基于LC-MS/MS 和靶點網絡探討扶正透邪解毒化瘀方對多重耐藥銅綠假單胞菌的干預機制*

劉通，李雁，徐紅日，李雅莉，郝丹丹，劉鳳儀，楊麗娟

（1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3.北京中醫藥大學第三附屬醫院急診科，北京 100029；4.北京中醫藥大學膿毒癥研究所，北京 100029）

銅綠假單胞菌（PA）是院內感染最常見的條件致病菌之一，易引發醫院獲得性肺炎、呼吸機相關性肺炎，也是支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病患者繼發感染的常見致病菌[1]。PA 耐藥形勢一直不容樂觀，高耐藥率導致了高多重耐藥（MDR）檢出率，中國細菌耐藥監測（CARST）研究2019—2020 革蘭氏陰性菌監測報告顯示[2]，MDRPA 檢出率為39.7%，且來自重癥監護病房的菌株耐藥率還要高出近10%。這使得治療藥物的選擇壓力日益增加。國外研究顯示，PA 肺炎的病死率約為25%～39%，而MDRPA患者的病死率更是高達40%～70%[3]。國內有研究發現，PA 肺炎患者治療總體有效率為38.3%，而MDRPA治療有效率僅為28.6%[4]。因此，亟需探索更加有效的抗菌藥物，但抗菌藥物研發周期長，遠遠趕不上細菌耐藥的速度。

中藥具有多成分、多靶點且不易耐藥等優勢，已被證實具有直接體外抑菌/逆轉耐藥作用，還能聯合抗菌藥物發揮協同作用。扶正透邪解毒化瘀方是本課題組在周平安、姜良鐸和王成祥教授等呼吸熱病專家指導下，根據課題組前期臨床總結的耐藥菌肺炎“正氣虧虛、毒瘀互結”的基礎病機[5]，以臨床療效顯著[6]的扶正解毒化瘀方為基礎組方而成。課題組前期研究結果顯示，該方1 倍和2 倍等效劑量含藥血清聯合亞胺培南后[7]，使亞胺培南對MDRPA的最小抑菌濃度（MIC）由16 μg/mL 降至8 μg/mL和4 μg/mL；對于頭孢他啶[7]，聯合1 倍和2 倍等效劑量含藥血清后，MIC 由16 μg/mL 降至8 μg/mL 和4 μg/mL；對于環丙沙星[8]，聯合1 倍等效劑量含藥血清后，MIC 由4 μg/mL 降至2 μg/mL。然而，該方體外抑菌/逆轉耐藥的藥效學基礎和直接/協同機制尚不清楚。研究擬通過液相色譜-串聯質譜聯用（LC-MS/MS）結合網絡藥理學，從藥物作用靶點層面對上述問題進行探討，以期為進一步開發抑制/逆轉細菌耐藥的中藥新藥提供客觀依據，這對減輕抗菌藥物的選擇壓力具有重要的研究意義。

1 材料

1.1 藥物與試劑扶正透邪解毒化瘀方（金銀花、赤芍、瓜蔞、連翹、黃芩、漏蘆、生黃芪、西洋參、當歸、生甘草、薏苡仁、敗醬草），采用北京康仁堂藥業有限公司生產的中藥全成分配方顆粒劑，購自北京中醫藥大學第三附屬醫院藥學部；試劑：甲醇（質譜級）、乙腈（質譜級）、甲酸（質譜級）均購自美國Fisher Chemical 公司；超純水由Millipore 純水系統進行純化。

1.2 主要儀器高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific，U3000），高分辨液相色譜-質譜聯用儀（美國AB Sciex，TripleTOF5600+），真空離心濃縮儀（德國Eppendorf，Concentrator plus），分析天平（瑞士Sartorius，BP211d），低溫高速離心機（美國Beckman Coulter，Microfuge 22R Centrifuge），掌上離心機（美國Scilogex，D1008），渦旋儀（美國Scilogex，MX-S）。

1.3 數據庫、分析平臺/軟件及作圖工具中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP，https：//old．tcmsp -e．com/tcmsp．php）、Cytoscape 3．9．1 軟件、uniprot 數據庫（https：//www．uniprot．org/）、Stitch 數據庫（http：//stitch．embl．de/）String 數據庫https：//cn．string -db．org/）、DAVID 數據庫（https：//david -d．ncifcrf．Gov）、微生信作圖（ http：//www．bioinformatics．com．cn/）。

2 方法

2.1 定性鑒定扶正透邪解毒化瘀方樣品制備將中藥全方顆粒劑研磨、混勻后，準確稱取50 mg 中藥樣本于2 mL 的離心管中；加入400 μL 冷甲醇（含內標），渦旋振蕩2 min；加入2 粒鋼珠，4 ℃下50 Hz研磨4 min；使用超聲探頭萃取30 min；渦旋振蕩2 min，4 ℃靜置10 min，14 000 g 離心15 min（離心半徑10 cm）；取上清液離心濃縮后置于-20 ℃冰箱保存備用。進行上機分析前，將離心濃縮后的提取液樣本，用100 μL 的20%甲醇/水溶液復溶，振蕩至完全溶解后離心取上清液，進行正、負離子模式分析。

2.2 色譜條件質譜正離子模式色譜條件：色譜柱為美國Waters 公司BEH C8 柱（1．7 μm，2．1×100 mm）；柱溫：50 ℃；流動相A：水（含0．1%甲酸）；流動相B：乙腈（含0．1%甲酸）；采用梯度洗脫（0～1 min，95% A；1～24 min，0%～95%A；24～27．5 min，0% A；27．5～30 min，0%～95% A），流速：0．35 mL/min；進樣體積5 μL。

質譜負離子模式色譜條件：色譜柱為美國Waters 公司HSS T3 柱（1．8 μm，2．1×100 mm）；柱溫：50 ℃；流動相A：水（含6．5 mmol/L 碳酸氫銨）；流動相B：95%甲醇水（含6．5 mmol/L 碳酸氫銨）；采用梯度洗脫（0～1 min，95% A；1～18 min，0%～95% A；18～22 min，0% A；22～25 min，0%～95% A），流速：0．35 mL/min；進樣體積5 μL。

2.3 質譜條件加熱電噴霧（ESI）離子源，在正負離子下，采用質譜一級全掃描+ DDA 二級子離子掃描模式。噴霧電壓：3．8 kV（正離子）、-3 kV（負離子）；離子傳輸管溫度：320 ℃；輔助氣加熱溫度：350 ℃；鞘氣流速：35 Arb；輔助氣流速：8 Arb；離子透鏡射頻電壓：50 V；掃描質量范圍（m/z）：70～1 050；全ms分辨率：70 000；MS/MS 分辨率：17 500；最大響應離子：5；碰撞能量：20、40 eV。

2.4 LC-MS/MS 數據分析和篩選將檢測得到的數據導入大連達碩與中國科學院大連化學物理研究所聯合開發的化合物快速鑒定分析系統OSI/SMMS 對化合物進行自動鑒定。根據TCMSP 提供的理化性質指標和類藥性指標設定依據[9]，將鑒定后的化合物中口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0．18、Caco-2 滲透率≥-0．4、半衰期（HL）≥4的化合物篩選出來，作為研究的候選活性分子。

2.5 TCMSP 數據庫中扶正透邪解毒化瘀方化學成分篩選篩選標準同上：OB≥30%、DL≥0．18、Caco-2≥-0．4、HL≥4。

2.6 扶正透邪解毒化瘀方和抗菌藥物化學成分作用于銅綠假單胞菌靶點收集將2．4 項與2．5 項中得到的化學成分進行匯總去重，通過Stitch 數據庫查找上述成分以及亞胺培南、頭孢他啶、環丙沙星作用于銅綠假單胞菌的蛋白靶點；使用UniProt 數據庫校正篩選得到靶點的名稱；并通過Cytoscape 3.9.1 軟件構建“中藥—化學成分—作用靶點網絡”。

2.7 構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI） 將2.6 項中得到的扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌的靶點輸入String 數據庫，以“Pseudomonas aeruginosa”，“medium confidence=0.4” 為篩選條件，將獲取的數據導入Cytoscape 3.9.1 軟件，根據度值（degree）篩選出關鍵作用靶點。

2.8 扶正透邪解毒化瘀方與抗菌藥物的協同作用機制分析篩選出扶正透邪解毒化瘀方、亞胺培南、頭孢他啶、環丙沙星聯合作用于銅綠假單胞菌的蛋白靶點，通過韋恩圖進行可視化分析。

2.9 扶正透邪解毒化瘀方功能富集分析通過DAVID 數據庫對扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌的靶點進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能富集分析；利用微生信平臺將結果進行可視化操作。

3 結果

3.1 扶正透邪解毒化瘀方化學成分分析及篩選結果將數據導入OSI/SMMS 系統進行峰提取、峰匹配等質譜數據處理，根據質荷比（m/z）、保留時間，從該方中共鑒定出108 個化學成分，以黃酮類、萜類、有機酸、甾醇類等為主，具體見圖1 和 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。共有20 個化學成分符合篩選條件（OB≥30%、DL≥0.18、Caco-2≥-0.4、HL≥4）。

圖1 扶正透邪解毒化瘀方正/負離子模式總離子流圖Fig.1 Negative and positive total ion chromatogram of Fuzheng Touxie Jiedu Huayu Formula

3.2 TCMSP 數據庫中扶正透邪解毒化瘀方化學成分篩選結果按照OB≥30%、DL≥0.18、Caco-2≥-0.4、HL≥4 條件，共篩選出155 種化學成分。

3.3 中藥和抗菌藥物化學成分作用于銅綠假單胞菌靶點收集結果將3.1 項與3.2 項中篩選得到的化學成分進行合并、去重，共得到162 個化學成分，其中42 個化學成分能夠通過Stitch 數據庫找到直接作用于銅綠假單胞菌的靶蛋白240 個，根據度值大小，以度值大于中位數8 共篩選出17 項，以黃酮類、甾醇類為主，還包括三萜類、生物堿類；其中β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素度值顯著高于其它化學成分，推測這些可能為扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌的核心化學成分，見圖2 和表1。亞胺培南、頭孢他啶和環丙沙星對銅綠假單胞菌分別有22 個、18 個和47 個直接作用靶點，見圖3。

表1 扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌的主要化學成分Tab.1 The main chemical constituents of Fuzheng Touxie Jiedu Huayu Formula acting on Pseudomonas aeruginosa

圖2 中藥—化學成分—作用靶點網絡圖Fig.2 Drug-component-traget network

圖3 抗菌藥物作用于銅綠假單胞菌的靶點Fig.3 Targets of antibacterial drugs acting on Pseudomonas aeruginosa

3.4 蛋白質-蛋白質互作網絡構建及核心靶點篩選在String 數據庫輸入240 個潛在作用靶點，將結果導入Cytoscape 3.9.1，運用“Network Analysis”進行網絡拓撲屬性分析，依據“度值”“中介中心性”和“接近中心性”3 個參數均大于平均值共篩選出10 個扶正透邪解毒化瘀方干預銅綠假單胞菌的潛在核心靶點，見表2。

表2 扶正透邪解毒化瘀方干預銅綠假單胞菌的潛在核心靶點Tab.2 Potential core targets of Pseudomonas aeruginosa intervention with Fuzheng Touxie Jiedu Huayu Formula

3.5 中藥與抗菌藥物的協同作用機制分析利用韋恩圖對4 種藥物作用靶點分析發現，扶正透邪解毒化瘀方分別與亞胺培南、頭孢他啶、環丙沙星有3 個、3 個和17 個共同作用靶點；4 種藥物共同作用靶點2 個；扶正透邪解毒化瘀方特異性作用靶點222 個；共同作用靶點主要作用于細菌能量和生化代謝、DNA 遺傳物質復制、蛋白質功能、表面多糖形成等途徑，還可以影響與細菌多重耐藥性形成密切相關的AmpC（β-內酰胺酶）靶點。見圖4、表3。

表3 中藥與抗菌藥物共同作用靶點信息Tab.3 Information on the common targets of action of Chinese medicines and antibacterial drugs

圖4 中藥與抗菌藥物共同作用靶點數目Fig.4 Number of targets for intervention with Chinese medicine and antibacterial drugs

3.6 GO 及KEGG 通路富集分析結果GO 富集分析共得到條目24 個（P＜0.05），其中生物過程（BP）條目8 個，細胞組成（CC）條目6 個，分子功能（MF）條目10 個。BP 中主要涉及ATP 合成耦合質子轉運、DNA 拓撲變化、脂質代謝過程、蛋白質折疊、dTDP-鼠李糖生物合成過程等過程；CC 中主要涉及膜、染色體、質膜胞質側的外在成分等組分；MF中主要涉及氧化還原酶活性、質子轉運ATP 合酶活性、ATP 結合、DNA 拓撲異構酶Ⅱ型（ATP 水解）活性[DNA topoisomerase typeⅡ（ATP-hydrolyzing）activity]等過程，見圖5。

圖5 扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌相關靶點GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of Pseudomonas aeruginosa-related targets by Fuzheng Touxie Jiedu Huayu Formula

KEGG 富集分析共篩選出8 條信號通路（P＜0.05）。主要涉及甘油磷脂代謝、代謝途徑、氧化磷酸化、生物素代謝、聚酮糖生物合成、核糖生物合成、O-抗原核糖生物合成、硫代謝等通路。此外，富集結果還包括脂肪酸代謝、抗生素如鏈霉素生物合成等通路，見圖6。

圖6 扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌相關靶點KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of Pseudomonas aeruginosa-related targets by Fuzheng Touxie Jiedu Huayu Formula

4 討論

銅綠假單胞菌的耐藥機制分為天然耐藥、獲得性耐藥和適應性耐藥3 類[10]。鑒于其較高的檢出率和復雜的耐藥機制帶來的臨床抗感染難題，世衛組織于2017 年將其列入新型抗生素研發重點病原體清單[11]。目前，MDRPA 的抗感染藥物治療原則主要根據藥敏報告選擇抗PA 活性強的抗菌藥物進行單獨或聯合用藥，但MDRPA 對非限制使用級和限制使用級抗菌藥物往往耐藥，特殊使用級抗菌藥物也存在療效上的不確定性。中藥具有不良反應小、不易耐藥、抑制病原體、調節宿主免疫等優勢，在作為抗菌藥物的補充和替代品上有重要的潛力[12]。

LC-MS/MS 結果顯示，扶正透邪解毒化瘀方共鑒定出108 個化學成分，以黃酮類、萜類、有機酸、甾醇類等為主，而這幾類化學成分對多重耐藥菌均具有較好的抑菌作用。黃酮類如黃芩苷可直接抑制PA 生物膜生成、減少多糖蛋白復合物產量及抑制群體感應系統的表達[13]，與左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦聯用可增強對生物被膜的破壞作用[14-15]。萜類如熊果酸對多種細菌具有直接抑菌作用，可與萬古霉素、諾氟沙星以及β-內酰胺藥物發揮協同作用[16]。有機酸類如咖啡酸、綠原酸可以干擾PA 群體感應系統相關基因轉錄，抑制生物被膜形成[17-18]。關于甾醇類抗菌活性的研究報道較少，云杉樹皮提取物對PA 有直接抑菌作用[19]，氣質聯用（GC-MS）檢測發現提取物中含有較高含量的植物甾醇；麥角甾醇可以增加氨基糖苷類抗菌藥物的抗真菌活性，但在細菌中尚未有類似報道，為后續研究提供了方向[20]。

網絡藥理學結果顯示，β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素度值較高，在扶正透邪解毒化瘀方抑制/逆轉MDRPA 耐藥性的過程中可能發揮著關鍵作用。β-谷甾醇對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌均具有直接抑制作用，是未來開發抗菌藥物的潛在候選者[21]。槲皮素與阿米卡星、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢曲松等抗菌藥物聯用具有協同抗MDRPA 的作用，機制與抑制生物被膜形成、群體感應系統有關[22]。槲皮素和木犀草素還可以誘導TonB 依賴性轉運蛋白的表達，增強PA 對鐵載體藥物的敏感性，而新型抗菌藥物頭孢地爾正是一種鐵載體頭孢菌素類藥物[23]。木犀草素還可以有效抑制PA 生物被膜的形成和運動性，機制與減弱群體感應系統相關信號分子和基因的表達水平有關[24]。黃檳榔青的樹皮提取物可以增強諾氟沙星對PA 的抗菌活性，而山奈酚和槲皮素是提取物的主要化學成分[25]。黃芩素在亞抑菌濃度下通過下調PA 群體感應系統相關信號分子的表達，抑制了細菌的運動性和生物被膜形成能力[26]。說明扶正透邪解毒化瘀方中多種成分不僅可以直接抑制PA，還可以與多種抗菌藥物發揮協同作用，干預生物被膜和群體感應系統可能是其主要作用機制。

通過分析扶正透邪解毒化瘀方相關化學成分和抗菌藥物作用于PA 的共同靶點來看，該方對抗菌藥物起協同作用主要與干預細菌生化代謝、DNA復制、蛋白質功能、表面多糖形成等機制相關。IspA（香葉基轉移酶）是異戊二烯的催化酶，蛋白質在異戊二烯化過程中被翻譯修飾為功能蛋白，參與細胞生長、分化等活動[27]。IspA 突變會導致PA 對妥布霉素、慶大霉素和阿米卡星的最小抑菌濃度升高2倍[28]。細菌DNA 拓撲異構酶和DNA 回旋酶同屬于Ⅱ型拓撲異構酶，是喹諾酮類藥物抗革蘭氏陰性菌的主要靶標。DNA 拓撲異構酶IV 在DNA 復制和轉錄過程中負責控制DNA 拓撲狀態；DNA 回旋酶由gyrA 和gyrB 亞基組成，前者負責DNA 鏈的結合、斷裂和重新連接，后者負責ATP 酶的活性。DNA 拓撲異構酶Ⅳ和gyrA 的突變增加了PA 對左氧氟沙星、環丙沙星等喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性[29-30]。PA 3228/0806（ABC 轉運蛋白ATP 結合蛋白/滲透酶）參與包括PA 在內的多種革蘭氏陰性菌O 抗原的合成過程，而O 抗原是脂多糖的主要構成部分，可保護細菌免受噬菌體、細菌素等的殺滅作用[31]。MsbA轉運體屬于ABC 轉運蛋白家族，通過利用ATP 結合和水解的力量，促進脂多糖的合成和細菌活力，阻斷其轉運活性或許能夠同時阻斷ATP 酶活性，在成為新型抗菌藥物靶標上具有一定的吸引力[32]。

PPI 蛋白互作網絡結果提示，扶正透邪解毒化瘀方干預PA 的核心靶點除了上述提到的gyrA 外，還包括dnaK、fabZ 和fabA 等已知的參與PA 耐藥過程的關鍵靶點。DnaK 蛋白是由ATP 酶活性介導的分子伴侶，是介導PA 在內的革蘭氏陰性菌應激反應、保持細菌完整性的重要蛋白，誘導其突變可增強MDR 菌對抗菌藥物的敏感性[33]。FabZ 和fabA是參與細菌Ⅱ型脂肪酸合成途徑的酶，已被用作抗多種病原體的廣譜藥物靶點，黃酮類化合物可通過抑制fabZ 活性進而對PA 產生直接抑菌作用[34]。

GO 和KEGG 富集分析提示，扶正透邪解毒化瘀方的作用靶點主要與調節細菌能量和生化代謝、調控DNA/蛋白質穩態、影響細菌胞質胞膜以及干預對細菌起保護作用的表面多糖和生物被膜合成等密切相關。ZHOU D P 等[35]通過基因編輯技術干預PA，并用高通量測序（RNA-Seq）發現，857 個上調基因與氧化還原過程、跨膜轉運、脂質代謝、甘油磷脂代謝、氧化還原酶活性等途徑密切相關，本研究也得到了類似的結果。細胞質膜是細菌的基本結構之一，具有DNA 復制、酶分泌、生物成分合成和能量生產等功能[19]。Ⅱ型DNA 拓撲異構酶相關功能在上文中已經論述，以其為靶標設計的二堿四氫吡喃化合物對PA 顯示出直接抑制作用[36]。Rha（鼠李糖脂）是細菌多糖的常見成分，例如脂多糖、胞外多糖、莢膜多糖和細胞壁多糖。dTDP-Rha 是最重要的糖前體之一，在許多生物過程中起著關鍵作用[37]。

綜上，研究通過LC-MS/MS 技術結合網絡藥理學探討了扶正透邪解毒化瘀方單獨及與抗菌藥物聯用干預銅綠假單胞菌耐藥性的藥效物質學基礎和機制，發現該方具有多成分、多靶點、多途徑的干預特點。潛在的起主要干預作用的化學成分以黃酮類、甾醇類、萜類為主，主要干預機制包括抑制生物被膜和群體感應系統以及影響銅綠假單胞菌能量和生化代謝、DNA 復制、蛋白質功能、表面多糖生成等相關。目前，關于中藥抗細菌耐藥性的研究大多停留在宏觀層面，較少細化到化學成分層面；而網絡藥理學既往常用于探索藥物和疾病之間的潛在聯系，研究綜合LC-MS/MS 和網絡藥理學來探索藥物具體化學成分對病原體的直接作用，為從天然藥物中開發抗菌藥物提供了一定的思路和借鑒。同時，從藥物作用靶點層面為日后深入研究該方做出了積極的探索。