基于網絡藥理學和分子對接探討姜黃素治療潰瘍性結腸炎的分子機制

王闖紅，常旭貞

（通渭縣人民醫院普外科1，病理科2，甘肅 通渭 743300）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結直腸黏膜及黏膜下損傷為主的連續性炎性腸道疾病，典型癥狀為反復腹痛、腹瀉、黏液膿血便以及里急后重和體重減輕等[1]。在世界范圍內UC 患病率呈上升趨勢[2]。目前UC 患者經常使用氨基水楊酸、糖皮質激素、免疫調節藥物和生物制劑，但以上藥物易導致感染、骨質疏松和抑郁等不良反應，甚至還會引起抗原抗體反應[3]。即使經過規范的藥物治療，仍有20%～30%的患者由于藥物治療失敗或長期結腸炎繼發發育不良需接受手術治療[4]。姜黃素是姜黃、郁金等姜科姜黃屬中藥中的主要活性成份，具有較好的抗炎、改善免疫功能及抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[5]。臨床研究發現[6]，補充姜黃素可顯著改善輕至中度UC 患者的臨床結局和生活質量，然而姜黃素改善UC 機制至今尚未完全明確。網絡藥理學作為一門基于系統生物學、生物信息學和高通量組織學的全新學科，基于公共數據庫用于發現生物活性成分，預測藥物作用靶點以及從生物網絡平衡的角度分析藥物作用機制[7]。因此，本研究利用網絡藥理學方法，預測姜黃素在UC 治療中的有效分子靶點和潛在機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 姜黃素作用靶點獲取 將姜黃素英文名稱“curcumin”輸入TCMSP 數據庫（https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和Drugbank 數據庫（https://go.drugbank.com/）進行檢索，收集姜黃素潛在作用靶點。將“curcumin”輸入PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得姜黃素的2D 化學結構及SMILES 符號，上傳SDF 格式2D 化學結構文件至PharmMapper 數據庫（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）進行模擬分子-靶蛋白對接，設置靶點類型為“human protein targets only”，獲得潛在作用靶點。同時將姜黃素SMILE 符號上傳至SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），選擇物種為“homo sapiens”，獲得潛在作用靶點，并從中篩選出可能性（probability）大于0的靶點。將上述靶點合并去重，利用Uniprot 網站（https://www.uniprot.org/）對剩余靶點進行標準化轉換，得到目的基因名稱。

1.2 UC 疾病靶點檢索 利用GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）、DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/）、PharmGKB 數據庫（https://www.pharmgkb.org/）和TTD 數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/），以“ulcerative colitis”為關鍵詞進行人類基因檢索獲得疾病靶點。篩選GeneCards 數據庫中相關性得分大于1 的靶點及DisGeNET 數據庫評分大于0.1 的靶點。將4 個數據庫中符合疾病的基因合并去重，從而獲得最終疾病相關靶點基因。

1.3 UC 和姜黃素共同靶點的篩選 將“1.1”和“1.2”所獲取的姜黃素靶點基因與UC 疾病靶點基因導入Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線作圖工具繪制韋恩圖，獲得姜黃素與UC 的共有靶點基因。

1.4 蛋白互作網絡構建及核心靶點篩選 將姜黃素與UC 的共有基因靶點導入STRING 數據庫（https://cn.string-db.org/cgi/input.pl），設定物種為“homo sapiens”，最高置信度為0.9，構建共有靶點基因的蛋白互作關系（protein-protein interaction,PPI）網絡，隱藏PPI 網絡中孤立的靶標基因，導出tsv.相關信息文件，運用Cytoscape3.9.1 軟件進行可視化分析，計算網絡拓撲學參數并篩選核心靶點。

1.5 生物功能與通路富集分析 利用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）將姜黃素與UC 的共有靶點基因進行基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。以＜0.05 作為顯著功能和通路的臨界值，按照值從小到大進行排序，分析姜黃素治療UC 的主要生物功能以及信號通路。

1.6 核心靶點的分子對接驗證 選擇核心靶點蛋白分子進行分子對接驗證。從Protein Data Bank 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點蛋白的3D 結構。利用AutoDockTools 1.5.6 軟件將蛋白受體和姜黃素分子配體進行分子對接，通過結合能評估配體和受體的結合能力，結合能小于-5.0 kcal/mol 時具有良好的對接活性。采用PyMol2.2.0 軟件進行可視化展示。

2 結果

2.1 姜黃素治療UC 的潛在靶點 基于TCMSP 數據庫收集到姜黃素中所包含的靶點2 個，Drugbank 數據庫中收集到5 個，PharmMapper 數據庫收集到291 個，SwissTargetPrediction 數據庫收集到47 個。合并去重后，最終得到姜黃素潛在作用靶點324 個。將GeneCards、DisGeNET、PharmGKB 和TTD 4 個數據庫中檢索到的UC 相關靶點基因合并去重，共收集到UC 相關基因2907 個。通過韋恩圖取交集，共獲得姜黃素治療UC 潛在靶點基因168 個，見圖1。

圖1 姜黃素和潰瘍性結腸炎共有靶點韋恩圖

2.2 蛋白質相互作用（PPI）網絡構建與分析 PPI 網絡中共有133 個節點，1082 條邊（在STRING 數據庫中設置最高置信度為0.9，并隱藏孤立節點，所以有35 個交集靶點基因未參與網絡構建），見圖2。以Degree 值＞50 為篩選條件，獲得姜黃素治療UC 的關鍵靶點有SRC、MAPK1、STAT3、AKT1、HSP90AA1及PTPN11，其網絡拓撲學參數見表1。

表1 PPI 網絡核心靶點的拓撲學參數

圖2 姜黃素治療潰瘍性結腸炎潛在靶蛋白PPI 網絡圖

2.3 GO 功能注釋分析 將藥物疾病共有靶點進行蛋白功能注釋分析，包括生物過程、分子功能以及細胞成分，將校正＜0.05 的條目進行篩選，分別選取值最小的前10 位作圖，結果顯示生物過程包括485 個條目，主要涉及凋亡過程的負調控、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白質磷酸化等；分子功能包括108 個條目，主要涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、相同蛋白質結合等；細胞成分包括66 個條目，主要涉及胞質溶膠、細胞外外泌體、細胞外區等，見圖3。

圖3 姜黃素治療潰瘍性結腸炎作用靶點GO 功能分析

2.4 KEGG 通路富集分析 將藥物疾病共有靶點進行KEGG 通路富集分析，將校正＜0.05 的條目進行篩選，總共富集到147 條信號通路。將得到的結果按值進行排序，選取值最小的前20 條通路進行可視化分析，結果顯示這些靶點主要匯集在癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白聚糖、前列腺癌、內分泌抵抗、PD-L1 在癌癥中的表達和PD-1 檢查點通路、C 型凝集素受體信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等信號通路，見圖4。

圖4 姜黃素治療潰瘍性結腸炎作用靶點KEGG 富集氣泡圖

2.5 姜黃素與核心靶點蛋白分子對接情況 姜黃素與6個核心靶點蛋白的結合能均小于-5.0 kcal/mol，見表2。對接結果在PyMOL 軟件中進行可視化處理，以姜黃素與SRC 對接為例，結果顯示姜黃素可通過GLN-3 與SRC 形成氫鍵；另外，姜黃素與SRC的結合能為-5.15 kcal/mol，提示姜黃素與核心靶點SRC 的生物親和力高，具有較高的藥效活性，見圖5。

表2 核心靶蛋白與姜黃素的分子對接結果

圖5 姜黃素與核心靶蛋白的分子對接結果圖

3 討論

目前，臨床對于UC 的發病機制尚未明確，中醫學認為其病機主要以本虛為主，是本虛標實、虛實夾雜之證[8]。中醫藥治療UC 具有療效確切、多靶點調控、毒副作用小等優勢。研究表明[9-11]，中藥有效成分及復方治療UC 的機制包括調節機體免疫、維持抑炎促炎因子平衡、抗氧化及調節腸道微生態等。網絡藥理學研究發現諸如葛根、黃芩和黃連厚樸湯等多種中藥和方劑均具有抗UC 的作用靶點[12-14]。姜黃素是姜黃、郁金等姜科姜黃屬中藥中的主要活性成份，一項針對隨機對照臨床試驗的研究證實[15]，姜黃素輔助治療可有效緩解UC 患者的臨床癥狀，而不會引起嚴重的不良反應。然而，姜黃素在UC 治療中的調節機制尚未得到系統闡明。

本研究基于網絡藥理學方法探討了姜黃素在UC 治療中可能的作用機制，從公共數據庫中篩選到168 個姜黃素治療UC 的潛在靶點。GO 功能富集分析顯示659 條通路，KEGG 通路富集分析顯示147 條信號通路，主要與細胞凋亡過程負調控、蛋白質磷酸化、癌癥相關通路、脂質和動脈粥樣硬化、C 型凝集素受體信號通路等有關。血脂異常不僅與UC 等自身免疫性疾病的發病有關，而且會加速其進展[16]。研究表明[17，18]，UC 患者血清HDL-C 水平顯著降低、LDL-C 水平顯著升高，而姜黃素能夠影響脂質代謝，從而緩解高脂血癥和動脈粥樣硬化。C 型凝集素受體（C-type lectin receptors，CLRs）主要由抗原呈遞細胞表達，是識別內源性分子和病原體上碳水化合物結構的模式識別受體[19]，在調節腸道免疫穩態和結腸炎癥中起著至關重要的作用。Mincle是一種主要由巨噬細胞誘導的CLR，介導宿主內的各種促炎反應，研究發現其可作為UC 的潛在治療靶點[20]，而姜黃素能夠通過抑制Mincle 維持的M1巨噬細胞表型從而減輕炎癥反應[21]。

根據姜黃素與UC 共有靶點基因的PPI 網絡，篩選出6 個關鍵靶點基因：SRC、MAPK1、STAT3、AKT1、HSP90AA1 及PTPN11。分子對接結果表明，姜黃素對這些靶標具有良好的親和力，其中STAT3結合度最高。SRC 是一類非受體酪氨酸激酶，通過催化ATP 末端的磷酸基團轉移到特定蛋白質底物上的酪氨酸殘基來激活下游信號分子，從而轉導生物信號，是細胞生理過程的重要調節劑[22]。UC 的病理特征之一是杯狀細胞丟失導致粘蛋白分泌減少，有研究發現[23]，作為SRC 家族成員之一的SRC-3 可以通過增強轉錄因子KLF4 的表達來改善葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導的結腸炎，促進結腸杯狀細胞分化和成熟。MAPK 信號通路是與UC 發病機制密切相關的信號通路，其激活被認為是導致UC 中細胞因子和炎癥介質釋放的主要因素之一[24]。MAPK1 是MAPK 家族成員之一，在MAPK信號傳導中起主要作用。有研究表明[25]，DSS 誘導的UC 大鼠MAPK1 的表達增加，其被抑制后可減輕炎癥，促進上皮屏障功能的恢復。處于活動期的UC 患者腸道固有層中IL-6 及其受體（IL-6Rα）水平升高，IL-6 與IL-6Rα 多肽結合，后者與膜相關gp130相互作用，進而觸發Janus 激酶（Janus kinases，JAK）和下游效應子、信號轉導和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription-3，STAT3）、Shp-2-Ras 和磷脂酰肌醇3'激酶（phosphatidyl inositol 3' kinase，PI3K）-AKT 信號[26]。STAT3 與特定的DNA 序列結合并調節細胞增殖、存活和血管生成調節因子的轉錄[27]。研究發現[28]，中藥提取物木犀草素可以通過蛋白質磷酸絲氨酸磷酸酶-1（protein phosphoserine phosphatase-1，SHP-1）抑制STAT3 信號通路來保持腸道上皮屏障功能，從而緩解DSS 誘導小鼠UC 的癥狀。Shou X 等[29]研究發現，在青紫止痛湯治療UC 中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（silk/threonine protein kinase 1，AKT1）是結合活性最好的靶蛋白，提示AKT1 可能是青紫止痛湯給藥后信號轉導的重要介質。

根據分子質量，Hsps 分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60 和Hsp20 家族。Hsp90AA1 是Hsp90s中研究最廣泛的成員，它在細胞質基質中的主要作用是維持蛋白質穩態并實現細胞保護功能[30]。葛根芩連湯治療UC 在臨床上使用廣泛，且療效確切。Wei M 等[31]通過網絡藥理學分析發現，HSP90AA1是葛根芩連湯治療UC 的靶標之一。PTPN11 基因編碼含Src 同源結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白2（Src homology domain -containing protein -tyrosine phosphatase-2，SHP-2），由PTPN11 多態性引起的SHP-2 功能喪失的積累改變可能導致對T 細胞和B細胞活化的抑制作用降低，從而導致持續的慢性腸道炎癥和UC 的發作[32]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學和分子對接技術預測了姜黃素治療UC 的核心靶點和信號通路，表明姜黃素可以通過多靶點、多途徑系統地改善UC。以上研究結果為未來運用姜黃素治療UC 的新藥開發和臨床研究提供了理論依據，后續需進一步研究和實驗驗證。