基于楊木（Populus sp.）的二代燃料乙醇技術研究進展

徐發迪 徐康 孫東明 李萌蕾 趙建志，2 鮑曉明

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院 生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，濟南 250353；2.山東大學生命科學學院微生物技術國家重點實驗室（微生物技術研究院），青島 266237）

全球農林生物質棄物儲量巨大，以此為原料通過微生物轉化生產乙醇，并實現替代部分車用汽油的目的，由于乙醇汽油的特性，使其成為近30年來新型能源研發的重要內容［1］。根據生產原料的類型區分，燃料乙醇生產技術的發展主要經歷了以糖質和糧食作物為原料的一代燃料乙醇，以農林廢棄植物纖維為原料的二代燃料乙醇和以藻類等綠色植物為原料的三代燃料乙醇［2］。由于日益嚴重的世界糧食危機問題，我國政府已限制了一代燃料乙醇的發展規模，第三代燃料乙醇正處于研發起步階段［3］。而具備產業化示范的第二代燃料乙醇生產技術，對于保護糧食安全和緩解能源危機具有巨大的意義。二代燃料乙醇的原料種類豐富，農作物秸稈、枯草、林木枝椏等儲量巨大的農林棄物均可利用［4-12］，可保證生物乙醇的可持續發展?，F階段研究應用多集中于秸稈類生物質，而對楊木生物質的二代燃料乙醇技術研究相對較少。

楊木（Populas.sp）屬于硬木，纖維結構相對疏松，是生長最快的喬木之一。作為速生豐產樹種，在全世界被廣泛種植。而隨著現代育種技術的發展，使楊木品種更加適應全球不同地區的環境，而且優化了楊木在工業中的應用特性［13］。中國處于世界的楊木種植中心，如今在全國各地分布已超600萬hm2，楊樹人工林面積居世界之首。同時楊樹植伐周期短，應用廣泛，每年產生大量的枝椏材和加工業棄料，是能夠支撐二代燃料乙醇穩定生產的理想原料之一。燃料乙醇的基本生產工藝主要包括降低原料粒度、破壞纖維素內在結構的理化因子的預處理、釋放單糖的酶解糖化、產生乙醇的微生物發酵、乙醇脫水的蒸餾工藝等步驟［14］。木質纖維素是由纖維素（cellulose）、半纖維素（hemicellulose）和木質素（lignin）三大基本組分構成。預處理的目的是破壞纖維素內在結構，提高木質纖維素底物的可及度。酶解糖化過程是將原料中保留的纖維素和半纖維素降解成可發酵性單糖，利用高固底物酶解技術，獲得工業化生產中所需要的高糖濃度水解液。發酵反應是以可發酵性單糖（葡萄糖、木糖）為底物，在發酵微生物的代謝作用下高效利用底物轉化生產乙醇。而由于原料的不同，每個具體工藝環節上也存在著不同的技術差異和困難［15］，為了克服這些困難，精準構建不同原料的二代燃料乙醇生產工藝是當前的主攻方向。本文綜述了以楊木為原料的二代燃料乙醇預處理、酶解和發酵的研究現狀及所面臨的困難。

1 楊木的組成特點

植物的主要生化成分是木質纖維素，由纖維素、半纖維素和木質素組成，在植物細胞壁內形成復合體，對植物起保護作用［16］；還有來自細胞質內部的非結構性生物化學成分，無機元素等。楊木生物質具有較高的纖維素含量，適中的半纖維素含量，灰分、淀粉和提取物等含量較低，這些特性使它成為生產燃料乙醇的理想原料之一［17］。表1顯示了不同木質纖維素原料三大組分的比例差異，而且不同原料在具體結構上也具有不同的組成特點。

表1 不同木質纖維素原料組成成分含量Table 1 Contents of different lignocellulose raw material components

1.1 纖維素

纖維素是一種通過β-1,4糖苷鍵連接吡喃葡萄糖，以平行束排列的線性聚合物，其分支較少，分子內和分子間的氫鍵穩定，不容易裂解釋放出單糖。即便如此，長期以來科研人員為利用纖維素，開展了大量的研究工作，利用預處理配合纖維素酶解工藝能夠有效提高纖維素的解聚糖化效率，為木質纖維素的工業化應用鋪墊了道路［21］。而且對比草本類和秸稈類原料，楊木中纖維素含量占比較高，達到干物質量的40%以上。較高的纖維素含量意味著能夠提供更多的葡萄糖，從而使相同質量的楊木原料比其他木質纖維素原料在水解后能夠提供更高的葡萄糖濃度。

1.2 半纖維素

半纖維素是一種由戊糖（木糖、阿拉伯糖）和己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）組成的異質聚合物，結合在纖維素微纖維的表面以氫鍵相互連接，在纖維素葡聚糖束表面形成一層“鞘”狀結構，能夠阻礙酶與纖維素的結合［22］。由于半纖維素結構中復雜的糖組分，使其在水解后很難被充分利用。例如，玉米纖維的半纖維素結構中含有大量的阿拉伯糖，而阿拉伯糖轉化乙醇的途徑還未有較大進展。然而楊木的半纖維素幾乎只含有O-乙?；?4-O-甲基-葡萄糖醛酸基-木聚糖這一種結構單元［23］。對比秸稈類木質纖維素原料，其阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等含量極低。雖然野生型發酵微生物不能利用戊糖，但現如今重組釀酒酵母菌株已經具備葡萄糖與木糖的高效共同發酵能力，因此較低的阿拉伯糖含量，較高的葡萄糖和木糖含量能夠最大限度增加水解液中可發酵性糖的總量。但是相比于其他木質纖維素生物質，由于楊木半纖維素中的支鏈通常被乙?；〈?，因此楊木原料中乙?；枯^高，若想充分利用其半纖維素成分，仍需考慮乙?；鶎罄m酶解和發酵過程的影響。

1.3 木質素

木質素是由苯基丙烷單元（香豆醇、針葉醇和肌醇）形成的具有三維網絡結構的交聯聚合物，分別有對羥苯基、紫丁香基和愈創木基3種非晶態無序結構，是一種無定形態的生物高分子。楊木的木質素的結構單元以愈創木基和紫丁香基為主［24］，相較草本和秸稈類原料，其原料中木質素占比較高，但木質素結構中的對羥苯基占比較低。由于木質素易于與酶發生非特異性結合，阻礙纖維素酶對底物的水解，這一特性使其成為限制木質纖維素原料解聚的第一大屏障［25］。因此，“木質素優先”策略是提高楊木生物質酶解效率和減少纖維素酶用量的有效措施之一。

而且目前普遍認為，由于二代燃料乙醇的成本問題，沒有木質素的高值化利用，根本無法滿足工業化的要求。木質素本身獨特的芳香結構決定其在大宗化學品和精細化學品，以及高分子材料、藥物分子或高值燃料等高附加值產品的生產方面具有獨特的優勢［25］。而隨著近年的針對木質素高值化利用的研究中，開發了許多能夠選擇性催化降解的技術，如熱催化、光催化、電催化和酶催化等，使得木質素高值化利用成為現實［26］。

2 適用于楊木組成特點的預處理技術

木質素與半纖維素、纖維素之間相互交聯，形成碳水化合物-木質素的復合體，其結構質地堅硬且能抵抗酶解，增強了次生細胞壁的生物和物理抵抗性［22］。預處理的主要目的是破壞木質纖維素堅固的物理結構，增加纖維素和半纖維素的可及性，使生物質能被充分水解為可發酵性單糖［27］，進而用于纖維素乙醇和纖維素丁醇等清潔能源的生產，圖1顯示了楊木生物質燃料乙醇的基本工藝流程。目前基于楊木生物質研究的主流預處理方式主要有：稀酸、蒸汽爆破、稀堿、離子液體以及組合法，如表2所示。

圖1 楊木生物質燃料乙醇工藝流程Fig 1 Process flow of poplar biomass fuel ethanol

表2 不同預處理方式對比Table 2 Comparison of different preprocessing methods

2.1 稀酸預處理

稀酸預處理通常采用低濃度的鹽酸、硫酸、磷酸或乙酸等酸性試劑，在一定的溫度和壓力下對木質纖維素進行處理。稀酸預處理能夠破壞楊木組分之間的氫鍵，水解半纖維素，利用其對半纖維素的溶解能力，能夠有效降低木質纖維素的結晶度［28］。而且低濃度酸對設備的腐蝕性和危險性更低，更符合工業化的要求。由于稀酸預處理法操作簡單且成本廉價，并且能夠有效提高纖維素的酶解效率，是目前比較認可的預處理方法之一。Guo等［29］開發了一種利用稀硫酸預處理玉米纖維的簡易工業化工藝，可回收81.8%的總糖（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖）。但相較于玉米纖維，楊木原料質地堅硬，木質素含量高。本課題組嘗試將楊木進行稀酸預處理，經過預處理條件的優化后，雖然半纖維素的水解效率較優，但纖維素的酶解效率低下（數據未發表）。

2.2 蒸汽爆破預處理

蒸汽爆破預處理是在高溫高壓的條件下使液態水變成氣態水進入原料結構之中，短時間保溫后迅速降溫減壓使水蒸氣瞬間噴出。此過程中產生的能量會對木質纖維素內部結構造成破壞，改變木質纖維素本身的結構與化學構成，使其變成疏松的多孔狀并溶出半纖維素。蒸汽爆破對原料物理結構的破壞比稀酸預處理更強，并且通過相應的設備可以實現連續化生產作業，是一種公認的高效節能的預處理技術，可以有效輔助原料組分的分離溶出［30］。Biswas等［31］通過對楊木木屑進行濕法爆破預處理條件的優化，得到酶解后的最高總糖產率為76%，并且研究發現隨著預處理條件強度的增加，能夠得到更高的葡萄糖糖化率。然而相關研究證明，過度的預處理條件不僅無法繼續提高總糖的糖化率，還會生成更多的糠醛、5-HMF等抑制物［32］，而且蒸汽爆破預處理仍然無法解除木質素對酶解過程的影響。

2.3 稀堿預處理

木質素作為一種對蛋白質具有非特異性結合能力的物質，無法對楊木生物質實現較高的酶解效率。為了改善這一現象，采用稀堿預處理對原料進行“木素先行”的策略。稀堿預處理主要是利用低濃度的氫氧化鉀、氫氧化鈣或氫氧化鈉等堿性試劑溶解木質素和半纖維素，從而破壞木質纖維素材料的堅固性［33］，而且在預處理過程中不會產生乙酸、糠醛、5-HMF等抑制物。但通過Bay等［5］研究發現，氫氧化鈉預處理雖然能夠破壞木質纖維素致密的結構，但木質素脫除率較低，半纖維素損失嚴重，葡萄糖產率較稀酸預處理更低，其原因在于稀堿預處理條件更加溫和，導致對楊木生物質結構破壞能力較弱，降低了底物對酶的可及性。

2.4 離子液體預處理

因存在如何高效脫除木質素、提高纖維素保留率、降低預處理成本等問題，可重復利用的低共熔溶劑成為近年研究的熱點。低共熔溶劑是氫鍵受體和氫鍵供體以一定的化學計量比混合而成的。作為一類新的離子液體或離子液體類似物，具有類似離子液體的物理化學性質。皮奇峰等［34］研究發現，低共熔溶劑對楊木的木質素脫除率大于90%，纖維素保留率大于98%，半纖維素溶解率亦達到76%。同時周敏姑等［35］研究發現，低共熔溶劑能夠有效脫除楊木原料的木質素，增加葡萄糖得率，但溶解的半纖維素較難分離與轉化，降低了木質纖維素原料的全糖共利用率。而提高全糖共利用率，能夠有效降低纖維素乙醇的生產成本。因此尋找高效專一脫除木質素的預處理方法，是執行“木素先行”策略的重要前提。

2.5 組合法預處理

使用單一預處理方法往往不能達到理想的預處理效果，通過對兩種及兩種以上預處理方法進行組合，綜合不同預處理的優點，使預處理效果更為顯著。因此，組合法預處理方式是解決楊木生物質木質纖維素解聚的有效方式之一。盡管儲秋露等［36］研究發現，堿性氧化和堿性磺化結合蒸汽爆破預處理后，楊木木質素脫除率均達到50%左右，纖維素和半纖維素回收率比蒸汽爆破預處理更高，但葡萄糖糖得率仍然較低。Shi等［37］研究發現，稀酸-稀堿預處理對半纖維的水解效果較佳，并能夠脫除部分木質素，但其效率低下還伴隨著纖維素的損失。因此，對于楊木等木質素含量高的原料，常規的預處理很難達到理想的木質素脫除效果。Wen等［38］研究了基于楊木的乙酸-亞氯酸鈉二步法預處理發現，亞氯酸鈉預處理可脫除70%以上的木質素，保留82%以上的葡聚糖，具有較高的水解葡萄糖產率。相關研究表明，亞氯酸鈉僅對木質素具有較好的溶解作用，幾乎不溶解纖維素和半纖維素［4］。這種高效且專一的脫木質素預處理，不僅能夠減少原料中木質素含量，提高酶解效率，而且能夠最大程度保留原料的糖組分。

綜合各種預處理方式，本課題組對楊木生物質的亞氯酸鈉預處理法進行探究發現，木質素脫除率達到70%，葡聚糖和木聚糖的損失均小于5%。預處理后的楊木三大組分比例發生了明顯變化，木質素含量下降到約8%，葡聚糖和木聚糖的比例相對增加。此時的楊木結構已被部分破壞，因此后續采用較低強度的稀硫酸預處理條件，可以解聚56%的木聚糖（數據未發表）。盡管經過酶解后葡萄糖和木糖的總糖化率可達到理論值的90%左右，但此預處理組合方法也存在一些問題。由于亞氯酸鈉具有一定毒性，對存儲條件要求高，因此大規模工業生產中的應配套相應的安全設施。另外，亞氯酸鈉具有強氧化性，預處理脫除的木質素被氧化后，其基本結構已發生變化，暫無研究表明能夠將亞氯酸鈉溶出的木質素回收利用。

3 預處理原料的酶解

現代工業中，酶解工藝對設備要求低、對環境友好，利用纖維素酶進行加工生產的技術較為成熟。經過預處理后的木質纖維素結構被破壞，纖維素裸露出來，能夠有效提高纖維素酶的解聚效率。酶解工藝的高效性及經濟性是制約二代燃料乙醇發展的關鍵之一，因此纖維素酶系的配比、高產纖維素酶菌株的選育及酶解工藝參數的優化對不同原料的酶解效率至關重要，如表3所示。

表3 影響預處理原料酶解的因素Table 3 Factors affecting the enzymatic digestion of the pretreatment ingredients

3.1 多酶體系復配

纖維素降解酶系通常是由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和氧化裂解酶等組成，每種酶組分能夠降解專屬的糖苷鍵。其中纖維素酶主要包括3類基本酶組分，分別是隨機劈開纖維素纖維內部的β-1,4糖苷鍵，釋放自由短鏈的內切葡聚糖酶；從游離鏈末端依次切割纖維二糖單元的外切葡聚糖酶；進一步水解纖維二糖釋放葡萄糖單元的β-葡萄糖苷酶［39］。楊木生物質具有占比較高的纖維素成分，因此要求所用纖維素酶系具有較高的內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組分。大量研究表明，在纖維素酶水解過程中額外添加β-葡萄糖苷酶可以有效提高酶解效率和糖化率。另外，纖維素酶系中復配木聚糖酶，能夠有效降解預處理未能解聚的半纖維素。同時，裂解多糖單加氧酶發現，通過利用其氧化裂解作用，可以破壞纖維素的結晶結構，為糖苷水解酶提供更多的結合位點，也對纖維素的高效酶解起到重要作用［40］。這說明高效的酶解不僅需要較高的加酶量，酶系的組成配比同樣至關重要。

3.2 高效纖維酶系的菌種選育

目前，用于生產纖維素酶的微生物菌種主要是產酶活力較強的青霉菌、曲霉菌和木霉菌等絲狀真菌。尤其是里氏木霉，具有良好的抗代謝抑制能力和較高的產酶活力，而且纖維素酶系齊全，具有分解天然纖維素所需要的3類酶組分［41］。同時，里氏木霉對生長環境要求較低、菌株安全無毒、酶組分易于提取，是公認的纖維素酶生產菌，最具工業應用價值［42］。而與木霉菌相比，青霉菌的木質纖維素分解酶系主要由纖維素降解酶、半乳糖分解酶和其他蛋白質成分組成，酶組分比較齊全，且各酶組分之間的比例較為均衡［43］。曲音波等［44］從土壤中分離出一株青霉纖維素酶生產菌株，其抗降解物阻遏高產突變株先后在寧夏夏盛公司和甘肅白銀賽諾公司得到應用，隨后又在山東龍力公司的纖維素乙醇生產中得到進一步驗證，并通過對酶合成調控網絡的合理重構，進一步改造該菌株，提高產酶能力。為獲得性能優良的高產酶能力菌株，還可以通過理化誘變育種、原生體融合育種、基因工程和分子修飾等技術來實現纖維素酶生產菌的遺傳改良。

3.3 高濃度底物酶解

為了獲得較高乙醇濃度的發酵液，學者們通常采用提高底物的添加量，獲得高糖濃度酶解液的方法來實現，此方法生物質固體含量一般在20%以上。Ying等［45］利用經過乙酸和過氧化氫預處理后的原料進行高固體含量的酶解測試，在40%固體載量的條件下進行酶解，葡萄糖濃度達到250.8 g/L。但在高固體含量的酶解過程初期，反應體系中的自由水被大量的底物吸收。而酶解反應需要水分子作為載體，自由水的減少導致酶解反應體系無流動性，傳質過程減緩，使底物與酶無法充分結合，酶解效率降低。da Silva等［46］研究發現，可以通過批次投料的酶解方式解決這一問題，分批補料后的固體載量可以達到40%，葡萄糖的得率達到60%以上。分批補料通過逐次添加少量底物使反應體系一直保持較高的流動性，從而保證底物與纖維素酶的充分接觸，達到更好的酶解效果。

除了原料自身結構對酶解的影響，酶解溫度和溶液pH等因素也對酶解效率具有重要的影響。因此在酶的最適溫度（45-55℃）和最適pH（4.5-6.5）范圍內能夠有效保證酶解效率，而加酶量則需根據對酶解效率以及成本的要求作出選擇。本課題組通過對比諾維信（Cellic CTec 3）和賽諾兩種纖維素酶對楊木生物質的酶解性能發現，添加相同濾紙酶活單位時，諾維信纖維素酶的效果更佳。隨后，對兩者的部分酶組分的酶活測定發現，諾維信纖維素酶中的β-葡萄糖苷酶酶活高于賽諾纖維素酶。結合楊木具有較高葡聚糖含量的特性，在高固體載量酶解的過程中，額外添加β-葡萄糖苷酶能夠使酶解效率提升約60%（數據未發表）。因此，增加纖維素酶中β-葡萄糖苷酶的配比能夠有效提升酶解效率，還有助于消除纖維二糖積累造成的反饋抑制。

4 原料水解液的發酵

微生物發酵在燃料乙醇生產工藝中具有重要的地位，水解液和微生物的發酵性能直接影響到轉化效率和乙醇產量。如何實現水解液的全組分高效轉化，是制約二代燃料乙醇發展的主要障礙之一。大量研究發現，可以通過降低水解液毒性、強化微生物發酵性能、優化發酵參數等方式，破除阻礙其發展的屏障，如表4所示。

表4 提升原料水解液發酵性能的方式Table 4 Ways to improve the fermentation performance of the raw material hydrolysate

4.1 水解液中發酵抑制物及其脫毒方法

抑制物伴隨著木質纖維素解聚過程產生，對微生物的生長代謝具有毒害作用。因此，人們嘗試多種方法來降低木質纖維素水解液的毒性，通常有物理脫毒法、化學脫毒法及組合脫毒法。原料的差異及預處理措施的差異使得預處理液的毒性不同，因此需要根據預處理液對發酵微生物的影響，選擇合適的脫毒方法。研究發現，潛在的木質原料抑制物種類多達35種，主要來源于糖和木質素的降解化合物以及木材提取物，包括芳香族醛和酸、脂肪族醛和酸以及呋喃化合物［47］。而楊木經過稀酸預處理后，高溫和氫離子的催化會產生乙酸、5-羥甲基糠醛、糠醛和酚類（間苯二酚、對苯二酚）等抑制物［48］。

化學脫毒法利用各種堿性試劑對預處理液進行處理，如氨水、氫氧化鈉、氫氧化鈣、生石灰等。通過堿性試劑脫毒后，能夠有效緩解有機酸對發酵微生物的毒性作用，提高糖利用率［49］。楊木原料組分中乙?；枯^高，隨高固體含量的酶解液乙酸濃度增加，簡單的化學法無法滿足脫毒的需求。物理法包括減壓蒸發、溶劑萃取、活性炭吸附、絮凝納濾和離子交換吸附等方式，減壓蒸發和溶劑萃取能夠脫除揮發性和有機性抑制物，活性炭處理能夠去除更多的酚酸，離子交換樹脂可以有效減少乙酸、糠醛、5-HMF以及酚類這些常規抑制物［50-53］。選擇物理法和化學法組合使用，能夠更加有效的降低水解液抑制物濃度，降低抑制物對酶解過程和發酵過程的影響［54］。張強等［55］研究發現，氫氧化鈣結合活性炭吸附的組合脫毒法對楊木水解液進行脫毒，乙醇轉化率明顯提升。徐勇等［56］采用不同堿性試劑，結合弱堿性陰離子交換樹脂或減壓蒸發進行脫毒發現，減壓蒸發加石灰中和的脫毒方法最佳，可脫除70%乙酸和40%甲酸，僅有5.0%-6.0%糖損失，脫毒后微生物的糖利用率和乙醇得率可提高到93.2%和83.6%，對乙醇發酵具有積極的促進作用。

但是，脫毒步驟增加了二代燃料乙醇的生產成本，使生產工藝變得復雜，同時伴隨部分可發酵性糖的損失。本課題組測試了樹脂和活性炭對抑制物的脫除效果，實驗發現樹脂比活性炭的脫毒效果更優，但樹脂的脫毒效果也存在一定的局限性，當固定體積的樹脂流過少量水解液時，樹脂對抑制物的吸附效果顯著，但糖的損耗也更高；而流過大量的水解液時，樹脂吸附能力和被吸附的抑制物逐漸飽和，隨之脫毒效果變差；而且樹脂的活化與再生，也需要消耗大量的物力和時間（數據未發表）。所以在工業生產中，應盡量避免脫毒步驟?？梢酝ㄟ^提高菌株自身耐受力，或優化發酵過程控制，降低或消除抑制物對發酵微生物的影響。

4.2 二代燃料乙醇釀酒酵母的定制

由于二代燃料乙醇原料及生產加工過程的差異性，要求發酵菌株能夠更好地適應不同的水解液環境，對于微生物來說是困難的。而定制的二代燃料乙醇發酵微生物只需適應專屬的水解液，不僅降低了微生物選育的難度，同時更加有利于工業化生產，因此開發適配于楊木水解液的專用發酵菌株勢在必行。根據原料的特點，楊木的半纖維素含量占比高達到15%，C5/C6雙糖共利用能夠有效提高生產工藝中的全糖利用率，提高燃料乙醇的經濟性。而抑制物的存在，使得高效利用可發酵性糖兼具高魯棒性的菌株開發，成為制約二代燃料乙醇經濟可行性的重要因素之一。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種傳統的乙醇發酵生產菌種，具有優良的生產性能，是適合轉化包括第二代燃料乙醇在內的生物基化合物的理想底盤細胞［57］。隨著分子生物學的發展與進步，傳統發酵菌株無法高效利用五碳糖的困難已被解決，C5/C6雙糖共發酵微生物的定制，使木質纖維素解聚生產化學品成為現實。利用適應性進化、代謝工程以及合成生物學等策略，能夠改善葡萄糖和木糖的共發酵能力［58］。亓偉等［59］將釀酒酵母Saccharomyces-cerevisiae NRRL Y-2034 和樹干畢赤酵母Pichia stipitis NRRL Y-7124原生質體融合培養，獲得菌株融合子F11，能夠利用葡萄糖和木糖生產乙醇。本實驗室前期在野生型二倍體釀酒酵母菌株BSIF染色體的PHO13基因座位上，插入克隆自牛瘤胃液宏基因組的木糖異構酶基因Ru-xylA（GenBank JF496707），實現了木糖異構酶的異源表達；同時在GRE3基因位點上插入含有磷酸戊糖途徑非氧化部分的4個基因獨立表達框，使GRE3基因失活，減少副產物木糖醇的生成；隨后通過在染色體上替換組成型強啟動子TEF1p來達到木酮糖激酶的基因XKS1的適度超表達，增強下游代謝通量，同時進一步整合Ru-xylA基因表達框，增加基因拷貝數，得到菌株BSN3；然后將其在以木糖為唯一碳源的培養基中馴化，選擇出生長最快的單菌落XH7；之后用玉米秸稈預處理瀝出液作為復合毒性馴化培養基，利用BioScreen system篩選出單菌落比生長速率最大的XRH11；在其染色體上整合異源轉運蛋白突變子N360S，使其具有轉運木糖的能力，同時對菌株進行馴化，得到菌株LF1［60］。但研究中也發現，以木質纖維素為原料的水解液往往含有較高濃度的抑制物，因此進一步對菌株LF1進行非理性適應性馴化，得到了一株木糖利用與魯棒性這一拮抗關系較為平衡的菌株6M-15［61］。隨著各種C5/C6雙糖共利用以及高魯棒性微生物的開發，以木質纖維素為原料的生物合成產業得到進一步的發展。

4.3 發酵方式選擇

工業中微生物發酵的方式主要有3種，分別為間歇發酵、連續發酵和批式流加發酵［62］，合適的發酵方式，能夠有效降低生產成本，提高經濟效益。但研究發現，在葡萄糖木糖共發酵時會出現葡萄糖后繼效應，表現為發酵后期木糖代謝緩慢［63-64］。因此許多研究人員提出同步糖化發酵和半同步糖化發酵，希望在緩解上述現象的同時減少工藝步驟和縮短工藝時間［65］。而Kim等［66］通過分批補料間歇同步糖化發酵的策略，使楊木水解液56 h時乙醇得率達到81.7%，乙醇濃度僅達到39.9 g/L。Chen等［67］通過批式流加發酵結合同步糖化發酵的操作，在所有4種以玉米秸稈為原料，以開發的釀酒酵母為發酵菌株的發酵中，都實現了約85 g/L乙醇濃度。但由于酶解和發酵最適溫度的不一致性，必然要造成酶解效率的損失。因此，將分批補料酶解單獨進行，能夠有效增加酶解效率，然后再通過批式流加發酵，有利于緩解葡萄糖后繼效應。

4.4 發酵過程控制

生物發酵需要為生物體創造適宜的生長條件，使其在適宜的溫度、pH值、營養濃度和通氣量等條件下進行生長繁殖和代謝，提高發酵產率和效率［68］。優化微生物發酵的過程控制，能夠有效提高微生物發酵的經濟利益和產品質量［69］，而楊木生物質乙?；控S富，導致楊木水解液乙酸濃度較高。雖然二代燃料乙醇發酵菌株通常具有一定的魯棒性，但超過發酵菌株所能承受的抑制物濃度后，亦會導致微生物無法正常生長代謝。乙酸作為一種發酵抑制物，在發酵的過程中會產生不利的影響，其解離常數pKa值為4.75。因此在pH小于等于4.75的水解液中，大多數乙酸以分子形式存在。而乙酸分子具有親脂性的特點，可以通過自由擴散進入細胞，在細胞質中被解離的乙酸分子導致細胞內部酸化，從而對微生物產生毒性作用［70］。而且經過Casey等［71］研究發現，增加培養基的pH值可以降低乙酸的抑制作用，從而證實了乙酸的未解離形式是該分子的抑制形式。本課題組也通過調節水解液pH來緩解乙酸的抑制作用，研究發現，當pH高于4.75時，能夠有效提高木糖利用率、發酵液乙醇濃度和糖醇轉化率（數據未發表）。

另外，在種子培養過程中，用部分含抑制物的水解液進行種子活化，或增加發酵微生物初始細胞濃度，都能夠增強微生物發酵能力，有利于后續乙醇發酵［72］。酵母菌作為兼性厭氧菌，發酵前期需要適量氧氣使菌體快速生長繁殖［73］。而通過實驗發現，菌體生長過度會消耗更多的葡萄糖，因此通過優化通氣量來控制菌體生長，同樣有利于提高發酵液的乙醇濃度。

5 展望

世界各國對生物質燃料乙醇的研究已開展多年，現有生產工藝也取得較大的進展并實現工業化應用。但對于林木類生物質的研究還停留在預處理和酶解階段，原因在于林木類原料自身的物理結構和化學成分的特殊性。所存在的問題主要體現在預處理過程復雜、成本高和成分損失等方面。而對于林木類二代燃料乙醇的發展，需要預處理、酶解和發酵3個階段的統籌規劃，因此困難不僅僅在于預處理階段。通過對現有預處理技術的不斷優化，以期獲得高效預處理方法；通過開發性能優良的產酶菌株和先進的酶解裝置，以期獲得高效的酶解方法；通過發酵微生物的定制以及發酵方式和過程控制的優化，以期探索生物制乙醇的可行性發酵工藝。隨著環保概念的深入人心，開發可再生能源的需求勢在必行。提高以楊木生物質為原料的二代燃料乙醇生產過程的經濟性，基本要求主要有兩點：一是實現楊木生物質的全組分利用，二是開發高效適配的預處理、酶解和發酵交叉耦合工藝。因此，提升二代燃料乙醇發酵微生物的全糖共利用能力和魯棒性，以及形成優勢互補的交叉學科研究和交叉耦合工藝探索，仍是未來關注的熱點。