膜腎1 號方對大鼠腎臟病理及PI3K/Akt/mTOR 信號通路表達的影響*

孟曦，丁偉，王建美，王耀光

（1．天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；2．天津市河東中醫(yī)院，天津 300162；3．天津市北辰醫(yī)院，天津 300400；4．天津市中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

膜性腎病是一組以腎小球基底膜上皮細胞下免疫復合物沉積伴基底膜彌漫增厚為特征的疾病[1]。根據(jù)病因的不同，分為特發(fā)性膜性腎病（IMN）和繼發(fā)性膜性腎病。IMN 是構(gòu)成原發(fā)性腎病綜合征的常見疾病，發(fā)病高峰年齡多為40～50 歲，男女比例約為2∶1，本病起病隱匿，以高度水腫、大量蛋白尿為主要臨床表現(xiàn)[2]。長期大量蛋白尿會導致患者腎功能進行性減退，甚至逐漸發(fā)展為終末期腎病。蛋白尿的形成與足細胞損傷密切相關(guān)，生理狀態(tài)下足細胞具有較高的自噬活性。研究發(fā)現(xiàn)自噬信號通路磷脂肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）對足細胞的損傷具有調(diào)控作用，腎小球足細胞存在較強的自噬活性[3]，足細胞的分化、損傷、修復過程中往往伴隨著自噬[4]，激活自噬可以減少腎小管上皮細胞凋亡，防止細胞損傷[5-6]。王耀光教授多年臨床經(jīng)驗總結(jié)治療膜性腎病基礎(chǔ)方膜腎1 號方（生黃芪、炒白術(shù)、防風、防己、地龍、僵蠶、訶子、芡實、澤蘭、丹參），臨床療效顯著。膜腎1 號方化裁自《金匱要略》名方防己黃芪湯，具有益氣祛風，健脾利水之功效，主治表虛不固之風水或風濕證，王耀光教授根據(jù)臨床多年經(jīng)驗在經(jīng)方基礎(chǔ)上加入活血祛瘀及收斂固澀之藥，臨床收效顯著。經(jīng)前期臨床研究表明膜腎1 號方能顯著改善膜性腎病患者臨床癥狀、體征，可明顯降低患者蛋白尿、膽固醇及三酰甘油（TG），實驗基于此，研究膜腎1 號方對腎臟的保護作用，通過動物實驗研究明確作用機制。

1 研究材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物無特定病原體（SPF）級SD 大鼠40 只，6 周齡雄性，體質(zhì)量150～170 g（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），普通飼料喂養(yǎng)，自由進食及飲水，室溫20 ℃，相對濕度45%±5%。實驗遵循《實驗動物護理和使用指南》（動物實驗倫理批號GENINK-20220002），自然光照12 h，在同等標準環(huán)境內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進行實驗。

1.1.2 主要儀器與材料脫水機[武漢俊杰公司（JT-12J）]；包埋機[武漢俊杰公司（JB-L8）]；電子天秤（永康市艾瑞貿(mào)易有限公司）；血生化儀（日本日立公司）；陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA，美國Sigma-Aldrich 公司，貨號：H2519-100UN）；檸檬酸抗原修復液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：C1034-100 mL）；PI3K 一抗（兔源，英國Abcam 公司，貨號：ab302958）；磷酸化磷酸肌醇3 激酶（p-PI3K）一抗（兔源，中國Bioss 公司，貨號：bs-5570R）；蛋白激酶B（AKT）一抗（兔源，美國CST 公司，貨號：#9272）；磷酸化AKT蛋白（p-Akt）一抗（兔源，美國CST 公司，貨號：#4060）；雷帕霉素靶蛋白（mTOR）一抗（兔源，美國CST 公司，貨號：#2972）；磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）一抗（英國Abcam 公司兔源，美國CST 公司，貨號：#5536）；蛋白輕鏈3（LC3）一抗（兔源，美國CST 公司，貨號：#4108 英國Abcam 公司）；磷酸甘油脫氫酶（GAPDH）一抗（小鼠源，中國優(yōu)抗，貨號：UM4002）；免疫球蛋白G（IgG，Alexa Fluor?488）抗體（兔源，英國Abcam 公司，貨號：ab133470）；羊抗兔抗體和酶標二抗（IgG-HRP，羊源，中國Bioss 公司，貨號：bs-0295G-HRP）；羊抗小鼠IgG-HRP 二抗（羊源，中國Bioss 公司，貨號：bs-0296G-HRP）；冷凍包埋劑（OCT，德國萊卡公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備SD 大鼠40 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，用尿蛋白試紙測定每只大鼠的尿蛋白為陰性后，按照隨機原則，選取7 只大鼠做為對照組，33 只進行造模，大鼠模型方法參照Border 法[7]。制備陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）溶液及C-BSA 凍干粉劑。將2 g/L C-BSA 與等量弗氏不完全佐劑混勻，在腋下、腹股溝選取多點皮下注射0．1 mL 進行預免疫，隔日1 次，共計3 次。正式免疫將2 g/L C-BSA與等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻后于大鼠尾靜脈注射，每次0．5 mL，每周3 次，連續(xù)4 周。測定大鼠的尿苷三磷酸（UTP）水平，以UTP≥20 mg 作為模型制備成功標準[8]。

1.2.2 實驗動物分組及干預造模成功后，將造模組分為模型組5 只，膜腎1 號方高劑量組（簡稱高劑量組）7 只、膜腎1 號方中劑量組（簡稱中劑量組）7 只、膜腎1 號方低劑量組（簡稱低劑量組）7 只，鹽酸貝那普利組7 只。將膜腎1 號方湯劑（生黃芪30 g，丹參30 g，炒白術(shù)15 g，防風15 g，防己20 g，地龍15 g，僵蠶15 g，訶子15 g，芡實30 g，澤蘭30 g，購自天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。按高、中、低濃度稀釋。使用生理鹽水將鹽酸貝那普利片制備含生藥濃度的藥液。根據(jù)“人和動物間體表面積折算的等效劑量比率”換算，將3 個濃度的中藥以及鹽酸貝那普利灌胃，每日2 次，對照組灌服同體積生理鹽水，灌胃14 d。留取大鼠24 h 尿液，4 ℃冰箱保存。大鼠禁食水12 h 后取血，以離心半徑200 px，離心速度維持在3 500～4 000 r/min，將大鼠全血樣本離心10 min，離心分離出血清，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫环蛛x大鼠腎臟，快速轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血液生化指標檢測及尿蛋白定量檢測測定血液生化指標24 h 尿蛋白（PRO），白蛋白（ALB），白球比（A/G），TG，總膽固醇（CHO），高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL），實驗步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 組織病理學觀察大鼠腎臟藥物干預后，將大鼠禁食12 h，按0．3 mL/100 g 劑量予腹腔注射10%水合氯醛以麻醉，確認麻醉起效后將大鼠固定于鼠板，剃除腹部皮毛，迅速剖開腹腔，尋找到腎臟，并分離出腎臟，置于生理鹽水中洗去血液。標記各組腎臟組織，部分置于10%多聚甲醛中固定。剩余部分剪成若干等分，裝入2 mL 凍存管中于-80 ℃凍存，以備后續(xù)實驗。腎臟組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫熒光染色。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）實驗提取總蛋白，將蛋白提取物從-80 ℃冰箱取出，置于冰上解凍，采用二奎啉甲酸（BCA）蛋白質(zhì)定量試劑盒，測定蛋白質(zhì)濃度，離心后準備上樣，進行電泳、轉(zhuǎn)膜。按照增強型化學發(fā)光試劑（ECL）顯色試劑盒說明書要求，配制適量ECL 工作液，瀝干PVDF 膜上的洗膜液，將配制好的ECL 工作液，均勻滴在膜上，室溫孵育5 min，然后吸去多余顯色液，采用全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)成像，使用灰度值軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法運用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料進行正態(tài)性檢驗，用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組計量資料組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膜腎1 號方對大鼠PRO、ALB 等生化指標的影響各組大鼠PRO，ALB，A/G 組間比較：與對照組相比，模型組大鼠的PRO 等生化指標出現(xiàn)異常。藥物干預后，鹽酸貝那普利組和膜腎1 號方低、中、高劑量組PRO 開始下降且低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時與對照組相比，模型組中大鼠PRO、ALB、A/G 表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，鹽酸貝那普利組和高劑量組的PRO 定量表達下降明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠PRO、ALB 和A/G 的表達（±s）Tab.1 Expression of PRO，ALB and A/G of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠PRO、ALB 和A/G 的表達（±s）Tab.1 Expression of PRO，ALB and A/G of rats in each group（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P<0.05，**P＜0.01。

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組鹽酸貝那普利組動物數(shù)7 5 7 7 7 7 PRO（mg/d）ALB（g/L）A/G 15.10±1.1237.14±4.78 1.58±0.34 49.18±1.23*27.34±3.61* 1.14±0.42*40.73±0.92#40.62±2.12 1.53±0.31 29.81±0.88#36.93±1.98 1.63±0.33 19.52±1.35**# 35.32±1.78 1.61±0.28 19.34±1.11**# 35.04±2.12 1.60±0.28

2.2 膜腎1 號方對大鼠血脂代謝功能生化指標的影響與對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)血脂代謝異常，TG、CHO 和LDL 表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。藥物干預后，鹽酸貝那普利組和高劑量組的TG、CHO、LDL 表達下降且低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血脂代謝指標的表達（±s）Tab 2 Expression of blood lipid metabolism indicators of rats in each group（±s） mmol/L

表2 各組大鼠血脂代謝指標的表達（±s）Tab 2 Expression of blood lipid metabolism indicators of rats in each group（±s） mmol/L

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組鹽酸貝那普利組動物數(shù)7 5 7 7 7 7 CHOTGLDL 3.61±0.720.86±0.180.47±0.13 4.89±0.93* 1.11±0.21* 0.71±0.02*4.40±0.321.03±0.12* 0.52±0.11 3.92±0.580.99±0.080.45±0.15 3.55±0.95# 0..97±0.07# 0.47±0.14#3.52±0.21# 0.96±0.05# 0.49±0.13#

2.3 膜腎1 號方對大鼠組織病理學的影響對照組：腎組織整體結(jié)構(gòu)及基底膜未見異常，可見腎小球及腎小管，組織內(nèi)未見明顯的炎癥細胞浸潤，未見嗜復紅蛋白及IgG 沉積；模型組：腎小球毛細血管叢充血，系膜增生，基底膜出現(xiàn)增厚，部分腎小管細胞明顯空泡化、部分管腔擴張內(nèi)含淡然無結(jié)構(gòu)物形成透明管型，組織內(nèi)可見炎癥細胞浸潤，可見嗜復紅蛋白及IgG 沉積，足細胞融合。經(jīng)膜腎1 號方和鹽酸貝那普利干預后，大鼠腎臟病理學改變均有所減輕。見圖1。

圖1 光鏡下腎臟組織HE 染色（×100）Fig.1 HE staining of renal tissue under light microscope (×100)

2.4 膜腎1 號方對大鼠腎組織IgG 沉積的影響各組大鼠的IgG 沉積比較：與對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)IgG 沉積明顯，IgG 熒光表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。藥物干預后鹽酸貝那普利組和膜腎1 號方大鼠組IgG 熒光表達下降且低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 熒光顯微鏡下腎臟組織IgG 免疫熒光染色（×200）Fig.2 IgG immunofluorescence staining of renal tissue under fluorescence microscope (×200)

2.5 膜腎1 號方對大鼠腎組織中自噬信號通路的影響各組大鼠腎臟組織中自噬及PI3K-AKT 信號通路相關(guān)蛋白表達：與對照組相比，模型組大鼠PI3K-AKT 信號通路相關(guān)蛋白p-PI3K，p-Akt，pmTOR 蛋白表達顯著增加，自噬相關(guān)蛋白LC3 表達降低；藥物干預后，鹽酸貝那普利組和膜腎1 號方組PI3K-AKT 信號通路相關(guān)蛋白p-PI3K，p-Akt，pmTOR 蛋白表達降低，自噬相關(guān)蛋白LC3 表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3 和4。

圖3 Western blotting 檢測大鼠腎臟組織中自噬信號通路及PI3K-AKT 信號通路重要蛋白Fig.3 Western blotting detection of important proteins in autophagy signaling pathway and PI3K-AKT signaling pathway in rat kidney tissue

圖4 大鼠腎臟組織中自噬信號通路及PI3K-AKT 蛋白的相對表達量Fig.4 Autophagy signaling pathway and relative expression of PI3K-AKT protein in rat kidney tissue

3 討論

IMN 是原發(fā)性腎小球疾病中常見的病理類型之一，在各種腎臟病的病理類型中位于第2 或第3的位置，日本有研究顯示膜性腎病占原發(fā)性腎病綜合征的36.8%，IMN 在膜性腎病中所占比例約為77.9%[9]。本病發(fā)病機制比較復雜，一般由于免疫復合物的沉積激活補體系統(tǒng)，形成膜攻擊復合物C5b-9 進而刺激足細胞釋放炎癥介質(zhì)，導致足細胞損傷，引起一系列病理生理改變[10]。膜性腎病的主要治療原則為控制疾病發(fā)展，減少蛋白尿，延緩腎功能減退，控制并發(fā)癥。除一般治療外，主要采取激素聯(lián)合免疫抑制劑、細胞毒類藥物為主，但容易出現(xiàn)白細胞降低、增加感染風險等免疫功能抑制和體重增加等激素相關(guān)不良反應(yīng)，近年中醫(yī)藥對膜性腎病蛋白尿的治療優(yōu)勢日益凸顯。

膜性腎病的主要癥狀之一蛋白尿的形成與足細胞損傷密切相關(guān)，生理狀態(tài)下足細胞具有較高的自噬活性。研究發(fā)現(xiàn)自噬信號通路PI3K/Akt/mTOR對足細胞的損傷具有調(diào)控作用，自噬是一種高度保守的降解機制，廣泛存在于真核細胞生物，可清除、降解和回收利用受損細胞器，對維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮重要的作用[11-12]。自噬可由多種信號通路調(diào)節(jié)，主要包括PI3K/Akt/mTOR、單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-KB）、c-jun Nterminal kinase 氨基末端激酶（JNK）通路等[13-14]。酪氨酸激酶受體被細胞外和胞內(nèi)因子活化進而激活PI3K，與酪氨酸激酶偶聯(lián)并結(jié)合配體，催化磷酸肌醇二磷酸（PIP2）生成磷酸肌醇三磷酸（PIP3），PIP3與磷脂酰肌醇依賴性激酶1（PDK-1）共同激活蛋白絲/蘇氨酸激酶（Akt），活化后的p-Akt 激活mTOR，活化后的mTOR 可通過激活其下游相關(guān)因子，進而促進細胞蛋白質(zhì)的合成、增殖以及生長，加速細胞的代謝，抑制細胞的自噬，雷帕霉素靶蛋白1（mTOR1）在自噬的負調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[6，15-16]。LC3 是自噬路徑中的中心蛋白[17]，分為Ⅰ型和Ⅱ型，LC3-Ⅱ位于自噬體膜表面，參與自噬體形成，其表達的強度與自噬泡數(shù)量的多少成正相關(guān)，通常作為自噬的分子標志[18]。LC3 的表達強度體現(xiàn)自噬泡的數(shù)量，LC3表達升高提示自噬增強，PI3K/Akt/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白P-PI3K，P-Akt 表達減低可減低對自噬的抑制，自噬對神經(jīng)細胞、足細胞等細胞的生長發(fā)育具有重要作用，足細胞的分化、損傷、修復過程中往往伴隨著自噬，激活自噬可以減少腎小管上皮細胞凋亡，防止細胞損傷[5-6]。膜性腎病的發(fā)生發(fā)展與足細胞的損傷密切相關(guān)，足細胞的損傷可造成蛋白尿增加，蛋白尿是膜性腎病的主要臨床表現(xiàn)之一，近些年mTOR 及相關(guān)信號通路在腫瘤相關(guān)疾病的機制研究較為明確，隨著研究不斷深入，除腫瘤外的其他疾病如代謝性疾病糖尿病、心腦血管疾病、自身免疫性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展也與mTOR 及相關(guān)信號通路的參與相關(guān)[19]。有體外研究發(fā)現(xiàn)[20]mTOR 抑制劑可通過激活足細胞自噬，發(fā)揮對特發(fā)性膜性腎病的治療作用。故本研究從自噬的角度進一步研究膜腎1 號方的作用機制，研究顯示，與對照組相比，模型組大鼠PI3K-Akt 信號通路相關(guān)蛋白P-PI3K，P-Akt，P-mTOR 蛋白表達顯著增加，自噬相關(guān)蛋白LC3 表達降低；藥物干預后，鹽酸貝那普利組和膜腎1 號方組PI3K-Akt 信號通路相關(guān)蛋白P-PI3K，PAkt，P-mTOR 蛋白表達降低，自噬相關(guān)蛋白LC3 表達升高，提示膜腎1 號方可以降低PI3K-Akt 信號通路的激活，提高自噬相關(guān)蛋白水平，自噬的激活可減少足細胞的損傷，發(fā)揮足細胞保護作用，從而起到減少蛋白尿、保護腎臟的作用。

自噬可通過清除、降解和回收受損的細胞器來發(fā)揮維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定狀態(tài)的作用，此過程可以認為是中醫(yī)陰陽消長、正邪相搏以達到陰陽動態(tài)平衡，正如《黃帝內(nèi)經(jīng)》所云：“陰平陽秘，精神乃至。”膜性腎病歸屬于中醫(yī)“水腫”“尿濁”“腰痛”等范疇。蛋白在中醫(yī)被認為是人體的精微物質(zhì)，《素問·六節(jié)藏象論》曰：“腎者主蜇，封藏之本，精之處也。”可見精微物質(zhì)主要依賴腎臟固攝與封藏，若腎臟封藏固攝功能異常，則發(fā)生精微物質(zhì)下泄，出現(xiàn)蛋白尿。本病病機為本虛標實，以脾腎虧虛為本，以痰濕、濁毒、瘀血等為標實之證，隨著中醫(yī)藥對膜性腎病治療的深入研究，中醫(yī)藥可通過保護足細胞、減輕腎纖維化、保護基底膜等多種途徑保護腎臟。王耀光教授總結(jié)膜性腎病的基本病機為本虛標實，脾虛不能運化水液，腎臟虧損，不能固攝，腎失封藏，精關(guān)不固，則精微物質(zhì)下泄，出現(xiàn)蛋白尿，針對本病的病因病機提出以補脾益腎，固本培元為主要治法，佐以活血祛瘀以治標，選用《金匱要略》防己黃芪湯加減化裁為膜腎1 號方（生黃芪、炒白術(shù)、防風、防己、地龍、僵蠶、訶子、芡實、澤蘭、丹參）為王耀光教授多年臨床經(jīng)驗總結(jié)治療膜性腎病基礎(chǔ)方，臨床療效顯著，方中生黃芪性甘溫為君藥，益氣健脾、補氣活血、利水消腫，炒白術(shù)健脾燥濕，助黃芪利水消腫，防風、防己祛風勝濕，地龍活血通經(jīng)，祛瘀通絡(luò)，丹參、澤蘭加強活血祛瘀、利水消腫，訶子、芡實收斂固澀，增強培本固原。現(xiàn)代藥理學研究顯示黃芪甲苷可改善腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增殖等病理損傷，減少大鼠蛋白尿[21]。

綜上所述，結(jié)果表明膜腎1 號方治療膜性腎病與調(diào)控自噬信號通路PI3K/Akt/mTOR 的表達有關(guān)，可通過調(diào)節(jié)自噬信號通路發(fā)揮足細胞的保護作用，本研究為膜腎1 號方在臨床上治療蛋白尿，延緩膜性腎病發(fā)展提供可靠的實驗依據(jù)。