一株高效溶磷產紅青霉培養條件優化及其溶磷特性

趙光緒 楊合同 邵曉波 崔志豪 劉紅光 張杰

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，濟南 250000；2.諸城市中沃生物工程有限公司，濰坊 262200）

磷是植物體的組成元素，以多種途徑參與植物體內的代謝過程，因此磷是農業生產中最重要的養分限制因子之一［1］。我國約1/3-1/2的耕地處于缺磷狀態，土壤中能被植物所利用的有效磷含量僅占0.1%。為提高作物產量，農業生產中常使用化學磷肥為植物補充磷養分［2-3］?；瘜W磷肥不僅價格高，而且利用率只有10%-25%，未被利用的磷會與土壤中的金屬陽離子形成不易被植物利用的難溶性磷酸鹽，造成磷資源浪費［4-5］。將具有溶解難溶性磷酸鹽功能的微生物施加到植物根際土壤中，它們能夠通過自身生命活動改變土壤中難溶性磷酸鹽的狀態，最終提高土壤中有效磷的含量，促進植物攝取磷元素［6］。因此，溶磷微生物具有開發和利用土壤中被禁錮的磷資源，減少化學磷肥使用的作用。

土壤中的溶磷微生物種類主要有細菌、真菌和放線菌等，其中真菌的溶磷能力最強，目前已報道的溶磷真菌主要包括青霉屬（Penicillium sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、根霉屬（Rhizopus sp.）、叢枝菌根菌（arbuscular mycorrhiza fungi, AMF）和鐮刀菌屬（Fusarium sp.）等［7］。溶磷微生物主要存在3種溶磷機制：一是微生物分泌鐵載體及胞外多糖與土壤重金屬結合，活化難溶無機磷酸鹽，釋放磷酸根離子［8］；二是微生物在代謝過程中通過呼吸作用和NH4+同化作用分泌質子，使培養介質的pH值降低，從而導致磷酸鹽溶解［9］；三是微生物通過代謝活動分泌有機酸，有機酸不僅可以降低pH值，還能與Ca2+、Al3+、Fe3+等陽離子結合，促使難溶性磷酸鹽溶解［10-11］。不同微生物分泌有機酸種類和含量的不同，可能是導致其溶磷能力不同的主要原因，如唐岷宸等［12］發現一株貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），可以分泌乙酸和其他小分子有機酸，其最大溶磷量能達到582.4 mg/L；王莉晶等［13］從萬年草（Sedum versadense）根際土壤中分離的草酸青霉（Penicillium oxalicum），能夠分泌蘋果酸和酒石酸，最大溶磷量可達642.28 mg/L；喬歡等［14］自馬尾松（Pinus massoniana）根際分離到的嗜松青霉（Penicillium pinophilum）JP-NJ4，能夠分泌葡萄糖酸、草酸和丙二酸，對磷酸三鈣的最大溶磷量為1 390 mg/L。不同的培養條件（碳源、氮源、溫度和轉速等）會對微生物的溶磷效果產生影響，對培養條件進行優化，不僅可以了解微生物培養過程中的生物特性，還能夠提高微生物的活菌率和溶磷能力［15］。黃達明等［16］自作物根際土壤篩選分離出的洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）P0417，對磷酸三鈣培養基的初始溶磷量為503.53 mg/L，優化后其在葡萄糖10 g/L、草酸銨0.5 g/L、NaCl 1.0 g/L培養條件下溶磷量為791.84 mg/L，提高了1.57倍。胡山等［17］對自鹽堿土壤中分離出來的溶磷菌Y3-35進行溶磷條件優化，在最佳溶磷條件下（葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨15.0 g/L，氯化鈉2.5 g/L和溫度24℃），菌株Y3-35的溶磷量達到723.34 mg/L，比優化前提高251%。

目前對茶園中溶磷微生物的研究報道較少，為了擴充茶園中的溶磷微生物種質資源，選擇特定茶園進行溶磷微生物的分離、鑒定和生物特性研究。山東省日照市瀚林春茶園土壤中難溶性磷酸鹽與有效磷均含量豐富，因此預測在茶樹根際土壤中可能存在高效的溶磷微生物。本研究以自茶樹根際土壤中篩選出的溶磷真菌JL-1為研究對象，對其溶磷特性和促生效果進行研究，并對其溶磷條件進行優化，以期為該菌株在生物肥料方面的開發和應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 真菌JL-1由本實驗室從日照瀚林春茶園根際土壤中分離篩選獲得。

1.1.2 培養基 無機磷培養基（g/L）：葡萄糖 10.00，（NH4）2SO40.50，NaCl 0.30，KCl 0.30，MgSO4·7 H2O 0.30，Ca3（PO4）25.00，FeSO4·7 H2O 0.03，MnSO40.03，pH值7.0-7.2，115℃滅菌20 min。無機磷固體培養基：在無機磷培養基中添加18.00 g/L的瓊脂粉。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：取46.00 g PDA 培養基（成品，購自青島海博生物技術有限公司），1 000 mL蒸餾水，115℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定 將JL-1真菌接種于PDA培養基中央培養3 d，觀察菌落形狀、顏色和大小等，利用光學顯微鏡觀察菌絲和孢子形態，依據《真菌鑒定手冊》對其進行初步鑒定［18］。

長滿JL-1菌落的PDA平板寄送至青島派森諾基因生物技術有限公司進行ITS序列測序，將獲得的ITS序列與NCBI網站上已知序列進行比對，運用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.2.2 對不同難溶磷酸鹽的溶磷能力 分別以磷酸三鈣、磷酸鋅、磷酸鋁和磷酸鐵作為無機磷培養基中的唯一磷源，其他成分保持不變制備無機磷固體培養基，將JL-1點接在含有不同磷酸鹽的無機磷固體培養基上，30℃靜置培養5 d，觀察JL-1在不同磷酸鹽固體培養基上的生長狀態與菌落形態。

1.2.3 發酵液指標檢測

1.2.3.1 發酵液磷含量動態變化 將JL-1接種在PDA培養基上，30℃培養5 d，刮取孢子并用無菌生理鹽水配制成OD600= 0.7的孢子懸液，以接種量2%（體積分數）接種于無機磷培養基中，30℃，180 r/min搖床培養，每組3個平行，每24 h取樣，9 000 r/min離心10 min后，利用釩鉬黃顯色法測定上清液中可溶性磷含量［19］。

1.2.3.2 發酵液pH值動態變化 培養條件同1.2.3.1，每24 h取樣，9 000 r/min離心10 min后，通過pH計測定上清液pH值。

1.2.3.3 發酵液有機酸含量動態變化 培養條件同1.2.3.1，每24 h取樣，9 000 r/min離心10 min后，利用高效液相色譜儀對上清液的有機酸進行檢測［20］。

1.2.4 磷酸三鈣形態變化 配制兩組無機磷培養基，分別接種和不接種JL-1孢子懸液，30℃，180 r/min培養3 d，分別取瓶底白色磷酸三鈣沉淀，電子顯微鏡分別觀察其形態。

1.2.5 溶磷條件優化

1.2.5.1 單因素試驗 碳源：采用不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和果糖）替代無機磷培養基中碳源，以接種量2%（體積分數），30℃，180 r/min搖床培養4 d，通過釩鉬黃顯色法檢測發酵液中的有效磷含量。氮源：采用不同氮源（硫酸銨、氯化銨、尿素、硝酸銨和硝酸鈉）替代無機磷培養基中氮源，以接種量2%（體積分數），30℃，180 r/min搖床培養4 d，利用釩鉬黃顯色法檢測發酵液中的有效磷含量。

1.2.5.2 Plackett-Burman設計 利用Design-Expert 12軟件對碳源、氮源、無機鹽、磷酸三鈣、溫度、轉速、初始pH和接種量8個因子進行Plackett-Burman設計（如表1所示），以發酵液磷含量為響應值。

表1 Plackett-Burman設計Table 1 Plackett-Burman design

1.2.5.3 最陡爬坡設計 對Plackett-Burman設計篩選出的顯著影響因子進行最陡爬坡試驗，目的是快速確定最大響應值（發酵液磷含量）的區域。

1.2.5.4 響應面分析 以發酵液磷含量作為響應值，參照最陡爬坡試驗結果，設計三因素三水平的中心組合試驗（Box-Behnken），并通過Design-Expert 12軟件分析Box-Behnken結果。

1.2.5.5 驗證 在獲得的最佳條件下進行JL-1溶磷試驗，通過試驗結果與理論預測值對比確認模型是否可靠。

1.2.6 盆栽試驗 基質：選用3-5 mm的粗河沙作為土壤替代物，洗滌去除雜物，去離子水浸泡24 h，121℃滅菌20 min，烘干后混合質量分數為0.5%的Ca3（PO4）2，將其分裝至育苗盤中，人為制造缺磷環境。

分組：將108棵萌發的小麥種子分別種入12盆基質中，用無菌去離子水進行噴澆，5 d后每盆僅保留生長高度一致的3棵小麥苗。將12盆小麥苗分為3組進行不同處理：處理一（CK），施用無菌去離子水；處理二（P 1），施用JL-1孢子懸液（無菌去離子水配制）；處理三（P 2），500 mg/L的磷酸二氫鉀溶液（無菌去離子水配制）。將等量的處理液灌根施用后，早晚以無菌去離子水進行噴澆，培養30 d后測定小麥的株高、根長、鮮重、干重等農藝指標。

2 結果

2.1 菌種鑒定結果

在PDA培養基上，JL-1菌落外圍為白色絨狀菌絲，中間有綠色分生孢子，無滲出液，表面形成幾條朝向中心的溝壑，中間微微隆起，菌落背面呈淡黃色；光學顯微鏡下觀察到分生孢子呈球狀，整體呈帚狀枝，從形態上初步斷定其屬于青霉屬（圖1）。

圖1 菌株JL-1菌落、菌絲和孢子Fig.1 Colony, mycelium and spore of strain JL-1

將菌株JL-1的ITS序列輸入NCBI數據庫中進行BLAST比對發現，菌株JL-1與產紅青霉（CBS 129667 Penicillium rubens）同源性達到99.83%，MEGA 7軟件構建的系統發育樹如圖2所示，菌株JL-1與產紅青霉同屬一個分支，親緣關系最近，因此判定該菌為產紅青霉。

2.2 對不同難溶磷酸鹽的溶磷能力

JL-1菌株在磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷酸三鈣解磷培養基上的溶磷情況如圖3所示，JL-1菌株在以磷酸三鈣為唯一磷源的固體培養基上能夠形成非常明顯的溶磷圈，說明JL-1菌株對磷酸三鈣具有很強的溶磷能力；JL-1菌株在磷酸鋁、磷酸鐵和磷酸鋅固體培養基上雖然能夠生長，但不能形成明顯的溶磷圈，說明JL-1菌株對磷酸鋁、磷酸鐵和磷酸鋅的解磷能力非常有限。

圖3 JL-1對不同難溶磷酸鹽的溶磷能力Fig.3 Phosphorous solubility of JL-1 to different insoluble phosphates

2.3 發酵液指標檢測

2.3.1 發酵液中磷含量動態變化 發酵液磷含量動態變化如圖4所示，在第1天發酵液中的磷含量依然為0，之后開始快速升高，在第4天達到頂峰（408.16 mg/L），之后開始緩慢下降。

圖4 發酵液溶磷量和pH變化Fig.4 Change of phosphorus solubility and pH in fermentation broth

2.3.2 發酵液pH值動態變化 發酵液pH值動態變化如圖4所示，第0天的發酵液pH值為8.19，然后隨著時間逐漸降低，在第3天達到最低（4.55），之后開始緩慢上升。

2.3.3 發酵液中有機酸含量動態變化 利用高效液相色譜儀對發酵液中的有機酸進行檢測，發現只存在一個主要峰（圖5），說明JL-1在溶磷過程中主要分泌一種有機酸。根據出峰時間可初步判斷其為葡萄糖酸，在相同條件下檢測葡萄糖酸標準品，出峰時間與之一致，因此確定該有機酸為葡萄糖酸。發酵液中葡萄糖酸含量動態變化如圖6所示，在第1天少量存在，在第3天達到峰值9.99 g/L，之后開始緩慢下降。

圖5 發酵液有機酸檢測峰圖Fig.5 Peak map of organic acid detection in fermentation broth

圖6 葡萄糖酸含量動態變化Fig.6 Dynamic change of gluconic acid content

2.3.4 磷酸三鈣形態變化 對照組中的磷酸三鈣顆粒仍保持較大顆粒，且表面結構較為致密；在接種JL-1真菌的試驗組中，大塊的磷酸三鈣顆粒全部消失，僅存在少許小塊磷酸三鈣顆粒，且表面結構疏松，存在明顯被酸侵蝕的痕跡（圖7）。

圖7 磷酸三鈣的形態變化Fig.7 Morphological changes of tricalcium phosphate

2.4 溶磷條件優化

2.4.1 單因素試驗 如圖8所示，菌株JL-1溶解磷酸三鈣的最佳碳源和氮源分別是葡萄糖和硫酸銨。

圖8 不同碳氮源對溶磷量影響Fig.8 Effects of different carbon and nitrogen sources on dissolved phosphorus

2.4.2 Plackett-Burman設計 試驗結果采用Design-Expert 12軟件進行方差分析，結果如表2所示，整個模型的P值為0.004 6，模型顯著。8個因子中葡萄糖、磷酸三鈣和溫度為響應值（發酵液磷含量）的顯著影響因子（P＜0.05）。

表2 Plackett-Burman設計方差分析Table 2 Plackett-Burman design analysis of variance

2.4.3 最陡爬坡試驗 試驗結果如表3所示，葡萄糖含量、磷酸三鈣含量和溫度的最佳范圍區間分別為25-35 g/L、6-8 g/L和30-34℃。

表3 最陡爬坡試驗結果Table 3 Experiment results of the steepest climb

2.4.4 Box-Behnken設計 試驗結果如表4所示，采用Design Expert 12軟件對其進行方差分析，結果如表5所示。其中A為葡萄糖含量，B為磷酸三鈣含量，C為溫度，Y為發酵液磷含量，對其進行多元回歸擬合分析，得到響應值為發酵液磷含量（JL-1的溶磷量）的回歸方程為：

表4 Box-Behnken試驗結果Table 4 Box-Behnken experiment results

表5 Box-Behnken設計方差分析Table 5 Box-Behnken design variance analysis

Y=1 134.00-28.00×A+7.88×B-6.37×C-137.75×AB-157.75×AC-159.00×BC-139.75×A2-95.50×B2-152.00×C2。

對此回歸方程進行方差分析，其F=398.42，P＜0.000 1，差異極顯著；模型失擬項的P=0.066 3＞0.05，差異不顯著，說明該模型非常合理。F值表示擬合模型中幾個因素對響應值的影響程度，F值

2.5 盆栽試驗

JL-1菌株對小麥的促生試驗結果如表6所示，P1組小麥的生長狀態要顯著強于CK組，其根長、株高、總鮮重、上部鮮重和上部干重相對于CK組分別提高了57.9%、36.4%、42.9%、40.8%和33.9%，但P1組小麥的生長狀態仍弱于P2組小麥。結果證明，有效磷是限制小麥幼苗生長的關鍵因素之一，在盆栽狀態下，JL-1菌株仍然能夠將磷酸三鈣中的磷轉換成可被小麥吸收利用速效磷，從而促進小麥生長。越大，表明該因素對響應值的影響越大，由表可知，A＞B＞C，即葡萄糖＞磷酸三鈣＞溫度。交互項中，AB、AC和BC均顯著，說明3個因子之間存在交互作用。

表6 JL-1對小麥的促生效果Table 6 Growth promoting effect of JL-1 on wheat

根據回歸方程和圖9可知，JL-1菌株的最佳培養條件組合為葡萄糖含量為29.8 g/L、磷酸三鈣含量為7.1 g/L和溫度為31.9℃，在此條件下發酵液中磷含量的理論值為1 135.69 mg/L。

2.4.5 驗證 按照優化后的培養條件進行驗證試驗，葡萄糖29.8 g/L、磷酸三鈣7.1 g/L、溫度31.9℃，搖瓶培養4 d后，檢測發酵液中的磷含量為1 194.15 mg/L，與模型預測相吻合，而且是初始培養條件下（408.15 mg/L）的近3倍。

3 討論

3.1 產紅青霉的農業應用潛力

早期產紅青霉多被用作生防菌株進行研究，其對包括尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、齊整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）在內的多種病原菌具有有效的生防作用［21-22］。產紅青霉212（PO212）能夠有效控制多種園藝作物中的病原體，在番茄（Solanum lycopersicum）根際施加一定量的PO212，可以有效防治番茄枯萎病和黃萎?。?3］。在含有馬鈴薯孢囊線蟲（Globodera pallida Behrens）的土壤中施加PO212，能夠抑制線蟲生長和繁殖，作為一種潛在的生物防治接種劑，可以保護馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）免受線蟲的侵害［24］。隨后研究發現其能夠分泌大量與秸稈廢棄物降解相關的生物酶（如纖維素酶、木質素過氧化物酶、漆酶、錳過氧化物酶和阿魏酸酯酶等），產紅青霉又被作為生物酶生產菌株進行研究［25］。Yasser等［26］在分離馬鈴薯內生真菌時分離出一株具有分泌纖維素酶和錳過氧化物酶能力的產紅青霉，且其對白色念珠菌（Candida albicans）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等病原菌具有抑制作用?？椎屡d等［27］也在研究中利用產紅青霉作為產木質素降解菌，搭配產纖維素降解菌對向日葵列當（Orobanche cumana）進行生物破壁處理。本研究盆栽試驗發現，JL-1菌株在缺磷土壤中不僅能釋放磷酸三鈣中的磷，促進植物生長，并顯著提高小麥的根長、株高和鮮重。因此，JL-1菌株可以作為微生物磷肥使用，促進土壤中難溶磷酸三鈣的溶解，從而促進植物生長。結合產紅青霉可能具有的生防和產酶潛力，使JL-1菌株有望成為一株兼具生物防治和溶磷促生功能的多功能生物肥料微生物菌株。

3.2 產紅青霉的溶磷機制

溶磷微生物能夠分泌蘋果酸、檸檬酸、乳酸、丙酸、葡萄糖酸、琥珀酸、草酸等有機酸溶解難溶性磷酸鹽（如磷酸三鈣、磷酸鐵和磷酸鋁等），葡萄糖酸是由葡萄糖的醛基經氧化生成的糖酸，已報道的研究中，分泌葡萄糖酸是多種微生物的主要溶磷機制。吳海燕等［28］在探討巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）溶磷機理時發現，產生溶磷效果的主要物質是其分泌的葡萄糖酸。Buch等［29］發現在缺磷環境下，假單胞菌（Pseudomonasviciae）能夠通過胞外葡萄糖產生高水平的葡萄糖酸，釋放磷酸鹽中的磷。韓楊［30］同樣發現葡萄糖酸是其分離的耐鹽溶磷菌J101的主要溶磷物質。本研究發現，在菌株JL-1溶磷過程中，發酵液pH值與葡萄糖酸含量、pH值與磷含量以及葡萄糖酸與磷含量的相關性系數分別為-0.991、-0.981和0.993，分別呈顯著負相關、顯著負相關和顯著正相關，說明葡萄糖酸含量是影響溶磷能力的重要因素；不同碳氮源對菌株JL-1溶磷能力影響的研究表明，菌株JL-1在葡萄糖作為唯一碳源時的溶磷能力顯著高于其他碳源，但不同無機氮源對溶磷能力的影響并不顯著，說明葡萄糖是影響溶磷能力的重要因素，且菌株JL-1能夠使無機磷培養基中的磷酸三鈣顆粒變小、表面結構疏松，出現明顯被侵蝕痕跡，進一步證明了葡萄糖酸是溶磷的主要物質，這與吳海燕等［28］的研究結果一致。

3.3 產紅青霉的溶磷條件優化

青霉屬（Penicillium sp.）是土壤中溶磷能力最強的真菌之一，劉春菊等［31］對青霉菌株進行解磷作用篩選時，發現一株高效溶磷的草酸青霉，其最大溶磷量為1 386.93 mg/L。張建峰等［32］從鹽堿地土壤樣品中篩選出一株高效溶磷的繩狀青霉（Penicillium funicuiosum），其對磷酸三鈣的初始溶磷量為1 064.21 mg/L，經過正交試驗優化培養條件，其最大溶磷量提高至1 276.75 mg/L。本研究從茶樹根際土壤中篩選獲得的菌株JL-1為青霉屬中的產紅青霉，其初始溶磷量為408.15 mg/L，經響應面優化后，最大溶磷量提高至1 194.15 mg/L，提高了近3倍。菌株JL-1的最佳碳氮源為葡萄糖和硫酸銨，影響其溶磷量的最顯著影響因素為葡萄糖含量、磷酸三鈣含量和培養溫度；在葡萄糖29.8 g/L、磷酸三鈣7.1 g/L、溫度31.9℃的條件下，菌株JL-1在無機磷培養基中的溶磷能力最佳。如表7所示，JL-1的溶磷量雖然略低于黑曲霉（Aspergillus niger）YJC191和嗜松青霉（Penicillium pinophilum）JP-NJ4，但高于其他解磷菌。李靜等［42］首次從小麥田間分離出一株具有溶磷能力的產紅青霉R3，其溶磷量為328.79 mg/L，本研究分離的產紅青霉JL-1菌株的初始溶磷量是R3菌株的1.24倍，優化后的溶磷量是R3菌株的近4倍，進一步說明菌株JL-1具有很好的溶磷能力。

4 結論

本研究自茶園根際土壤中篩選出一株高效溶磷的真菌菌株JL-1，經鑒定其為產紅青霉。對產紅青霉的溶磷機理研究發現，其主要通過分泌葡萄糖酸溶解磷酸三鈣。通過響應面優化，在葡萄糖含量29.8 g/L、磷酸三鈣含量7.1 g/L和溫度31.9℃的條件下，JL-1的溶磷量達到1 194.15 mg/L，是初始值的近3倍。JL-1在富含磷酸三鈣的缺磷環境中，能夠顯著促進小麥生長，具有開發為生物肥料的潛力。