脂多糖誘導(dǎo)大鼠膿毒癥相關(guān)心肺損傷模型的構(gòu)建及評價

陳鶴翔，何 旋，吳曉靜，夏中元，唐 杰

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430060；2.咸豐縣人民醫(yī)院麻醉科，湖北 咸豐 445699）

膿毒癥（sepsis）是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，其重點則是器官受損，而膿毒癥引起的心肺靶器官損傷則是臨床常見的急、危重癥，發(fā)病率和死亡率皆極高[1，2]。構(gòu)建模擬臨床膿毒癥模型對探索膿毒癥及相關(guān)器官損傷的發(fā)病機(jī)制并尋求有效的預(yù)防治療手段極其重要和關(guān)鍵。目前應(yīng)用的盲腸結(jié)扎穿孔致膿毒癥模型因手術(shù)操作及腸道菌群組成等差異而常常具有較大的變異性，腹腔注射脂多糖致膿毒癥模型因其致病方式統(tǒng)一且可控、引起臨床表現(xiàn)同質(zhì)，以及可產(chǎn)生膿毒癥休克等嚴(yán)重的病理反應(yīng)[3-5]，后者可有效應(yīng)用于膿毒癥臨床前的實驗研究，但關(guān)于其心肺損傷情況的具體研究卻甚少。因此，本研究擬通過構(gòu)建脂多糖誘導(dǎo)大鼠膿毒癥模型，觀察其心肺損傷特征，為建立可靠的膿毒癥相關(guān)器官損傷模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF 級Sprague-Dawley 大鼠20 只，購自湖南省實驗動物中心。動物合格證號：SYXK（湘）2020-0015，體重200～230 g，6～8 周齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本研究已通過武漢大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物福利倫理審查，編號：WDRM 動 (福)第20200820 號。

1.2 主要試劑與儀器 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號：L2880）購自Sigma Aldrich 公司，白介素1β（interleukin-1β，IL-1β，批號：ab255730）、白介素6（IL-6，批號：ab234570）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α，批號：ab46070）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP，批號：ab108815）及肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI，批 號：ab246529）酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自Abcam公司，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB1，批號：ARG81351）ELISA 檢測試劑盒購自Arigo 公司，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超聲診斷掃描儀購自Sonosite 公司，BX51-P 光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus 公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為2 組（=10）：對照組（C 組）和LPS 模型組（LPS 組），并行大鼠膿毒癥模型的制備，實驗前禁食12 h，自由飲水。將LPS 用無菌生理鹽水配制成1 mg/ml LPS 溶液，LPS 組腹腔注射1 mg/ml LPS 溶液（10 mg/kg），C 組腹腔注射等容量無菌生理鹽水。

1.3.2 心臟超聲檢測大鼠心功能 大鼠建模24 h 后使用2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行腹腔內(nèi)注射法麻醉。麻醉后的大鼠固定于操作臺上，前胸部備皮，使用超聲診斷掃描儀，將頻率12 MHz 超聲探頭置于胸骨旁左心室長軸切面，測量左室收縮末期內(nèi)徑、左室舒張末期內(nèi)徑，M 型超聲選取3 個心動周期測量取平均值，根據(jù)Teichholtz 公式計算左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），并觀察大鼠心肌收縮力及室壁運(yùn)動幅度情況。

1.3.3 大鼠血清及心肺組織標(biāo)本收集 心超檢測結(jié)束后立即打開大鼠胸腔，使用采血針左心室釆血3 ml，加入干燥試管，4 ℃下3000 g（離心半徑7.7 cm）離心15 min 后，取上清液，-80 ℃保存待用。同時，取大鼠心臟放入4 ℃生理鹽水漂洗，沿左心室最大橫徑冠狀切面取左心室心肌組織，置入40 g/L 多聚甲醛溶液中固定12 h 用于HE 染色。最后充分的暴露肺組織，完整取下整個肺臟組織備檢測余下指標(biāo)。

1.3.4 ELISA 檢測相關(guān)炎癥因子及心肌損傷指標(biāo) 采用 ELISA 測定血清中 IL -1β、IL -6、TNF -α、HMGB1、BNP 及cTnI 的含量，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行操作。于96 孔板上標(biāo)注相應(yīng)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測孔區(qū)域。空白孔先留置，50 μl 的標(biāo)準(zhǔn)品依不同濃度各加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品孔，40 μl 的稀釋液和10 μl 的待測樣本加入待測孔。之后在待測孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μl，空白孔則不加，并將反應(yīng)孔用封板膜封住，進(jìn)行60 min 恒溫溫箱溫育，結(jié)束后棄去液體，并于濾紙上拍干。隨后將洗滌液加滿孔中，1 min 靜置后甩去并繼續(xù)拍干，前后如此洗板5 次。最后將底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺工作液加入所有孔中，行15 min 37 ℃避光培育后將50 μl 硫酸終止液加入所有孔，并于15 min 的時間內(nèi)在波長450 nm 處進(jìn)行所有孔的光密度值測量。行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，3個復(fù)孔取平均值，計算血清樣本中待測樣本含量。

1.3.5 HE 染色觀察心肌組織病理學(xué)變化 心肌組織標(biāo)本固定后行脫水、透明、包埋處理，使用時切片。在心肌組織標(biāo)本染色之前先使用二甲苯對切片進(jìn)行脫蠟，隨后入濃度由高到低乙醇以及蒸餾水。使用蘇木精對切片進(jìn)行數(shù)分鐘的染色，并于酸水及氨水中各數(shù)秒鐘進(jìn)行分色處理。使用流水對切片進(jìn)行1 h 沖洗并放入蒸餾水片刻，之后使用70%和90%乙醇對切片進(jìn)行10 min 脫水，并使用伊紅對切片進(jìn)行數(shù)分鐘的染色。切片經(jīng)染色后使用無水乙醇脫水，并再次使用二甲苯透明處理。使用樹膠滴于切片上，蓋玻片進(jìn)行封固，即可于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)變化。

1.3.6 肺損傷檢測 留取左肺組織固定于4%多聚甲醛中進(jìn)行病理學(xué)觀察并行Smith 評分[6]。固定后對肺組織進(jìn)行脫水、透明，石蠟包埋、切片，后行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察兩組大鼠肺組織病理學(xué)改變，并請兩位病理科醫(yī)師進(jìn)行讀片，對病理切片顯示的肺組織損傷程度進(jìn)行評分。評分根據(jù)肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張和透明膜形成的程度分別按各項嚴(yán)重程度行0～4 分的評定，無改變亦或非常輕微改變?yōu)? 分，輕度、中度、重度、極重度改變依次為1、2、3、4 分，各項評分之和即評定為肺損傷評分。

1.3.7 肺組織濕干比檢測 取右肺組織，用濾紙將肺表面的水分吸干，并使用電子稱快速稱量其重量，此重量為大鼠肺組織濕重（W），然后置于80 ℃電熱恒溫干燥箱中烤72 h 至恒重后稱其重量，此重量為大鼠肺組織干重（D），大鼠肺組織濕重值/大鼠肺組織干重值，即為大鼠肺組織濕干比（wet/dry，W/D）。通過計算W/D 來測量含水量，以評估肺組織的水腫程度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本檢驗，＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 誘導(dǎo)大鼠膿毒癥造模成功及血清中相關(guān)炎癥因子水平 LPS 腹腔注藥數(shù)小時后，大鼠逐漸開始表現(xiàn)有精神萎靡、呼吸短促，對刺激反應(yīng)減弱等，12 h 后甚至有大鼠發(fā)生死亡，大鼠膿毒癥模型制備成功，造模24 h 內(nèi)LPS 組大鼠死亡4 只，存活大鼠納入統(tǒng)計。與C 組大鼠比較，LPS 組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 及HMGB1 等相關(guān)炎癥因子水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），見表1。

表1 兩組大鼠存活率及血清中相關(guān)炎癥因子含量的比較（±，pg/ml）

表1 兩組大鼠存活率及血清中相關(guān)炎癥因子含量的比較（±，pg/ml）

2.2 大鼠心功能及心肺損傷情況 造模24 h 后行心臟超聲檢查顯示，LPS 組大鼠心肌收縮力和室壁運(yùn)動幅度出現(xiàn)減弱，LVEF 較對照組降低（＜0.05）。LPS 組大鼠血清中BNP 及cTnI 等心肌損傷指標(biāo)水平升高，肺損傷評分及肺組織W/D 升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），見表2。

表2 兩組大鼠心功能及心肺損傷情況的比較（）

表2 兩組大鼠心功能及心肺損傷情況的比較（）

2.3 光鏡下觀察心肺組織病理學(xué)改變 C 組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，支氣管腔及肺泡腔內(nèi)無明顯病理改變，見圖1A。LPS 模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整性消失，肺泡及肺間質(zhì)大量出血，組織水腫，炎癥細(xì)胞大量浸潤（中性粒細(xì)胞為主），肺泡間隔增厚，見圖1B。C 組大鼠心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)無異常，核居中，橫紋清楚，心肌細(xì)胞無明顯水腫、變性及壞死，未見炎性細(xì)胞浸潤，見圖1C。L 組大鼠心肌纖維排列欠規(guī)整，心肌細(xì)胞明顯水腫、部分心肌細(xì)胞核消失、炎性細(xì)胞浸潤，變性壞死明顯、紅細(xì)胞滲出多，心肌損傷嚴(yán)重，見圖1D。

圖1 兩組大鼠心肺組織病理形態(tài)變化（HE 染色，×200）

3 討論

膿毒癥和膿毒癥休克每年可威脅全球數(shù)百萬人的生命健康，其死亡率高達(dá)30%，心肺臟器是膿毒癥介導(dǎo)臟器損傷的常見靶器官，其損傷是膿毒癥不良預(yù)后的重要標(biāo)志[7]。目前膿毒癥建模并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，其伴隨器官損傷模型也無明確評定標(biāo)準(zhǔn)，故探索構(gòu)建并評價一種膿毒癥及其伴隨重要臟器損傷模型具有重要意義。研究顯示[8]，單次腹腔注射LPS 可用于有效制備大鼠膿毒癥相關(guān)重要臟器損傷模型，LPS 20 mg/kg 腹腔注射5～12 h 后即可開始觀察到肝臟、胃腸道及心肌等重要臟器損傷，為更明確的觀察心肺組織損傷情況并降低模型死亡率，經(jīng)過相關(guān)預(yù)實驗后本研究采用了腹腔注射LPS 10 mg/kg 制備大鼠膿毒癥模型以用于24 h 后觀察心肺組織損傷情況。

本研究通過大鼠腹腔注射LPS，發(fā)現(xiàn)大鼠隨時間進(jìn)展明顯有精神萎頓、對刺激反應(yīng)減弱及呼吸短促等癥狀，且逐漸加重并于24 h 內(nèi)有一定死亡率，這些臨床快速篩查膿毒癥患者指標(biāo)[1，2]可初步證實大鼠膿毒癥模型成立。同時，在注射24 h 后存活大鼠心肌收縮力及室壁運(yùn)動幅度明顯減退，伴有LVEF 降低；血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1 及cTnI、BNP 含量顯著增加，且病理形態(tài)結(jié)果顯示心肌組織纖維水腫、細(xì)胞變性壞死、線粒體空泡破裂、伴有增加的炎性細(xì)胞浸潤等，肺組織肺泡壁顯著增厚、間質(zhì)性肺水腫、大量炎性細(xì)胞浸潤，且肺損傷評分及W/D 明顯升高。表明LPS 誘導(dǎo)大鼠膿毒癥及心肺組織損傷模型制備成功。

LPS 作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的關(guān)鍵性組成成分，注射LPS 誘導(dǎo)膿毒癥模型，可產(chǎn)生特定的內(nèi)毒素中毒模式，并可在短時間內(nèi)誘發(fā)大量炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1 等的釋放，引發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與C組大鼠比較，LPS 組大鼠無論血標(biāo)本亦或心肺組織標(biāo)本中相關(guān)炎癥因子皆明顯增多，證實機(jī)體發(fā)生了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，有效復(fù)刻了膿毒癥模型。這種非多種微生物感染膿毒癥模型雖并不能完全模擬膿毒癥病理生理變化，但其致病方式統(tǒng)一且可控，相關(guān)炎癥因子檢測明確，使其具有一定的同質(zhì)性，避免了盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥模型因宿主對感染反應(yīng)不同而產(chǎn)生的較大變異性[9，10]。同時，在該條件下，LPS 還可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB 及絲裂原活化蛋白激酶等信號通路增加下游多種炎癥介質(zhì)的釋放，并可致機(jī)體強(qiáng)氧化應(yīng)激狀態(tài)引起線粒體功能及能量代謝障礙等，進(jìn)而在多種相關(guān)病理生理機(jī)制下造成急性肺損傷和心肌損傷等重要臟器功能障礙[11，12]。研究也證實[13-15]，這些炎癥因子水平的高低與心肺損傷的程度直接相關(guān)。

臨床中關(guān)于膿毒癥心肌損傷的大量研究是通過超聲心動圖進(jìn)行[16，17]，而cTnI 由于其高特異性和敏感性則被用于定義心肌損傷[18]。另有研究顯示[19]，在心肌損傷時BNP 升高變化可能更早于cTnI，可作為各種因素致心肌損傷早期診斷發(fā)現(xiàn)的一個較為敏感指標(biāo)。Smith 評分作為半定量評分系統(tǒng)可有效的對損傷肺組織病理形態(tài)進(jìn)行評分，而W/D 則可直接評定肺組織的水腫程度[6，20]。因此，本研究檢測了以上相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)LPS 組大鼠心肌損傷標(biāo)志物、心功能等明顯病變及肺損傷評分、W/D 等明顯升高，表明LPS 誘導(dǎo)膿毒癥后心肺損傷嚴(yán)重，并可充分提供膿毒癥心肺損傷模型的相關(guān)評定指標(biāo)。

綜上所述，通過腹腔注射脂多糖可成功誘導(dǎo)大鼠膿毒癥并構(gòu)建其相關(guān)心肺損傷模型，且該方法建立的膿毒癥及心肺組織損傷模型穩(wěn)定、可靠，可為探討膿毒癥及心肺組織損傷的病理機(jī)制及預(yù)防保護(hù)措施提供模型基礎(chǔ)。