基于網絡藥理學方法探討黃芪-半枝蓮抗結直腸癌的作用機制

李靜純 龍其雄 馮峰 孫偉

1廣州市花都區人民醫院中心實驗室，廣州 510800；2廣州市花都區人民醫院消化內科，廣州 510800

結直腸癌是全球第三常見的惡性腫瘤，病死率位居第二，盡管常規治療有明顯改善，但由于頻繁復發和轉移，5年生存率仍低于20%，而被診斷為4期結直腸癌患者5年生存率低于10%［1-3］。中國正處于癌癥高發期，據數據統計，結直腸癌發病率迅速增加，且病死率高［4］。傳統中醫藥在中國已被廣泛使用數千年，由于中藥具有較少的毒性作用被應用于多種疾病治療［5］。大量數據表明中藥是一種潛在的有效抗癌藥物［6］，中藥具有多成分、多靶點等特點，臨床治療大多以復方形式，有實驗研究表明中藥復方在抑制小鼠腫瘤生長的效果較單味中藥好［7］。黃芪、半枝蓮均具有清熱解毒、抗炎抗癌等功效，但黃芪聯合半枝蓮抗結直腸癌的機制尚未闡明。隨著生物信息的發展，網絡藥理學是代表一種基于“疾病-基因-藥物”相互作用的網絡關系方法，能系統從分子水平角度分析中藥復方對疾病靶點的影響［8-9］。本文通過網絡藥理學分析方法探討黃芪-半枝蓮抗結直腸癌的有效成分及潛在分子機制，為中藥復方治療疾病提供依據。

材料與方法

1.黃芪-半枝蓮有效活性成分篩選與蛋白靶點獲取

通過中藥藥理學分析平臺數據庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索黃芪、半枝蓮成分，設置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）值≥30，類藥性（druglikeness，DL）值≥0.18，篩選有效活性成分以及相關作用靶點，利用UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）對靶點進行匹配。

2.結直腸癌相關基因靶點獲取

通過孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//omim.org/）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、治療目標數據庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//db.idrblab.net/ttd/）和Drug-bank數據庫（https：//www.drugbank.ca/）結直腸癌靶點，并且與藥物靶點繪制韋恩圖，篩選交集基因，即藥物作用疾病的潛在靶點。

3.“藥物-活性成分-潛在靶點”網絡圖構建以及分析

利用Cytoscape_v3.9.1軟件繪制可視化“藥物-活性成分-潛在靶點”網絡圖，通過軟件中的Network Analyzer工具及cytoNCA插件分析對網絡圖每個節點進行分析，以3個參數為標準，分別為：（1）連接度中心性（degree centrality，DC）；（2）緊密度中心性（closeness centrality，CC）；（3）中介中心性（betweeness centrality，BC），DC值越高，BC值和CC值就越大，以此來篩選網絡圖中的關鍵節點，即活性成分中的關鍵成分。

4.構建蛋白相互作用網絡圖

將潛在靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org/）構建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖，將PPI網絡圖導入Cytoscape_v3.9.1軟件，使用cytoNCA插件計算各個靶點的DC、BC、CC值，最終篩選出核心靶點，并且用Cytoscape_v3.9.1構建關鍵成分與核心靶點網絡關系圖。

5.基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

將潛在靶點列表導入Metascape數據庫（https：//metascape.org/），收集細胞生物進展（biological processes，BP）、細胞成分（cellular component）、分子功能（molecular function，MF）數據，同時對潛在靶點進行KEGG富集分析，制作富集分析圖。

結果

1.黃芪與半枝蓮有效成分及潛在靶點（表1）

表1 黃芪-半枝蓮有效成分

通過TCMSP數據庫檢索黃芪與半枝蓮的成分，將條件設置為OB值≥30且DL值≥0.18進一步篩選兩者的有效成分，結果黃芪共篩出17種有效活性成分，半枝蓮篩出28種有效成分，并且黃芪獲得蛋白作用靶點463個，半枝蓮獲得589個作用靶點。將靶點與UniProt數據庫進行匹配。

2.黃芪-半枝蓮抗結直腸癌的潛在靶點（圖1）

圖1 黃芪-半枝蓮抗結直腸癌的潛在靶點交集。A：黃芪；B：半枝蓮；C：結直腸癌

通過GeneCards、OMIM、TTD和Drug-bank數據庫檢索結直腸癌相關靶點，共獲取9 117個相關靶點，與黃芪-半枝蓮作用靶點相互匹配后，交集得到24個共同靶點，即黃芪-半枝蓮作用于結直腸癌的潛在靶點。

3.構建“黃芪/半枝蓮-有效成分-藥物靶點”網絡關系圖并且篩選關鍵成分（圖2、表2）

圖2 黃芪-半枝蓮抗結直腸癌的“藥物-活性成分-靶點”網絡關系圖

表2 DC值最高的前5種關鍵成分具體信息

利用Cytoscape_v3.9.1軟件構建黃芪-半枝蓮的有效活性成分與潛在靶點的關系圖，通過Network Analyzer工具及cytoNCA插件分析網絡圖每個節點的DC、BC、CC值，篩選DC值最高的前5種關鍵成分。

4.PPI網絡圖構建以及核心靶點篩選（圖3、圖4）

圖3 黃芪-半枝蓮抗結直腸癌的蛋白相互作用網絡關系圖

圖4 黃芪-半枝蓮抗結直腸癌的關鍵成分與核心靶點網絡關系圖

將24個潛在靶點構建PPI網絡圖，并篩選出5個核心靶點，繪制關鍵成分與核心靶點關系圖。

5.對潛在靶點進行GO富集分析（圖5～7）

圖5 基因本體論（GO）富集分析細胞成分條形圖

圖6 基因本體論（GO）富集分析細胞生物進展（BP）條形圖

圖7 基因本體論（GO）富集分析分子功能（MF）條形圖

通過Metascape數據庫對潛在基因進行GO富集分析，其中細胞成分富集到20項，BP富集到337項，MF富集到30項，選擇其中P值最小的前20項以條形圖進行展示。通過富集分析發現，黃芪-半枝蓮抗結直腸癌主要作用于溶酶體、黑素小體、膜筏、微膜區、細胞質、細胞外基質、核膜、內質網、轉錄復合物等；生物進展方面，主要表現在對外界刺激反應、參與凋亡調控過程、調節酶活性等生物過程；分子功能方面，主要與蛋白激酶結合、轉錄因子結合、ATP依賴性活性、DNA結合轉錄因子結合等功能相關。

6.對潛在靶點進行KEGG信號通路富集分析（圖8）

圖8 京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集氣泡圖

通過Metascape數據庫對潛在基因進行KEGG信號通路富集分析，共富集到89項，主要富集于小細胞肺癌、前列腺癌、結直腸癌、膀胱癌、胰腺癌等，信號通路主要富集于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路等，選擇富集程度最高的前20項繪制氣泡圖。

討論

結直腸癌是全球第三常見的惡性腫瘤，病死率位居第二，中國正處于結直腸癌發病率迅速增加時期［1-2］。近年研究顯示，中藥是一種潛在的有效抗癌藥物［6］，本文通過網絡藥理學分析方法系統闡述黃芪-半枝蓮與結直腸癌靶點之間相互作用及潛在機制。通過網絡藥理學分析方法，能系統呈現中藥的生物活性化合物與目標之間的相互作用，和各目標之間的交互作用，并找出關鍵節點，為中藥復方治療疾病提供理論依據［6］。

通過TCMSP平臺我們檢索到黃芪活性成分17種，半枝蓮活性成分28種以及相關靶點。其中DC值最高的關鍵成分包括槲皮素、木犀草素、黃芩素等5種，槲皮素是一種水溶性糖苷，也是一種植物雌激素，能抑制結直腸癌發展，促進凋亡［10］；木犀草素是有效的抗癌類黃酮，通過調節細胞周期阻滯、凋亡和細胞增殖來達到抗結直腸癌效果［11］；黃芩素和漢黃芩素是從黃芩中提取的有效活性成分，能有效抑制結直腸癌細胞活性和轉移，促進癌細胞凋亡［12-13］；山柰酚屬于多酚類，能有效抑制結直腸癌生長，促進細胞周期進展并誘導細胞凋亡［14］。

通過韋恩圖交集，分析PPI網絡圖，我們篩選出黃芪-半枝蓮抗結直腸癌5個核心基因，包括MYC、TP53、基質金屬蛋白酶（MMP）9等。MYC基因在腫瘤發生發展中發揮著核心作用，MYC基因失調與結直腸癌的侵襲性和不良預后相關，試驗發現蟲草素通過下調MYC表達從而抑制結直腸癌細胞增殖［2，15］。TP53基因是腫瘤抑制因子，具有調節細胞周期、DNA損傷修復等功能，對臨床用藥及預后監測具有指導意義［16-17］。Bian等［18］研究結果顯示川芎嗪抑制結直腸癌細胞增殖，隨著藥物劑量性依賴可上調P53表達，阻滯細胞周期。MMP9基因是MMP家族成員之一，MMP9在各種腫瘤中表達以及活性顯著上調，被認為是結直腸癌等腫瘤的潛在標志物［19］。Wang等［20］通過體內體外試驗顯示，華蟾素可顯著下調MMP9的表達，明顯抑制結直腸癌細胞侵襲和轉移，抑制腫瘤生長。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物過程中發揮著重要作用，是PI3K/AKT/MTOR信號通路的一部分，刺激細胞惡性轉化和腫瘤進展［21］。王璐等［22］通過研究發現，人參多糖可能通過下調PI3K/AKT信號通路抑制結腸癌發展，發揮對結腸癌的治療作用。caspase蛋白酶家族在細胞凋亡中發揮重要作用。caspase缺乏與腫瘤發生密切相關，caspase3是caspase家族關鍵成員，在細胞凋亡執行階段發揮著核心作用，可促進癌細胞凋亡并抑制腫瘤發展［23］。Feng等［24］結合網絡藥理學和試驗研究發現當歸補血湯抗結腸癌作用與細胞凋亡密切相關，通過上調caspase3、cl-caspase3蛋白表達水平，促進癌細胞凋亡，抑制疾病進展。綜上分析，黃芪-半枝蓮可能通過多個蛋白靶點發揮抗結直腸癌作用。

通過KEGG信號通路富集分析顯示，主要涉及非小細胞肺癌、前列腺癌、結直腸癌等疾病通路，PI3K/AKT、MAPK和TNF信號通路等。PI3K/AKT是腫瘤相關重要通路，與癌細胞轉移和上皮間質轉化、耐藥等相關，并且是細胞凋亡的負調控因子，一旦該通路被過度激活，將促進癌細胞增殖和轉移，抑制凋亡［25-26］。Sheng等［27］通過試驗驗證半枝蓮可減弱PI3K/AKT信號通路，從而抑制前列腺癌細胞增殖和轉移，促進癌細胞凋亡。MAPK信號通路參與一系列細胞反應，包括細胞增殖、分化、炎癥和凋亡，細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinas，ERK）、c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、P38激酶是MAPK信號通路關鍵蛋白［28-29］。在腫瘤發生過程中往往觀察到ERK過度激活；P38與炎性反應、細胞凋亡和自噬有關，是腫瘤進展的抑制劑；JNK是一種應激激酶，在腫瘤細胞中主要參與細胞凋亡過程。大量試驗證明ERK的激活與促進細胞增殖密切相關，P38和JNK的激活可促進炎癥和細胞凋亡［28］。王加茹等［30］通過試驗研究表明，隱丹參酮對食管癌細胞具有較好殺傷作用，促進p-JNK、p-P38表達，下調p-ERK表達，提示可能通過MAPK途徑誘導癌細胞凋亡。TNF-α是一種調節細胞凋亡的炎性細胞因子，可能是腫瘤的抑制劑。Hsuan等［31］研究顯示，山葵提取物可激活TNF-α，TNF-α與其相應的受體相結合，促進caspase3、caspase8、Bid等蛋白表達，進而促使結直腸癌細胞發生凋亡，抑制疾病進展。綜合分析可知，黃芪-半枝蓮可通過影響多條疾病通路、多條相關信號通路達到抗癌的效果

綜上所述，基于網絡藥理學分析方法，對黃芪-半枝蓮的抗結直腸癌作用機制進行系統分析，從理論基礎上闡述黃芪-半枝蓮抗結直腸癌是通過“多成分、多靶點、多通路”協同發揮治療抗腫瘤效應，但仍需進一步進行體內體外試驗研究，為臨床治療提供理論依據。

作者貢獻聲明李靜純：采集數據、分析/解釋數據，起草文章；龍其雄：統計分析，指導；馮峰：指導；孫偉：對文章的知識性內容作批評性審閱，指導