基于網絡藥理學和分子對接探討升陽益胃湯治療萎縮性胃炎機制

魯嘉欣

慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)是一種由多致病因素引起的消化系統慢性疾病,以胃黏膜上皮和腺體萎縮,數目減少,胃黏膜變薄,黏膜基層增厚,或伴有腸上皮化生,或有不典型增生為特征[1]。目前現代醫學采用根除幽門螺桿菌以及服用促動力藥、抑酸藥、胃黏膜保護劑、葉酸及維生素B12等作為主要治療手段,但這些療法對其癥狀的緩解及阻止黏膜病變進展的效果并不理想[2]。

升陽益胃湯出自《內外傷辨惑論》,此湯主治脾胃氣虛,清陽不升,濕郁生熱之證。周迎春教授應用此方,緊抓 “脾胃虛弱,陽氣不升,濕熱中阻”的核心病機,并概括其用藥指征為“乏倦納差口干苦,腹脹便溏或 便黏,舌淡胖大有齒痕,苔白黃膩并脈滑”,用于治療慢性胃炎等疾病[3]。有研究認為CAG患者臨床辨證分型以脾胃虛弱證型較多,在升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎脾胃虛弱證的療效觀察中發現,升陽益胃湯能有效改善臨床癥狀,提高臨床療效[4]。然而,目前關于升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的臨床療效觀察較少涉及藥理學研究,其潛在靶點及藥理學作用機制進一步研究。

本研究以升陽益胃湯為基礎,基于網絡藥理學理論,初步探討升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機制,構建了藥物的活性成分、藥物靶點與慢性萎縮性胃炎相關疾病基因之間的相互作用網絡,打破既往的藥物“單一成分、單一靶點、單一疾病”理念,為升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的臨床治療和相關科學研究提供支持。

1 材料和方法

1.1 升陽益胃湯中藥活性成分篩選 靶點預測通過TCMSP和Herb數據庫對黃芪、半夏、人參、炙甘草、獨活、防風、白芍、羌活、陳皮、茯苓、柴胡、澤瀉、白術、黃連進行活性成分的收集。以化合物口服生物利用度(OB,%)≥30%,類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件并且將無靶點的成分篩選掉。

1.2 慢性萎縮性胃炎相關靶點的獲取通過在GeneCards、OMIM、DisGent數據庫中輸入關鍵詞“Chronic atrophic gastritis”進行檢索,以“Relevance score”大于等于1作為標準進行篩選,最終從而得到慢性萎縮性胃炎相關靶點。

1.3 藥物-疾病靶點預測結果將獲得的藥物作用靶點與慢性萎縮性胃炎靶點作韋恩圖,從而獲得交集基因。然后使用Cytoscape 3.8.2軟件構建“化合物-作用靶點”網絡,根據化合物與靶點的連接情況篩選出藥物作用于慢性萎縮性胃炎的關鍵化合物。

1.4 靶蛋白相互作用及核心靶點篩選為了進一步研究藥物治療慢性萎縮性胃炎的蛋白之間的相互作用,將藥物-交集基因上傳至相互作用數據庫String進行蛋白相互作用網絡構建(PPI)數據庫;運用Cytoscape挑選核心的靶點做出蛋白相互作用網絡圖。

1.5 GO富集分析和KEGG通路分析將藥物-疾病交集基因進行GO、KEGG功能富集分析,利用微生信平臺GO基因功能從生物過程、細胞成分、分子功能三方面注釋藥物治療慢性萎縮性胃炎的作用靶蛋白在基因功能中的作用。為闡明藥物治療慢性萎縮性胃炎的靶點在信號通路中進行KEGG通路富集分析。選取GO功能條目和KEGG通路條目(P<0.05)作為藥物治療慢性萎縮性胃炎的主要基因功能富集過程和信號通路,預測中藥治療慢性萎縮性胃炎的作用機制。

1.6 分子對接將拓撲學參數排名靠前的大分子和小分子進行分子對接。使用AutodockTools1,2對蛋白質晶體結構進行去水、加氫操作,并進行受體結構準備工作。使用Open Babel及Autodock 程序對小分子庫進行拆分等準備工作。對接使用Autodock程序進行,最終將結果導入pymol進行對接結果的可視化。

2 結果

2.1 升陽益胃湯活性成分篩選及靶點預測通過TCMSP和Herb數據庫檢索并篩選,最終共得到黃芪16個、半夏11個、人參17個、炙甘草62個、獨活6個、防風17個、白芍7個、羌活12個、陳皮5個、茯苓6個、柴胡11個、澤瀉5個、白術4個、黃連11個,共得到279個有效靶點。

2.2 慢性萎縮性胃炎相關靶點通過在GeneCards、DisGent、DisGent數據庫檢索慢性萎縮性胃炎相關的靶點,合并去重后共獲得841個靶點。

2.3 藥物-疾病靶點預測結果利用韋恩圖得到藥物-疾病交集基因102個,將上述所得的活性成分和有效交集靶點數據導入到 Cytoscape 3.8 進行網絡構建,獲得疾病-成分-靶點網絡。對疾病-成分-靶點網絡進行分析,各成分degree 值信息見圖1。其中自由度前五的活性成分分別為quercetin、kaempferol、7-O-methylisomucronulatol、formononetin、naringenin,推測可能是復方的重要成分。見圖1。

圖1 核心成分拓撲學參數

圖2 核心靶點度值

2.4 核心靶點及網絡相互作用將共有靶點導入String數據庫,構建PPI網絡,該網絡共有82個結點和252條邊。為進一步得到核心蛋白,再次將共有靶點導入String平臺,所得網絡進行可視化處理,進一步篩選核心靶點,最終得到升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的核心靶點共10個,分別為AKT1、TP53、IL6、TNF、JUN、VEGFA、IL1B、CASP3、PTGS2、STAT3。

2.5 生物功能富集分析

2.5.1 GO富集分析利用R軟件進行GO基因功能富集分析,共篩選出多條GO條目,其中生物過程(BP)相關的有3846條,細胞成分(CC)相關的242條,分子功能(MF)相關的350條。

2.5.2 KEGG通路富集分析利用R軟件進行KEGG通路富集分析,共富集到233條與藥物治療慢性萎縮性胃炎相關的通路,根據P<0.05篩選出藥物治療慢性萎縮性胃炎相關的通路,分別是:糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、乙型肝炎信號通路、膀胱癌癥信號通路、TNF信號通路、Th17細胞分化信號通路等。

2.6 分子對接分子對接結合熱能<-1 kcal·mol-1表示具有結合活性,<-5 kcal·mol-1表示結合活性較好。因此,由AutodockTools1.5.6軟件分子對接結果可知:拓撲學參數靠前的中藥化合物小分子quercetin、kaempferol與PPI核心蛋白拓撲學參數前10的大分子受體均具有良好的結合活性。其中quercetin、kaempferol與AKT1、TNF的結合熱能較低,結合活性較好。見表1。

表1 結合能表

3 討論

通過網絡藥理學分析發現quercetin、kaempferol、7-O-methylisomucronulatol、formononetin、naringenin是本次研究中的重要成分。naringenin是一種具有多重結構的生物堿成分,研究發現其活性成分的提取物與慢性萎縮性胃炎發作密切相關,是治療慢性萎縮性胃炎藥物的重要載體,其主要作用機制可能和免疫調節有關,有待更多動物研究佐證[5]。體內和體外研究表明,含類黃酮和不含類黃酮的植物都有可能降低慢性萎縮性胃炎的發病率,在本研究中,山奈酚作為黃酮類物質,被認為具有潛在的抗慢性萎縮性胃炎能力,這可能和其具有抗慢性萎縮性胃炎的植物成分有關[6]。山奈酚同時具有抗利尿和抗心律失常的潛力,可以對抗各種感染類疾病[7]。研究發現,慢性萎縮性胃炎的發作過程和氧化還原反應密切相關,這可能和神經細胞發生改變有關,以氧化應激為靶點的臨床藥物,可明顯減少慢性萎縮性胃炎患者的發作頻率[8]。在眾多的抗慢性萎縮性胃炎藥物研究中發現,黃酮類物質可以通過調節氧化還原反應來發揮治療慢性萎縮性胃炎的作用。研究發現,氧化應激反應會產生應激損傷,而黃酮類物質會清除損傷產生的自由基從而發揮治療疾病的作用[9]。山柰酚可以明顯改善患者的氧化應激損傷,降低患者的氧化應激水平[10]。同時,黃酮類物質可以與治療藥物中的結合位點相結合,與藥物共同發揮治療疾病的作用,保護大腦免受氧化應激的傷害。研究發現,炎癥反應在慢性萎縮性胃炎的發生發展中扮演著重要的角色[11]。formononetin被認為與炎癥反應密切相關,能夠通過平衡 GABA-A 受體,降低丙二醛和TNF-α水平,升高谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和過氧化氫水平,影響神經炎癥從而發揮抗慢性萎縮性胃炎的作用[12]。

成分-靶點網絡及PPI網絡綜合分析的結果顯示,AKT1、TP53、IL6、TNF、JUN等靶點可能是升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的核心作用靶點。研究發現,AKT1、IL6、TNF等炎癥因子通過參與炎癥反應干預慢性萎縮性胃炎進程,是重要的胃炎調控蛋白,其可能是通過多種炎癥通路來發揮作用[13]。GO富集分析結果表明,升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎靶點的功能主要體現在對氧化應激反應、細胞對化學應激的反應、活性氧代謝過程、細胞對氧化應激的反應、對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、對活性氧的反應、對金屬離子的響應;細胞成分(CC)相關的有242條,涉及膜筏、膜微區、膜區、質膜筏、小窩、突觸前膜的組成部分、突觸前膜的內在成分等;其中分子功能(MF)相關的有350條,涉及碳酸鹽脫水酶活性、藥物結合、水解酶活性等。主要涉及的通路有AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、乙型肝炎信號通路、膀胱癌癥信號通路、TNF信號通路、Th17細胞分化信號通路等。研究證實,免疫、炎癥、氧化還原、離子轉運與細胞凋亡和慢性萎縮性胃炎發生發展密切相關[14],促炎性信號通路IL-17信號通路、TNF信號通路與自身免疫系統炎癥密切相關,信號通路被激活后立刻參與自身炎癥反應,這可能和相關有效因子被激活有關,調控相關信號通路,可以調控慢性萎縮性胃炎的“神經免疫性炎癥”過程[15]。

綜上,基于網絡藥理學方法對升陽益胃湯治療慢性萎縮性胃炎作用機制進行挖掘并分析后表明,升陽益胃湯的活性成分quercetin、kaempferol、7-O-methylisomucronulatol、formononetin、naringenin等可通過AKT1、TP53、IL6、TNF、JUN等靶蛋白介導AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、乙型肝炎信號通路、膀胱癌癥信號通路、TNF信號通路、Th17細胞分化信號通路發揮抗慢性萎縮性胃炎作用。闡明了升陽益胃湯干預調控治療慢性萎縮性胃炎的分子作用機制,既體現了中藥治療慢性病多途徑,多靶點,多通路的治療方式,也驗證了中醫學的整體醫學觀,為后期臨床研究提供了理論支持。