 24.0 統計學軟件系統對相關數據進行錄入并進行分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠AS 的影響為探究內消軟脈湯2 號是否可以改善ApoE-/-小鼠的AS，本研究通過油紅O 染色的方法對小鼠整個主動脈進行觀察，同時通過改良Movat 五色套染的方法對小鼠主動脈根部進行觀察。結果表明，與高脂飲食+蒸餾水對照組（HFD 組）比較，內消軟脈湯2 號低劑量組及高劑量組小鼠整個主動脈斑塊改善，見圖1、圖2、圖3。

圖1 各組小鼠主動脈的油紅O 染色結果Fig.1 Oil Red O staining results of mouse aorta in each group

圖2 各組小鼠的主動脈HE 染色（×50）Fig.2 HE staining of the aorta in each group of mice（×50）

圖3 各組小鼠的主動脈改良Movat 五色套染（×50）Fig.3 Modified Movat five color staining of the aorta in each group of mice（×50）

2.2 內消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠血脂4 項的影響為探究內消軟脈湯2 號是否可以改善ApoE-/-小鼠的高脂血癥，研究通過生化法對小鼠血中LDL-C、TC、TG、HDL-C 的水平進行檢測。與HFD組相比，內消軟脈湯2 號低劑量組的血清LDL 下降31.61%（P<0.05）、TC 下降23.9%（P<0.05），差異均有統計學意義，見圖4。綜合來看，內消軟脈湯2 號具有降低LDL-C 及TC 的功效。

圖4 各組小鼠的血脂4 項水平（±s，n=10）Fig.4 Four levels of blood lipids in each group of mice（±s，n=10）

2.3 內消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠肝脂肪變性的影響為探究內消軟脈湯2 號是否可以改善ApoE-/-小鼠的肝脂肪變性，研究通過油紅O 染色觀察小鼠肝臟。結果表明，與對照組比較，內消軟脈湯2 號低劑量組及高劑量組小鼠肝臟脂滴明顯減少，提示內消軟脈湯2 號具有改善小鼠肝脂肪變性的功效，見圖5。

圖5 各組小鼠的肝臟油紅O 染色（×200）Fig.5 Liver oil red O staining of mice in each group（×200）

2.4 內消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠脂肪組織的影響為探究內消軟脈湯2 號是否可以激活ApoE-/-小鼠的肩胛脂肪組織，研究通過HE 染色觀察小鼠肩胛處的脂肪組織。結果表明，HFD 組小鼠的脂肪細胞表現較為飽滿、體積較大、單房結構脂滴染色較淺。與之形成對比的是，低劑量組及高劑量組脂肪細胞體積較小、多房室結構脂泡分隔增多，HE 染色變深，細胞核著色增多，其中以低劑量組改變最為明顯。提示服用內消軟脈湯2 號后，小鼠肩胛脂肪組織可被活化，見圖6。

圖6 各組小鼠的肩胛脂肪組織HE 染色（×200）Fig.6 HE staining of scapular adipose tissue in each group of mice（×200）

2.5 內消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠肩胛脂肪組織UCP1 表達的影響由于脂肪組織活化是脂肪分解的重要途徑，UCP1 表達的升高是體內棕色脂肪組織活化的重要標志，研究通過Western blot 的方法探究內消軟脈湯2 號對肩胛棕色脂肪組織表達的影響。結果表明，與HFD 組比較，內消軟脈湯2 號低劑量及高劑量組肩胛脂肪組織UCP1 的表達水平顯升高（P<0.05），其中高劑量組升高（P<0.01）最為顯著，差異均具有統計學意義，見圖7。

圖7 內消軟脈湯2 號對肩胛脂肪組織UCP1 表達的影響（±s，n=3）Fig.7 Effect of Neixiao Ruanmai Decoction No.2 on the expression of UCP1 in scapular adipose tissue（±s，n=3）

2.6 內消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠肝臟LDLR 表達的影響內消軟脈湯2 號具有降低LDL-C 的效果，由于肝臟中LDLR 是促進體內LDL-C 代謝的關鍵蛋白，是LDL-C 內源性清除的關鍵途徑，故本研究通過Western Blot 的方法探究內消軟脈湯2 號對肝臟LDLR 表達的影響。結果表明，與HFD 組比較，內消軟脈湯2 號低劑量及高劑量組肝臟LDLR 的表達水平均升高（P<0.05），其中低劑量組升高顯著（P<0.01），差異均具有統計學意義，見圖8。

圖8 內消軟脈湯2 號對肝臟LDLR 表達的影響（±s，n=3）Fig.8 Effect of Neixiao Ruanmai Decoction No.2 on the expression of LDLR in the liver（±s，n=3）

3 討論

AS 是一種由慢性炎癥引發的動脈壁脂肪病變，已成為老年人的關鍵死亡原因之一[10]。脂質代謝紊亂與AS 的發生發展密切相關，是AS 主要的獨立危險因素。當血脂水平過高時，可導致動脈內皮損傷及脂質分子大量沉積，這些脂質分子會受到多種炎癥細胞的浸潤和吞噬，進而轉化為泡沫細胞并引發一系列炎癥和氧化反應，導致AS 的發生[11]。大量研究表明[12]，血漿膽固醇水平的升高與AS 的發生率及病死率呈正相關。目前他汀類等降脂藥物雖已廣泛應用，但中國高脂血癥發病率仍然較高。《中國居民營養與慢性病狀況報告（2020 年）》[13]顯示，中國18 歲及以上居民高脂血癥總體患病率高達35.6%，造成了嚴重的疾病負擔。中醫藥是一個偉大的寶庫，進一步挖掘治療高脂血癥及AS 的中醫方劑從而改善高脂血癥、減少心腦血管疾病的發生，既是深入貫徹《“健康中國2030”規劃綱要》的重要一環，也是高脂血癥領域的重點研究方向，對維護人類健康具有重要意義。

在中醫中，AS 為“痰核”結于血脈所致。津液與血液皆由水谷所化，運行于脈中，津液壅滯則血運亦不通暢，痰為津液壅滯，故“痰核”一旦形成，易影響血液運行而又夾雜瘀血等病理產物，最終形成斑塊[4-5]。高脂血癥作為AS 的基礎，屬于“痰濕”“脂膏”的范疇，為本虛標實之證，肝、脾、腎三臟功能失調是導致血脂異常的內因。飲食不節、嗜食肥甘厚味、情志失調、過逸少勞、先天不足等原因可造成臟腑功能失調，肝、脾、腎三臟功能失常，導致水谷不能正常運化、津液代謝失常，進而形成濕濁、痰濕等病理產物，即血脂代謝紊亂[14]。故在AS 及高脂血癥的治療上，總以化痰為主，兼顧扶正。

內消軟脈湯2 號以“脈生痰核”理論為指導，以化痰散結為主要治法，在臨床上運用其治療頸動脈斑塊獲得了良好療效，顯示出逆轉頸動脈斑塊的潛力。全方以靈芝為君藥，可健脾化痰，助脾胃運化，以絕生痰之源，是本方中改善AS 和脂代謝紊亂的關鍵藥物。大量研究證明，靈芝可安全有效地改善脂代謝紊亂、肥胖、胰島素抵抗等代謝紊亂性疾病，進而達到抑制AS 發展的作用[15-21]。痰濁之邪日久易化熱生毒，故輔黃連、玄參以清熱解毒。此外，方中牡蠣、貝母化痰散結，乳香、沒藥、丹參、當歸活血化瘀，起到消退病理產物以調節氣機、改善AS 的作用。整體來看，內消軟脈湯2 號配伍有序、寒溫并用、加減靈活，用于治療AS 與高脂血癥，確有其效。前期臨床試驗與本次實驗結果均表明，內消軟脈湯2 號可以減輕AS 斑塊的發展，實驗組小鼠的LDL-C和TC 水平降低。由此可見，內消軟脈湯2 號降低血脂水平是其改善AS 的重要原因。由于內消軟脈湯2 號可改善AS 并降低血脂，故可為他汀類藥物不耐受及他汀抵抗的AS 斑塊患者提供較好的備選方案，也為配合他汀類藥物產生更好的臨床療效提供了可能。

根據實驗結果，內消軟脈湯2 號灌胃后，小鼠肩胛區脂肪組織的活化程度及UCP1 的表達均增加，同時肝臟LDLR 的表達增加。研究表明，UCP1是介導棕色脂肪組織活化產熱的關鍵蛋白[22-23]。當脂肪組織活化時，細胞質中脂滴包被蛋白1 的磷酸化得到激活，在脂肪組織內三酰甘油脂肪酶（ATGL）等酶的介導下使TG 分解為甘油及脂肪酸[23-24]，UCP1被激活[24-25]后可介導線粒體內膜形成質子通道，使得氧化與磷酸化解偶聯，最終不產生ATP 而由熱能直接釋放[26]，同時還可增加膽固醇逆向轉運的效率及機體對膽固醇的利用等，以減少TC、TG 等脂類物質的儲存。由于脂肪組織活化產熱嚴格依賴于UCP1 的激活[22]，是控制肥胖的重要靶點，故推測內消軟脈湯2 號使脂肪組織活化與UCP1 密切相關。激活UCP1 依賴性脂肪組織活化可能是藥物改善AS 及脂代謝紊亂的潛在機制。LDLR 是體內LDL-C代謝調控的關鍵調節因子，可通過內吞作用將LDL清除，在膽固醇從血漿到細胞質的轉運和清除中起到重要作用。LDLR 的功能不全或LDLR 基因突變將導致高膽固醇血癥的發生，并明顯加速AS 的發展[27]。故增加LDLR 的表達及功能是抑制高膽固醇血癥及AS 的重要手段。根據實驗結果，內消軟脈湯2 號可使小鼠肝臟中LDLR 表達顯著增加，提示內消軟脈湯2 號改善小鼠AS、降低LDL-C 與LDLR 相關，鑒于LDLR 對LDL-C 代謝的重要作用，我們推測內消軟脈湯2 號通過增加LDLR 的表達，進而促進其對LDL 的代謝，以達到降低膽固醇并改善動脈粥樣硬化的作用。故LDLR 表達升高亦是內消軟脈湯2 號改善高脂血癥并抑制AS 的潛在機制之一。

綜上所述，AS 與高脂血癥皆因痰邪而起，內消軟脈湯2 號可通過化痰散結來清除痰邪這一宿根，其內在機制可能與激活UCP1 及LDLR 有關，若能深入挖掘方中的有效成分，進一步提高其療效，對未來高脂血癥及AS 的防治、開拓中醫藥治療心腦血管疾病的新思路具有重要意義。