降糖1號關黃柏部分的提取工藝研究

張建芬， 陳蔚青， 蔣新龍

(浙江樹人大學生物與環境工程學院，浙江杭州310015)

降糖1號是臨床經驗方，由桑白皮、黃芪、女貞子、關黃柏等七味中藥組成［1］。具有明顯地降低糖尿病患者的血糖水平，改善糖尿病的并發癥等功效。為了將其開發成治療糖尿病的中藥新藥，更有效的發揮其作用，作者所在的課題組對其進行了提取工藝的研究。根據處方中藥物有效成分的理化性質，將處方中的藥味分為關黃柏提取部分和黃芪提取部分。關黃柏、女貞子中有效成分多為脂溶性成分，故用乙醇提取;黃芪、地骨皮等五味藥材中與降血糖相關的成分多為水溶性成分，故用水提取。關黃柏提取部分以具有降血糖活性的有效成分鹽酸小檗堿的得率為指標［2］。采用單因素試驗法考察關黃柏、女貞子合提、分提對實驗結果的影響，并采用正交試驗法優選關黃柏部分的提取工藝。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀:1525二元分析泵、717自動進樣器、2996光電二極管陣列檢測器、旋轉蒸發儀、電子天平。

1.2 試藥

關黃柏、女貞子均購自華東醫藥股份有限公司，關黃柏產地為遼寧;女貞子產地為四川;關黃柏藥材為蕓香科植物黃檗Pheuodendron amurense Rupr.的干燥樹皮。女貞子藥材為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實。鹽酸小檗堿對照品(批號:0713－9906)購自中國藥品生物制品檢定所;高效液相分析用乙腈為色譜純，水為雙蒸水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 鹽酸小檗堿含量測定方法［3－5］

2.1.1 色譜條件

色譜柱為:Waters Nova－Pak R C18柱(150 mm ×3.9 mm，5 μm);柱溫:25 ℃;以乙腈－0.1%磷酸溶液(48 ∶52)(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)為流動相;流速:1 mL/min;檢測波長為265 nm。

2.1.2 鹽酸小檗堿線性范圍考察

精密稱取鹽酸小檗堿8.21 mg于10 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度作為母液;精密吸取母液0.5、0.4、0.2、0.1、0.06、0.02 mL 定容至 1 mL 量瓶，配成 411、328、164.2、82.1、49.26、16.42 μg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液。精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標，以峰面積為縱坐標進行線性回歸，回歸方程為:y=44 430x－40 253，r=0.999 8，表明鹽酸小檗堿在0.164 2～4.11 μg之間有良好的線性。

2.2 關黃柏、女貞子合并提取與單獨提取對鹽酸小檗堿得率的影響

2.2.1 鹽酸小檗堿對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿8.21 mg于10 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度得鹽酸小檗堿的母液，精密取0.5 mL母液于5 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得鹽酸小檗堿的對照品溶液(82.1 μg/mL)。

2.2.2 樣品供試液的制備

2.2.2.1 關黃柏、女貞子合并提取樣品的制備 準確稱取關黃柏藥材7.5 g，女貞子5.0 g，加10倍量70%的乙醇，回流提取1 h，提取2次，合并提取液，轉移至250 mL的量瓶中，加70%的乙醇定容至刻度，過0.45 μm的微孔濾膜，取續濾液，即得A供試液，平行制備三個樣品供試液。

2.2.2.2 關黃柏單獨提取樣品的制備 準確稱取關黃柏藥材7.5 g，照上述樣品供試液制備方法制備樣品，即得B供試液，平行制備三個樣品供試液。

2.2.3 樣品供試液含量測定

精密吸取上述樣品供試液各10 μL和鹽酸小檗堿對照品溶液(245.55 μg/mL)10 μL，注入色譜儀，記錄峰面積，計算鹽酸小檗堿的含量。結果如表1所示:關黃柏與女貞子合并提取對鹽酸小檗堿得率有影響，為關黃柏單獨提取得率的72.1%，但影響不是很大，為簡化提取工藝，節省生產成本，綜合考慮將關黃柏與女貞子合并用乙醇提取。

表1 關黃柏、女貞子合提與關黃柏分提對鹽酸小檗堿提取得率的影響

2.3 關黃柏部分提取工藝優選

2.3.1 關黃柏部分提取工藝因素水平的確定

處方中關黃柏和女貞子合并后用乙醇提取，以鹽酸小檗堿的提取得率作為評價指標［6］，結合文獻與預試驗的結果，確定了對鹽酸小檗堿提取得率影響較大的四個因素:乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數，并確定了各因素的水平。見表2。

表2 正交試驗因素水平表

2.3.2 關黃柏部分藥材的提取

按處方比例準確稱取關黃柏藥材4.5 g，女貞子藥材3.0 g，95℃水浴回流提取，按L18(73)正交表安排試驗，提取液定容至250 mL量瓶。

2.3.3 鹽酸小檗堿對照品溶液的制備

按照2.2.1項方法制備。

2.3.4 關黃柏部分樣品供試液的制備

取18次實驗的樣品溶液，過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.3.5 測定方法

精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液(82.1 μg/mL)和樣品供試液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算樣品中鹽酸小檗堿的含量，結果如表3所示。

2.3.6 實驗結果的分析

方差分析結果表明(表4):提取次數和乙醇用量對鹽酸小檗堿得率影響較大，具有極顯著性意義，乙醇濃度與提取時間對鹽酸小檗堿的得率影響較小，各因素對鹽酸小檗堿得率影響的次序為:D＞B＞A＞C。直觀分析，A因素選2水平;B因素對鹽酸小檗堿得率影響較大，具有極顯著性意義，因此B因素選3水平;C因素對鹽酸小檗堿得率沒有顯著性差異，故選擇1水平;D因素對鹽酸小檗堿得率的貢獻最大，具有極顯著性意義，因此選3水平。A2B3C1D3為最佳方案。

表3 L18(73)正交實驗及結果表

表4 方差分析表

2.3.7 正交實驗的驗證

根據以上確定的工藝條件驗證3批，鹽酸小檗堿含量及浸膏得率結果如表5所示。可見，驗證試驗結果與正交試驗結果一致。據此確定關黃柏、女貞子乙醇提取的工藝條件為A2B3C1D3，即10倍量70%的乙醇提取3次，每次1 h。

表5 驗證試驗結果

3 討論

3.1 中華人民共和國藥典一部收載的關黃柏藥材中鹽酸小檗堿含量測定的流動相為［1］:乙腈－0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g)，按此方法測定，鹽酸小檗堿不能達到基線分離，可能是女貞子中的某些成分影響了鹽酸小檗堿的分離;故增大了緩沖鹽的比例，最終確定了上述的分析方法。

3.2 關黃柏與女貞子合并提取對鹽酸小檗堿得率影響不是很大，為簡化提取工藝，節省生產成本，綜合考慮將關黃柏與女貞子合并用乙醇提取。以優化的條件A2B3C1D3，即10倍量70%的乙醇提取關黃柏、女貞子3次，每次1小時進行工藝驗證，進一步證明此法提取可得到含量穩定的有效物質。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:99，214.

［2］魯云博，楊廣德.黃柏中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀提取方法研究［J］. 中成藥，2004，26(3):186－189.

［3］周德慶，郭志雄，羅澤淵，等.HPLC法測定黃柏中黃柏堿的含量［J］. 中成藥，2003，25(12):1002－1004.

［4］唐艷梅，葉 萌，向 麗，等.HPLC測定黃柏中的鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸藥根堿［J］.華西藥學雜志，2006，21(3):265－267.

［5］時維靜，陳文成，譚志靜.HPLC法測定黃柏不同炮制品中小檗堿的含量［J］.中國藥事，2009，23(2):134－132.

［6］施 群，施淑琴.川黃柏中鹽酸小檗堿的超聲提取工藝研究［J］. 江西中醫藥，2009，40(313):59－60.