微生物單細胞分離方法研究進展

張坤 閆暢 田新朋

（1.中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室 中國科學院海洋微生物研究中心 中國科學院南海海洋研究所，廣州 510301；2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室（廣州），廣州 511458；3.中國科學院大學，北京 100049）

細胞是所有生物的基本組成部分和進化的基本單位，研究單細胞對各個關鍵領域都具有重要意義［1］。隨著單細胞分離技術的產生與發展，單細胞分析受到了科學界的廣泛關注，單細胞分離技術的產生和相關分析對生命科學和生物醫學研究產生了越來越大的影響，已被應用到蛋白質、神經肽、酶活性、核酸等多種物質的分析研究中，單細胞方法對于我們理解細胞生物化學和行為之間的聯系以及群體水平現象的細胞基礎也是必不可少的，這為進一步發展疾病的早期分子診斷奠定分子生物學基礎［2-4］。在微生物研究領域，單細胞分離技術為未培養微生物的分離研究提供了新的思路，它在研究微生物生理、基因表達和功能方面也起著重要作用，其最重要的特點是分離并收集目標單細胞的同時可以結合單細胞基因組學進行系統深入的多學科分析研究，因此，可能成為未來繞過微生物培養來揭示微生物暗物質的有力工具［5-6］。

微生物在自然環境中普遍存在，且幾乎與所有多細胞生命形式相關，包括植物、動物和人類［7］。自然界中大多數微生物處于未培養狀態，被稱為 “微生物暗物質”，根據目前所描述的細菌種類和全球細菌多樣性指數的系統比較表明，99%細菌仍然未獲得純培養［8］。然而，這些未經培養的微生物在碳氮循環、新型天然產物發現以及維持環境平衡方面發揮著前所未有的作用［9］。近年來，隨著擴增子測序、宏基因組學和宏轉錄組學等非培養方法的發展，全球微生物多樣性和分布的信息呈指數增長。基于16S rRNA序列的方法和環境宏基因組學［10］，許多新的候選分類單元得到認可，但目前仍然有很多細菌門級類群尚未獲得純培養［11］。盡管宏基因組學和基因組學數據分析日益增多，但獲取未培養微生物的純培養菌株對于深入系統研究微生物的生理機制、生態作用及遺傳進化等仍至關重要。未培養并不意味著永遠不能培養，而是意味著我們缺乏關于它們生物學的關鍵信息，這既是挑戰，也是機遇。當前正在聚焦自然環境中微生物的生理狀態的研究，這可能為微生物的培養提供全新的思路、方法和途徑，即革新尚未培養的微生物的培養策略［12］。為了攻克微生物的不可培養特性，許多研究已開始開發替代培養方法。例如通過向培養基中添加特定的有機或無機化合物來改善生長條件，延長培養時間，降低營養濃度和使用替代凝膠劑等方法，從而成功實現之前未培養微生物在實驗室的培養。這些傳統的分離培養技術雖然很重要，但對于許多未培養微生物的分離培養來說卻略顯盲目和偶然，因此需要創新和發展單細胞分離的新技術，新方法并應用到微生物的分離與培養。

目前，新興培養技術大多遵循兩種分離策略，一種是利用高通量方法擴大細胞分離的數量實現增大獲取目標物種的機會，例如基于膜擴散的培養方法、基于微流控技術的培養方法等。另一種策略則是靶向分離具有特定功能特征或屬于特定類群的微生物，例如基于活細胞熒光標記和分選（Live-FISH）技術的細胞分選以及基于反向基因組學的熒光激活細胞分選等方法［13-15］。第一種策略通過建立大量單細胞培養物，然后篩選并鑒定培養物中的大部分物種來實現未培養微生物的規模化培養，但該策略選擇性低，對于目標菌種的獲取具有很大局限性。第二種策略對目標微生物具有靶向性，可以選擇性分離環境微生物，但在大規模高通量分選方面有局限性。方法各有利弊，但是，通過利用這些培養方法對實現更多未培養微生物的純培養分離具有重要意義。本論文主要綜述了微生物單細胞分離方法研究方面的進展，同時對單細胞分離方法在未來微生物分離培養方面的應用進行展望。

1 微生物單細胞分離方法

自19世紀，瓊脂培養基發明以來，微生物分離培養發生了革命性的變化［16］，大量的微生物在實驗室條件下獲得了純培養。在微生物學發展的這100多年里，人們嘗試了各種方法分離獲得未培養微生物，從早期單純的瓊脂平板分離培養方法［17］到后期發展出多種多樣固體培養法等；隨著生物科技的發展，傳統的平板分離方法越來越不能滿足人們獲得未培養微生物的需求，各種新型單細胞分離方法次序產生，如膜擴散培養法［18］、微流控分選［19］、光鑷技術［20］、顯微操作技術［21］、拉曼光譜分選［22］、熒光激活細胞分選［23］等方法（圖1），對未知微生物研究的方法不斷更新，以期攻克99%未知微生物純培養的問題。盡管目前的單細胞分離方法仍存在一些限制，但是運用這些方法使我們獲得了許多未培養的新微生物資源，讓我們更好地了解到這些微生物的生理及生態作用，顯示出單細胞分離技術對未培養微生物研究明顯的優勢。本文簡要介紹幾種常用的單細胞分離方法及其在微生物研究中的應用。

圖1 單細胞分離方法Fig.1 Single cell separation methods

1.1 膜擴散培養法

由于來自環境樣本的微生物很少能在培養皿中的營養培養基上生長，造成了大量未培養微生物難以發掘和利用，因此，研究者計劃通過模擬自然環境條件來實現未培養微生物的純培養。2002年，Kaeberlein等［18］根據“提供其自然環境的化學成分可以將其中不可培養微生物實現其可培養”的假設設計了一個擴散室（diffusion chamber），來模擬這些微生物自然環境，并讓其能夠充分接觸到自然環境中的生長成分。環境中的營養物質和代謝產物可透過通透膜擴散到培養基中，但膜內外的微生物不能相互接觸，從而可使膜內微生物獲得其原始生境中所需的所有生長因子，保證了細胞間的物質交流以促進未經培養的微生物在模擬的自然環境中生長。通過孵育培養獲得了35%以上未知的、全新的微生物，為環境中未培養微生物的可培養提供了新的技術。根據同樣的假設，Aoi等［29］研制了一種用于環境微生物原位培養的中空纖維膜室（HFMC），該系統由48-96塊多孔中空纖維膜與注射器連接而成。通過連續稀釋環境中的細胞獲得極限稀釋的細胞懸浮液，將每個纖維膜室接種上單個細胞，然后浸入為細胞提供生長因子的環境水樣中，因此，各種類型的純培養細胞可以在模擬環境條件下在每個室中生長［13］。另外，Nichols等［30］設計并測試了一種隔離芯片（ichip），它由幾百個微型擴散室組成，每個擴散室都接種一個環境細胞。通過ichip的應用微生物可恢復超過標準培養的許多倍，并且生長的物種具有顯著的系統發育新穎性。這種新方法可以接觸到大量多樣的以前無法接觸到的微生物，非常適合基礎研究和應用研究。

1.2 顯微操作技術

從環境樣本中捕獲和分離單細胞的顯微操作技術在40多年前就被引入，之后人們曾多次嘗試使用顯微操作技術來改善對單細胞的處理。利用視覺反饋系統，顯微鏡聚焦到目標物上，將調節濃度的微生物懸浮液吸入簡單的毛細管中，使單個細胞在確定的體積內進行轉移［21,28］。早期系統的主要障礙是放大率低導致無法操作單個原核細胞，但隨著顯微鏡的不斷改進和微毛細血管的發展，顯微操作技術已經成功地將單細胞從實驗室培養和自然環境中分離出來。顯微操作技術是一種簡單、方便、高效和成本低的分離單個細胞的方法，但是其吞吐量有限、自動化程度低、操作技術要求較高［31-32］。2005年，Ish?y等［33］提出了一個改進的系統，該系統由倒置顯微鏡、微進樣器和微操作器組成，可以使單個活的原核細胞從混合細胞中分離出來且不受其他非目標細胞的污染。他們利用微毛細管將分離的細胞捕獲并轉移到合適的生長培養基中，并證明了被顯微操作器捕獲的細胞確實可以生長。然而，目前顯微操作的主要局限性仍然是在培養基中單細胞生長的成活率較低，這阻礙了該技術在實驗室的廣泛應用［34］。

1.3 光鑷技術

1986年，Ashkin等［20］發明了光鑷，并用光鑷對病毒和細菌進行了捕獲和操作實驗，由此開啟了光鑷在物理學和生物學中的廣泛應用。光鑷的原理是使用高度聚焦的激光束來捕捉和操縱微觀的中性物體，它能夠對微米大小的介質物體施加作用力，如小的電介質球形粒子，它們受到兩種力的作用，即光子沿其傳播方向撞擊細胞所產生的散射力和場強梯度所產生的梯度力［35-36］。在光鑷技術操作中不需要物理接觸，細胞可以在無菌條件下的封閉室中完成操作［37］。2019年，Zhang等［38］確立了一個操作程序，允許使用光鑷處理和成像單個大腸桿菌細胞，同時最大限度地減少對細胞生長和蛋白質合成的負面影響，這是一種使用光鑷長期穩定處理單個大腸桿菌細胞的方法，這項工作為光鑷在微生物學中的應用鋪平了道路。結合微流控技術，光鑷為在單個微芯片平臺下對不同細胞類型進行高通量分選提供了光學技術的發展前景。在單細胞生物化學研究中，將光鑷與拉曼光譜相結合也變得越來越流行，因為利用光的力量來固定所研究的細胞，不僅避免了將細胞固定在基質上的負面影響，而且還提高了記錄光譜的質量［39］。Liu等［40］描述了一種結合光鑷拉曼光譜、漸進式增長生成對抗網絡（PGGAN）和殘差網絡（ResNet）分析的微生物分類新方法，利用該方法對深海細菌進行了單細胞拉曼光譜分析。PGGAN可以為大多數現有的深度學習方法快速生成大量的高分辨率拉曼光譜，并提高其預測精度，ResNet能夠對低信噪比的拉曼光譜進行準確的分類。結合PGGAN的高分辨率數據，ResNet可以快速、高效、準確地對單細胞拉曼光譜進行分類，這在海洋生物學與生態學中具有重要意義。因此，光鑷技術與其他技術聯用既發揮了其優點也彌補了不足，有利于促進未來單細胞分離方法的發展。

1.4 微流控技術

高效的細胞分離是生物和醫學研究中的必要手段，由于傳統技術的分離和分析稀有細胞方面的能力有限，如選擇性普遍較低、樣品損失較大等，限制了該方法的應用，因此，最近發展了許多微尺度分離技術［41］。微流控芯片技術是一種能夠在微尺度上運輸和操縱流體和顆粒（如細胞）的技術，已被用于稀有細胞的分離、富集和分析［19］，具有更高的效率和靈敏度水平。微流控技術利用不同細胞群內在特性的差異來實現分離，特別是細胞的機械和物理性能，包括尺寸、形狀、密度、附著力和可變形性，都是特性區分的常見標志［41］。微流控設備可以通過微滴流體技術［42］、介質電泳［43］、聲學［44］、磁學［45］等方法對細胞進行分類。微液滴產生的常見幾何結構包括T型結、流聚焦和共流結構，基本工作原理是相同的，即在兩種共流非混相流體之間創建一個界面，其中一種流體自我分離成離散的液滴，液滴被另一種流體包圍［42］。介質電泳（DEP）是可極化粒子在非均勻電場中的誘導運動，已被證明是在微流體系統中傳輸、積累、分離和表征微/納米級生物粒子的完美候選方法［43］。聲學分離技術主要是基于體聲波或表面聲波來精確控制細胞或者粒子的分離［44］。磁分選通過使用抗體、多肽或凝集素使磁珠表面功能化，磁珠可以高選擇性地附著在細胞上或被細胞吞噬，從而使利用外部磁場操縱細胞成為可能［45］。微流控芯片在提高分析靈敏度、準確性和吞吐量等方面具有突出的優點。它的某些特性，如快速樣品處理和測定中流體的精確控制，使其成為有吸引力的替代傳統實驗方法的候選技術。在過去的20年里，發展微流控技術，即所謂的“芯片上的實驗室”，已成為一種趨勢，以使這些程序小型化和自動化，用于分離細胞和微粒的過程被縮小成一個小的微流控芯片［46］。近年來，微流控土壤芯片（microfluidic soil chip）被開發出來，用于觀察土壤過程和微生物間的相互作用。這種技術可以使可見光譜進入自然不透明的土壤系統，并能夠直接研究微觀結構和化學控制環境中的微生物生長和相互作用［47-48］。Qiao等［49］開發了一種微流控熒光激活液滴分選技術來篩選PET塑料降解菌，并評估了假定的PET酶的降解活性，該技術可以廣泛應用于PET降解微生物和酶的發現。微流控技術是一種強大的平臺技術，它不僅被應用在微生物的檢測，還能夠實現罕見的細胞分離、高效的單細胞組學分析，為藥物開發提供了平臺［50］。2021年，Xu等［51］引入了一種基于離心機的微流控濃縮器，用于毫升到皮升的細菌懸液濃縮，以實現快速和實時的病原體檢測和藥敏實驗。該方法可以通過顯微鏡直接觀察病原菌細胞，更重要的是，藥敏實驗可以從原始樣品開始而無需傳統的預培養步驟，其富集效率更高。可見微流控技術大大提高了單細胞分選及藥物開發的效率，具有良好的發展前景。

1.5 單細胞拉曼分選

單細胞拉曼光譜（SCRS）作為一種振動光譜，是拉曼激活細胞分選技術（RACS）的基礎。通過激光與樣品相互作用時產生的化學鍵的振動和旋轉，來識別分子的特殊指紋，然后與共聚焦顯微鏡或其他設備結合，實現單細胞檢測。在單細胞拉曼光譜的基礎上，拉曼激活細胞分選技術提供一種無標記的細胞分選方法，拉曼激活細胞分選系統將單細胞拉曼光譜檢測儀器耦合到可在溶液中工作的細胞分離系統上，從而實現單細胞的分選。此外，拉曼激活細胞分選技術與具有獨特指紋特征的單細胞拉曼光譜的結合，有效地測量單個細胞中所有拉曼活性成分的生化譜，實現了對細胞功能的定量和多方面研究［22,52］。拉曼激活細胞分選是多種單細胞分類技術中的一種新興方法，包括4個基本操作程序：首先，在檢測點定位樣品；其次，從細胞中獲取拉曼信號；第三，快速的現場分析和實時決策；最后，收集目標樣品的分離物［53］。Wang等［54］利用拉曼激活細胞分選技術分選人腸道中的耐藥菌，其研究結果表明，人類腸道耐藥菌群和個人病史之間有很強的關系。Zhang等［25］開發了一種靜態版本的RACS系統，被稱為拉曼活化細胞彈射（RACE）系統，該系統通過應用脈沖激光將選定的細胞從襯底噴射到制備的容器中，使其分布在CaF2載玻片上（涂有光吸附中間層），利用該系統對類胡蘿卜素生產酵母（9%）和非類胡蘿卜素生產釀酒酵母（91%）的兩種細胞株的混合物進行了分選，前者平均富集到73%，并顯示了亞秒級快速拉曼激活的細胞分選效率。Su等［55］對RACE系統進行了優化，不僅提高了土壤微生物群拉曼活化細胞彈射和測序（RACE-Seq）的成功率，而且將精確保護細胞免受激光輻照作為方法開發的優先任務。目前，單細胞拉曼分選仍在不斷改進及發展，在未來可能應用到多個研究領域。

1.6 熒光激活細胞分選

熒光激活細胞分選（FACS）由于其成熟的技術發展、高靈敏度和高通量特點，已成為許多生物學家選擇的細胞分選方法［41］。FACS是一種具有單細胞分選能力的流式細胞儀，是基于大小、粒度和熒光來描述和定義異質細胞群中不同細胞類型的細胞分選技術［32］。FACS是唯一可用的基于內染色或細胞內蛋白表達（如基因修飾的熒光蛋白標記）分離細胞的技術，它可以根據大小、粒度和熒光對單個細胞進行純化。為了分離純化目標細胞，首先用熒光標記的單克隆抗體（mAb）對其進行染色，該抗體可以識別所需細胞群上的特定表面標記，未染色的細胞作為陰性對照［23］。FACS純化需要一個具有分選能力的流式細胞儀和相應的軟件。利用流式細胞儀細胞分選過程中，大量懸浮細胞以液滴流的形式在激光前傳遞，每個液滴包含一個單細胞，熒光檢測系統根據預先確定的細胞熒光參數檢測目標細胞。該儀器將電荷應用于包含目標細胞的液滴上，靜電偏轉系統有助于將帶電液滴收集到適當的收集管中［56］。最新的技術簡化了處理流程，提高了細胞分選能力，并引入了多參數測量。現在可以用2-3種不同的熒光染料來研究微生物群落，這些染料針對不同特定的生物分子和生理過程，因此，這樣可以同時評估細胞的生理狀態、它們的分類地位和功能基因表達情況，并最終將靶細胞分離和應用于進一步的研究［57］。Espina在熒光激活細胞分選技術的基礎上開發了一種單一程序，幫助區分基于活力染色結合流式細胞術和熒光激活細胞分選的不可培養現象。利用該技術在選定的土壤樣品中，通過選擇具有活性和代謝活性的細菌，培養細菌的成功率提高了一倍［58］。Ozawa等［59］利用熒光激活細胞分選從水樣中專門檢測和分離單個大腸桿菌O157:H7細胞，結果表明利用基于流式細胞儀的熒光激活細胞分選技術進行單細胞分離是獲取致病菌的有效工具。熒光激活細胞分選技術的應用十分廣泛，在單細胞分選過程中也可以聯合其他技術來達到單細胞分選的目的。

2 單細胞技術在微生物靶向分離中的應用

雖然目前單細胞分離技術有很多種，但是微生物單細胞靶向或者特異性分離技術卻很少。然而許多研究過程中往往需要獲得樣品中特定類群的純培養物，因此就需要實現微生物的靶向分離和培養。本文介紹幾種目前主要的單細胞技術在微生物靶向分離中的應用。

2.1 基于熒光原位雜交技術的單細胞分離方法

熒光原位雜交（FISH）是一種強大的可視化群落環境中微生物種群的方法，可以此為基礎，通過熒光激活細胞分選（FACS）將目標種群從多物種背景中分離出來［60］。2020年，Yilmaz等［61］修改了標準的核糖體RNA靶向熒光原位雜交（FISH）方案，該方案刪除了FISH中細胞固定步驟，可允許恢復未修飾的核酸。利用該方法，不僅成功標記而且在熒光顯微鏡中觀察到了生物反應器污泥和白蟻后腸樣品中的雜交細胞。然后，他們用群體特異性寡核苷酸探針（使用溶液中無固定FISH）標記污泥樣本中的一種細菌和一種古菌種群，并使用FACS對雜交種群進行分類。基于16S rRNA基因測序，他們證明了分類的群體對目標生物高度富集，從而使用改進的FISH方案確認探針特異性。這種方法有助于后續的基因組測序和目標菌種的分析。最近Batani等提出一種Live-FISH新方法（圖2）［14］，證明了無固定化的細菌可以在熒光原位雜交過程中存活，并且通過優化離心速度和重懸緩沖液等因素可以提高細胞存活率。接下來，他們證明了標記的DNA探針可以被引入活的細菌細胞，并提供了與16S rRNA靶向發生特異性雜交的證據。Live-FISH標記包括4個步驟，第一步是預雜交，即樣品溶液與磷酸緩沖液或者人工海水混合培養過夜后室溫離心；第二步是熱激，即在冰浴處理的MgCl2/CaCl2液體中重懸細胞顆粒，并在冰上黑暗培養后經過水浴熱激；第三步是雜交，即通過加入預溫雜交緩沖液后進行黑暗培養;第四步是洗滌，即通過室溫離心沉淀和加入預熱的洗滌緩沖液洗滌后，再重懸于磷酸緩沖液中并置于暗處冰上保存直到進行細胞分選。該方法與熒光激活的細胞分選（FACS）相結合，可對模擬細菌群落和自然細菌群落中特定的細菌分類群進行分類，尤其是對屬于探針目標所定義的特定分類組的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性活細菌，并隨后進行分選與培養［14］。Dam等在研究結合單細胞基因組學靶向細胞分選方法捕獲低豐度微生物暗物質時采用了無固定熒光原位雜交（FISH）技術對烏拉圭釀酒廠廢水處理廠中的綠彎菌進行了熒光標記，并且利用FACS對標記細胞進行單細胞分選。使用目標細胞分選富集未培養的綠彎菌，該菌在環境樣本中的豐度低于總菌群的1%，結合單細胞測序技術從烏拉圭釀酒廠廢水中共獲得了19個綠彎菌物種的基因組草圖，該研究提供了一種靈敏的方法來捕獲環境中豐度極低的目標微生物類群［62-63］。Chloroflexi（綠彎菌）雖然在深海、熱泉和工業廢水中廣泛分布，但其仍是一類難培養微生物。該方法實現了難培養微生物的靶向分離與培養，為科研工作者提供了研究基礎。

圖2 基于Live-FISH技術的單細胞分離方法Fig.2 Single cell separation method based on Live-FISH technique

2.2 基于反向基因組學的單細胞分離方法

在最近的一項研究中，Cross等［15］報道了一種利用基因組信息抗體工程技術從復雜群落捕獲特定微生物繼而達到純培養的方法。此研究填補了非分類特異性細胞染色之間的空白，這種染色既能標記細胞，又能保持細胞活力，而且具有一定的分類特異性。該工作被稱為反向基因組學對未培養細菌的定向分離和培養的有效方法，主要研究步驟如圖3所示［15］，包括確定SAG和MAG中膜蛋白編碼基因，選擇預測暴露的表位，制備抗體，進行蛋白純化和微生物熒光標記，對微生物組樣本中的靶細胞染色以及最后的靶細胞的分離、基因組測序或培養。該研究應用反向基因組學方法分離和測序單細胞并成功培養了人類口腔Saccharibacteria（TM7）的3個不同物種。TM7是基于16S rRNA基因序列提出的第一個候選細菌門之一，并已在活性污泥和人類口腔等許多環境中被發現［64］。使用此分類培養方法，研究人員證明了這3個Saccharibacteria（TM7）物種都是放線菌門下不同的寄生菌，他們還分離和培養了人類口腔SR1細菌，這是一個以前未培養的細菌譜系的成員。該方法中抗體標記的細胞也可以被輸送到其他平臺，以實現高通量細胞分離，例如，微滴或芯片。該研究還表明微生物的反向基因組培養方法可以應用于任何環境下的任何物種，并有可能分離、培養和鑒定微生物樹中尚未培養的新物種。由此可見，隨著分離技術的進步，使微生物特異性分離逐步成為現實。

圖3 基于反向基因組學的微生物靶向分離Fig.3 Targeted isolation of microorganisms based on reverse genomics

3 微生物單細胞分離方法的優點與不足

這些單細胞分離方法各有其特點，對微生物單細胞分離具有重要推動作用（表1），可將其分為兩類，一是高通量分離方法，包括膜擴散培養法、微流控技術、單細胞拉曼分選及熒光激活細胞分選技術。膜擴散培養法通過對未培養微生物原位培養來達到分離微生物的效果，可增加微生物的可培養率，但是該分離培養方法耗時久、工作量大、不具有特異性，主要是通過獲得大量培養物達到菌株分離的效果［65］。微流控技術能夠使用非常少量的樣品和試劑，并以高分辨率和靈敏度進行分離和檢測，具有低成本、分析時間短、分析設備占用空間小、對細胞微環境控制能力強等優點［66］。微流控技術也可以與一些其他技術如流式細胞儀或者拉曼光譜技術聯用來分離單細胞，但是其通用性比較低，在單細胞分選過程中除了部分方法外往往需要標記，這也可能會對細胞造成一定的損傷［67-68］。單細胞拉曼技術分選效率高，無創、無標記，但是該技術對儀器要求較高，自發拉曼光譜信號比較弱，分選不具有特異性，目前只能通過拉曼光譜對某些微生物進行選擇性分離［69］。熒光激活細胞分選具有技術成熟、高靈敏度、高通量的特點，其在基礎研究和臨床研究中均得到了廣泛的應用，但仍存在一些局限性。首先，FACS是依賴于流式細胞儀為實驗基礎，需要大量懸浮細胞，它不能從低數量的細胞群中分離出單個細胞。其次，機器內的快速流動和非特異性熒光分子會損害分選細胞的活力，導致分離失敗［32］。另一類分離方法是靶向分離方法，對目標細胞具有選擇性，包括Live-FISH及反向基因組學方法。Live-FISH主要通過對環境樣品進行活細胞熒光標記，再結合流式細胞儀進行細胞分選［14］。該方法靶向分離細胞效果較強，但耗時久、對細胞破壞性大、成活率低。反向基因組學方法依賴抗體結合靶細胞表面暴露的抗原表位進行標記，適用性廣泛，但是靶向性不強，結合流式細胞分選會附帶許多非目標菌株，也會損傷細胞。此外還有一些其他類的單細胞分選方法，雖然不能做到高通量分離或者靶向分離，但是他們在單細胞分離方面仍具有重要作用，如光鑷技術、顯微操作技術等。光鑷技術在單細胞分離方面精度高、效率高，但在生物研究中應用光鑷通常用于光學捕獲的紅外（IR）光會導致細胞損傷［38］。顯微操作技術適用范圍廣，可以分離選定的細胞，但是分離效率低，容易損傷細胞而造成細胞的成活率降低［70］。對于這些微生物單細胞分選方法，均有其各自的優缺點，因此，在微生物分離過程中需明確研究目的，才能更好地選擇和應用合適的分離技術來達到研究目標。

表1 微生物單細胞分離方法的優點及不足Table 1 Advantages and disadvantages of single cell separation methods for microorganisms

4 總結與展望

單細胞分析在生命科學領域有很大的應用前景，本文主要概述了多種單細胞分離方法的研究進展，包括具有高通量分選單細胞的分離方法，具有靶向分離單細胞的方法，以及其他的一些單細胞分離方法。這些分離方法各具特色，既有優點，也有不足，隨著科技的不斷進步和發展，未來單細胞分離技術應該在以下幾個方面進行提升。首先，是減小細胞損傷。雖然目前單細胞分選技術為我們的科學研究提供了技術支持，但是大多數的單細胞分離方法存在損傷細胞的問題，例如，顯微操作、光鑷技術、熒光激活細胞分選等過程中導致的細胞變形、功能改變，甚至細胞死亡等。因此，首先要改進的就是在保持分選效率的情況下減少對細胞的損傷。其次，改進單細胞靶向分離技術。雖然目前已有研究實現了環境中微生物的靶向分離，如Live-FISH技術、基于反向基因組學的分離技術，但是這些技術對于單細胞分離是十分有限的，并不是環境中的所有目標微生物都能實現標記，許多微生物沒有現有的生物標志物，或者目標細胞難以用熒光探針標記，可能會標記到非目標微生物。目前的應用仍只是環境中豐度高的類群或者特殊的類群，并且這兩種分離方法需要結合流式細胞儀進行分選，流式細胞儀分選細胞需要大量懸浮細胞，而且此過程也會損失和損傷目標細胞。雖然這兩種靶向分離方法有明顯的不足，但也是目前已有的最先進的靶向分離方法，期待在未來隨著技術的進步，可以改進微生物標記探針提高其特異性以及標記后的細胞分選技術減少活細胞損失和損傷，從而彌補這些技術在靶向識別、高通量分選等方面的不足，更好地為未培養微生物資源等科研服務。第三, 發展新型單細胞分離技術。目前，Doudna團隊已經實現復雜細菌群落中物種和特定位點的基因組編輯［71］，因此希望未來基因編輯技術或者其他技術能夠成功發展和應用到微生物的靶向分離中。第四，拓展單細胞分離技術的應用。單細胞分離技術在很多領域已經顯示出其廣泛的應用前景，期待在環境樣本中微生物分離、藥物分子篩選、腫瘤細胞篩選、細胞器分選、生物醫學和臨床診斷等方面能得到實際應用，真正將科學研究應用到實處，服務于人類社會發展。