9種重樓屬植物葉中甾體皂苷成分差異的研究

李龍星 李海峰 王成軍*

1.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室(培育)，云南 大理 671000；2.大理大學藥學院，云南 大理 671000；3.大理大學分析測試中心，云南 大理 671000

重樓屬(ParisL.)為百合科(Linnaeus)草本植物，全世界有 24 種，我國有 19 種，主要分布于云南、廣西、四川等地，其中七葉一枝花ParispolyphyllaSm.var chinensis (Franch.)和滇重樓ParispolyphyllaSm.var.yunnanensis (Franch.)被歷版《中華人民共和國藥典》所收載，是重樓藥材的基源植物，重樓藥材以干燥根莖入藥[1]，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，可用于咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛等癥的治療[2-3]，是云南白藥、宮血寧膠囊、季德蛇藥等著名中成藥的主要原料，甾體皂苷類物質是其主要有效成分[4]，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ總含量是《中國藥典》(2020 版一部)用于質量控制的指標性成分[5]。

云南是重樓藥材的主要來源地，經過長期無序大量的野生采挖，致使資源日漸枯竭，野生資源瀕臨滅絕[4]。因金線重樓、南重樓、毛重樓、黑籽重樓等重樓屬植物根莖與七葉一枝花及滇重樓根莖植物學形態無顯著差異，所以在云南金線重樓、南重樓、毛重樓、黑籽重樓等重樓屬植物作為重樓藥材替代品銷售入藥現象極其普遍，這勢必影響到與其相關中成藥的品質。重樓屬植物甾體皂苷類物質是在植物葉綠體中合成，經莖向下運輸，主要在根莖中積累和儲存[1]。筆者前期研究[6-7]發現，黑籽重樓、長柱重樓與滇重樓、滇重樓(闊瓣)、金線重樓、毛重樓、五指蓮、多葉重樓、南重樓等重樓屬植物根莖中甾體皂苷類物質差異較大，這種差異可能與不同品種重樓屬植物甾體皂苷類物質在植物葉綠體中生物合成差異有關，是導致重樓屬植物品質差異的根本。因此，本研究擬采用液質聯用技術(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)對9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質進行定性分析[8-10]，以及質荷比(m/z)50～2000 Da之間的主成分(principal component analysis，PCA)及主要差異峰進行分析，為9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質差異及其利用提供依據。

1 材料

2020年9月，在云南大理、保山等地采集重樓屬植物樣品，植株樣品由大理大學李海峰教授鑒定，見表1，新鮮樣品自然干燥，備用。

表1 重樓屬藥用植物樣品信息表

對照品重樓皂苷Ⅰ(批號111590-2004022)，重樓皂苷Ⅱ(批號111591-200301)，重樓皂苷Ⅵ(批號111591-200301)，重樓皂苷Ⅶ(批號111590-200402)，均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為超純水，無水乙醇等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 9種重樓屬植物葉中甾體皂苷有效成分的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Dionex-C18(150 mm×2.1 mm，3 μm)；流動相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0～12 min B相為45%～60%，12～25 min B相為60%～30%，25～28 min B相為30%～100%，28～30 min B相為100%，30～35 min B相為100%～45%，35～40 min B相為45%；檢測波長203 nm；柱溫30 ℃；流速0.2 mL·min-1；進樣量10 μL。

2.1.2 質譜條件 參照筆者建立的方法[6-7]，Bruker Q-TOF-MS質譜系統，離子源為電噴霧離子源，正離子模式掃描，離子源溫度是220 ℃，金屬毛細管電壓是4000 V，終板抵消電壓是500 V，霧化器壓力是253.8 kPa，干燥氣體是氮氣，干燥溫度是350 ℃，氣體流速每鐘8 L，掃描質量范圍m/z 50～2000 Da，碰撞氣體氬氣，掃描碰撞能量 8 eV，六級桿射頻電壓是70 Vpp，四級桿離子能量是8 eV，質量數用Na[NaCOOH]溶液作校正。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 在十萬分之一分析天平上分別精密稱取重樓皂苷Ⅰ1.13 mg、重樓皂苷Ⅱ1.02 mg、重樓皂苷Ⅵ1.16 mg、重樓皂苷Ⅶ1.08 mg對照品，加入到10 mL容量瓶，加甲醇溶解，稀釋至刻度定容，混合均勻，即得 0.113 mg·L-1、0.102 mg·L-1、0.116 mg·L-1、0.108 mg·L-1重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對照品溶液，4 ℃冷藏，備用。

2.1.4 9種重樓屬植物葉供試品溶液的制備 分別取9種重樓屬植物葉，細粉，干燥箱中40 ℃干燥到恒重，過100目篩，分別在50 mL玻璃三角瓶中精密稱取9種重樓屬植物葉樣品粉末 0.1000 g，分別加75%乙醇4 mL，40 ℃ 40 kHz 超聲浸提20 min，過濾，收集濾液，濾渣分別用 2 mL 75%乙醇重復超聲浸取2次，合并3次浸提液，加入到10 mL容量瓶，冷卻到室溫，加乙醇溶液至刻度定容，混全均勻，即得9種重樓屬植物葉供試品溶液，液質聯用進樣前用0.22 μm微孔有機相濾膜過濾。

2.1.5 方法專屬性 分別在正離子和負離子模式下對重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對照品溶液進行液質聯用測試，結果顯示，在正離子模式下混合對照品溶液質譜響應較好，負離子模式下混合對照品溶液響應較小，所以實驗在正離子模式下進行定性分析，分別得到重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對照品溶液色譜圖(A)和總離子流圖(B)，結果如圖1所示，方法專屬性良好。

1.重樓皂苷Ⅶ；3.重樓皂苷Ⅵ；4.重樓皂苷Ⅱ；7.重樓皂苷Ⅰ

2.2 9種重樓屬植物葉中甾體皂苷有效成分分析 分別取“2.1.3”重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對照品溶液及“2.1.4”9種重樓屬植物葉供試品溶液，在“2.1.1”及“2.1.2”項下進行液質聯用測定，每個樣品進樣10 μL，分別測得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ混合對照品及9種重樓屬植物葉的質譜數據，用Bruker Daltonics公司Data Analysis數據處理軟件進行數據分析，并與重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品溶液質譜數據進行匹配，分析并鑒定9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質。在正離子掃描模式下，用甲酸鈉質荷比m/z 90.9766進行電噴霧離子源內部校正，模式為HPC，搜索范圍為0.05，強度為1000，設置micrQ-TOF外標法最大誤差為m/z>400(5 ppm)或m/z<400(4 mDa)。使用Chemistry對9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質進行定性分析，用Smart Formula計算質譜圖中所出峰分子式，Smart Formula Manually計算某一特定m/z峰的分子式，選中質譜圖中分子離子峰，輸出相應分子離子峰的分子式。

2.3 9種重樓屬植物葉中主成分PCA模型的建立 將“2.2”測得的9種重樓屬植物葉中質譜數據導入Bruker Daltonics公司Profil Analysis軟件，再根據9種重樓屬植物進行單因素分組建模，建立PCA模型，分析9種重樓屬植物葉中主成分差異。質量范圍設為50～2000 m/z，時間范圍設為0.2～40 min，時間容差設為2 min，質量容差設 1.0 m/z，強度歸一化，無數據前處理，無背景扣除，無干擾峰扣除。

2.4 9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質的測定 對金線重樓、毛重樓、南重樓、黑籽重樓、長柱重樓、多葉重樓、滇重樓(闊瓣)、七葉一枝花、滇重樓植物葉進行液質聯用測定，分析正離子模式進行質譜數據，結果表明，正離子模式下9種重樓屬葉中主成分均有較好的響應，所以用正離子模式下數據進行質譜分析，得到9種重樓屬植物葉的色譜圖(a)和總離子流圖(b)，如圖2所示。

圖2 重樓屬植物葉色譜圖(a)和總離子流圖(b)

2.5 9種重樓屬植物葉中主要甾體皂苷有效成分分子式分析 對所測得的9種重樓屬植物葉質譜數據進行分析，并與重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品質譜數據進行匹配，以及結合部分碎片信息、筆者前期建立的化合物庫信息、文獻報道，鑒定9種重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質，得到9種重樓屬植物葉中分子離子峰所對應的樣品理論分子量及誤差，結果見表2、表3。

表2 重樓屬9種植物葉中主要甾體皂苷有效成分理論分子量及誤差比較

如圖3所示，2號峰在正離子模式可見m/z 871.4623 [M+H]+和m/z 893.4598 [M+Na]+，結合出峰時間與離子碎片可推測為重樓皂苷 H(C44H71O17，3-O-α-L-rha(1→2)[α-L-ara(1→4)]-β-D-glc)。如圖4所示，5號峰在正離子模式可見m/z 869.4948 [M+H]+和m/z 891.4685 [M+Na]+，結合出峰時間、離子碎片綜合推測為纖細薯蕷皂苷(Dioscin，C45H72O16，3-O-α-L-ha(1→2)[α-L-rha (1→4)]-β-D-glc)。如圖5所示，6號峰在正離子模式可見m/z 885.4626 [M+H]+和m/z 907.4419 [M+Na]+，結合出峰時間、離子碎片綜合推測為纖細薯蕷皂苷(Gracillin，C45H72O17，3-O-β-D-glc (1→3)[α-L-rha(1→2)]-β-D-glc)。如圖6所示，8號峰在正離子模式可見m/z 723.4260 [M+H]+和m/z 745.4223[M+Na]+，結合出峰時間、離子碎片綜合推測為重樓皂苷Ⅴ[C39H62O12，3-O-α-L-rha(1→2)-β-D-glc]。

圖3 重樓皂苷H質譜圖

圖4 薯蕷皂苷質譜圖

圖5 纖細薯蕷皂苷質譜圖

圖6 重樓皂苷Ⅴ質譜圖

A.重樓皂苷H；B.薯蕷皂苷；C.纖細薯蕷皂苷；D.重樓皂苷Ⅴ

2.6 9種重樓屬植物葉中主成分PCA分析 分析9種重樓屬植物葉中正離子模式下質譜質數據主成分PCA及主要差異峰，PCA主成分 (圖8)及主要差異峰(圖9)結果表明，在PC第一維度，9種重樓屬植物葉中主成分能夠得到較好的分離，可大致聚為四類。其中CZCL(長柱重樓)、JXCL(金線重樓)、DCL(滇重樓)、DYCL(多葉重樓)、NCL(南重樓)、YZH(七葉一枝花)分布集中，可以聚為第一類，主要化學成分無顯著差異；MCL(毛重樓)可聚為第二類，與重樓屬6種植物之間距離最近，主成分差異最小；HZCL(黑籽重樓)可聚為第三類；KBCL[滇重樓(闊瓣)]可聚為第四類，與重樓屬6種植物之間距離最遠，主成分差異最大。且從分析結果可得在30.70 min，450.500 m/z(A)；14.70 min，330.500 m/z(B)；6.70 min，382.500 m/z(C)；15.70 min，456.500 m/z(D)；10.70 min，496.500 m/z(E)；12.70 min，536.500 m/z(F)；19.70 min，480.500 m/z(G)；1.70 min；164.500 m/z(H)；1.70 min，381.500 m/z(I)；34.70 min，284.500 m/z(J)；13.70 min，496.500 m/z(K)；16.70 min，466.500 m/z(L)；11.70 min，496.500 m/z(M)這幾個時間點為主要差異峰。

3 討論

運用液質聯用方法定性分析9種重樓屬植物葉中重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ(薯蕷皂苷)、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷 H及纖細薯蕷皂苷等8種甾體皂苷，結果表明，金線重樓、南重樓、七葉一枝花葉中均檢測到8種甾體皂苷，黑籽重樓、多葉重樓、滇重樓(闊瓣)葉中檢測到7種甾體皂苷，滇重樓、毛重樓葉中檢測到6種甾體皂苷，長柱重樓葉中檢測到4種甾體皂苷，重樓皂苷Ⅰ、纖細薯蕷皂苷在9 種植物葉中均檢測到。根據重樓屬9種植物葉正離子模式下液質數據的主成分PCA模型可將滇重樓、金線重樓、長柱重樓、多葉重樓、南重樓、七葉一枝花聚一類，主要化學成分無顯著差異。

雖然重樓屬植物葉中甾體皂苷類物質均經異戊二烯代謝途徑合成[10]，但是不同品種在不同氣候、土壤等生態因子的共同作用下可能是引起重樓屬植物葉中化學成分差異的根本，這種差異可能與不同品種重樓屬植物甾體皂苷類物質在植物葉綠體中生物合成差異有關，是導致重樓屬植物品質差異的根本。而這種差異的形成值得進一步深入探討，為從生物合成途徑研究其它重樓屬植物替代滇重樓和七葉一枝花入藥提供依據。

另外，云南是重樓藥材的主要來源地，經過長期無序大量的野生采挖，致使資源日漸枯竭，野生資源瀕臨滅絕[4]。因金線重樓、南重樓、毛重樓、黑籽重樓等重樓屬植物根莖與七葉一枝花及滇重樓根莖植物學形態無顯著差異，該文研究結果顯示8種主要甾體皂苷有效成分和化學成分種類無顯著差異。用重樓莖、葉替代根莖入藥值得深入研究。