乳酸乳球菌生產2'-巖藻糖基乳糖的途徑構建及發酵培養基優化

程亞楠 張文聰 周圓 孫雪 李玉 李慶剛

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津財經大學珠江學院，天津 301811）

人乳寡糖（human milk oligosaccharides, HMOs）是一類不可被人體直接吸收利用，但可被人體腸道中的有益菌群分解利用的復雜碳水化合物，是母乳中含量僅次于乳糖和脂肪的第三大成分，目前已被鑒定的就有200多種，是保護新生兒身體健康的重要組成成分［1-2］。其可作為益生元，刺激雙歧桿菌（Bifidobacterium）和乳桿菌（Lactobacillus）等有益菌群的生成［3］，作為配體類似物預防病原體黏附腸道［4］，也可作為免疫調節因子，減輕免疫相關炎癥的反應，提高嬰兒腸道免疫功能［5］。同時，HMOs在大腦發育、神經元傳遞和突觸的形成中具有重要作用［6-7］。2′-巖藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose, 2′-FL）在HMOs中含量占比最高，可達31%［8］，同時也是結構最為簡單的寡糖，而且具有HMOs的大部分功能，所以探索2′-FL如何安全高效合成，對促進2′-FL的產業化具有重要意義。

2′-FL的合成方法主要有3種，化學法、酶法和微生物全細胞合成法。其中微生物全細胞合成法具有條件溫和、成本低廉等特點，是最常用的2′-FL合成方法［9-10］。2′-FL的微生物合成過程如圖1所示，其中GDP-巖藻糖的從頭合成途徑，以胞內果糖-6-磷酸為前體，通過甘露糖-1-磷酸異構酶ManA、磷酸甘露糖變位酶ManB、甘露糖-1-磷酸鳥苷酰轉移酶ManC、GDP-甘露糖4,6-脫水酶Gmd，以及GDP-4-酮-6-脫氧甘露糖3,5-變旋酶/4-還原酶WcaG來合成GDP-巖藻糖［11］。補救合成途徑則以L-巖藻糖為合成起始物質，通過雙功能酶L-巖藻糖激酶/GDP-巖藻糖焦磷酸化酶Fkp來合成GDP-巖藻糖［12-13］。GDP-巖藻糖和乳糖在α-1,2-巖藻糖基轉移酶的作用下，生成2′-FL。目前2′-FL生產研究大多在大腸桿菌（Escherichia coli）中，但大腸桿菌并不適合直接在食品中應用，因此其他食品安全級微生物，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）等也已被證實可用于生產2′-FL。在酵母細胞中通過對外源基因gmd、wcaG、fkp共表達，可以得到相對豐富的GDP-巖藻糖［14-16］，進一步過表達巖藻糖基轉移酶fucT2和乳糖轉運蛋白lac12，2′-FL產量達到0.5 g/L左右［17-18］。谷氨酸棒桿菌具有將甘露糖轉化為GDP-甘露糖的manB和manC基因，共表達manB、manC、gmd和wcaG，可有效合成GDP-巖藻糖［19］，在此基礎上表達巖藻糖基轉移酶基因fucT2和乳糖透過酶基因lacY，以葡萄糖和乳糖為底物，2′-FL產量達到0.246 g/L［20］。而本研究中所選用的乳酸乳球菌是一種可直接應用于乳制品中的食品安全級微生物［21-22］，目前還沒有用于合成2′-FL的報道，但有報道證明，通過對乳酸乳球菌進行改造，可用于表達酶類和活性蛋白等［23-24］。

圖1 2′-FL的從頭合成途徑和補救合成途徑Fig.1 De novo and salvage synthesis pathways of 2′-FL

本研究在乳酸乳球菌原有的代謝途徑基礎上，將2′-FL合成途徑中所需的異源微生物的相關基因，以在質粒或基因組上表達的方式轉入選取的乳酸乳球菌宿主中，構建從頭合成途徑，進一步優化發酵培養基，實現以葡萄糖和乳糖為底物的2′-FL有效合成，為2′-FL的生物制備提供了新策略，具有重要的科研價值和研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒信息以及引物序列 本研究中所用菌株、質粒和引物信息見表1。

1.1.2 主要試劑 實驗中用到的主要試劑包括PCR產物純化試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，質粒提取試劑和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，一步法無縫克隆試劑盒（ClonExpress? CE II）購自南京諾唯贊生物科技公司，PCR擴增使用的phusion DNA polymerase購自Thermo Fisher Scientific公司，酵母粉購自英國Oxoid公司，氨芐青霉素、3-（N-嗎啉）丙磺酸（MOPS）、Nisin乳鏈菌肽購自Sigma公司；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.1.3 儀器與設備 實驗中用到的主要儀器設備包括PCR擴增儀（Applied Biosystems），DNA凝膠電泳槽（Baygene），高速冷凍離心機（Sigma），高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），Bio電擊轉化儀（美國BTX公司），超聲波細胞破碎機（加拿大愛威斯汀），分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.1.4 培養基 LB培養基成分（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0。發酵培養基成分（g/L）：磷酸氫二鈉10.0，硫酸鎂1.4，氯化鈉4.0，無水乙酸鈉1.5，酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，抗壞血酸0.5，MOPS 40.0，金屬溶液10.0 mL/L，pH 7.0；利用補救途徑合成2′-FL時，添加10.0 g/L的巖藻糖和5.0 g/L的乳糖；從頭合成途徑時，添加20.0 g/L葡萄糖和5.0 g/L的乳糖。如菌株攜帶誘導型啟動子Pnis時，則在培養基中加入終濃度為0.04 μg/mL的Nisin誘導劑。金屬溶液成分（g/L）：硫酸亞鐵10.0，硫酸鋅2.2，硫酸銅1.0，硫酸錳0.38，四硼酸鈉0.02，七鉬酸銨0.1，氯化鈣2.0。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建 以質粒pNZ8148-1為模板，用引物48-F/R擴增出pNZ8148-1載體片段；以質粒pNZ-fkp、pET-futC為模板，用引物fkp-F1/R1、futC-F1/R1分別擴增出fkp、futC片段；以L.lactis NZ3900基因組為模板，用引物lacF-F/R擴增出lacF片段。利用重疊PCR技術擴增出片段fkp-futC-lacF。利用無縫克隆技術連接片段pNZ8148-1、fkp-futC-lacF，轉化到E.coli JM109中，然后對轉化子進行PCR驗證，并挑取陽性轉化子進行測序，構建成功的質粒命名為pNZ8148-2f（圖2-A）。其中基因fkp來自Bacteroides fragilis，基因futC來自Helicobocton pyloni，基因lacF來自L.lactis。

圖2 2′-FL從頭合成途徑所需質粒的構建流程Fig.2 Construction of plasmids required for the de novo synthesis of 2′-FL

以質粒pNZ8148-2f為模板，用引物pz-F/R擴增出線性片段pNZ8148-futC-lacF；以E.coli MG1655基因組為模板，用引物manC-F/R擴增出manC片段。利用無縫克隆技術連接片段pNZ8148-futC-lacF、manC，轉化到E.coli JM109中，然后對轉化子進行PCR驗證，并挑取陽性轉化子進行測序，構建成功的質粒命名為pNZ8148-CfF1（圖2-A）。再以質粒pNZ8148-CfF1為模板，利用引物FP-F1/R1擴增出線性片段pNZ8148-manC-futC-lacF；以質粒pNZ5319為模板，用引物P32-F3/R3擴增出啟動子P32片段。利用無縫克隆技術連接片段pNZ8148-manC-futC-lacF、P32，轉化到E.coli JM109中，然后對轉化子進行PCR驗證，并挑取陽性轉化子進行測序，構建成功的質粒命名為pNZ8148-CfF2（圖2-A）。

以質粒pNZ5319為模板，用引物5319-F/R、P32-F1/R1、P32-F2/R2擴增出pNZ5319載體片段、啟動子P32-1（含連接基因up、manB的同源臂）、P32-2（含連接基因manA、gmd的同源臂）片段；以L.lactis NZ9000基因組為模板，用引物up-F/R、down-F/R，擴增出同源重組所需的基因upp上游同源臂片段（up）和下游同源臂片段（down）；以E.coli MG1655基因組為模板，用引物manB-F/R、manA-F/R、manA-F/R1、gmd-F/R、wcaG-F/R分別擴增出manB、manA-1（不含同源臂）、manA-2（含連接基因gmd的同源臂）、gmd和wcaG片段；以質粒pNZ8148-1為模板，用引物Pnis-F1/R1、Pnis-F2/R2擴增出啟動子Pnis-1（含連接基因manA、gmd的同源臂）、Pnis-2（含連接基因up、manB的同源臂）片段。利用重疊PCR技術分別擴增出片段pNZ5319-updown、P32-manB-manA-gmd-wcaG、Pnis-manB-manA-gmd-wcaG、P32-manB-manA、P32-gmd-wcaG、PnismanB-manA、Pnis-gmd-wcaG。利用無縫克隆技術連接片段pNZ5319-up-down、P32-manB-manA、Pnisgmd-wcaG，轉化到E.coli JM109中，然后對轉化子進行PCR驗證，并挑取陽性轉化子進行測序，構建成功的質粒命名為pNZ5319-UBAgwD1（圖2-B）。

1.2.2 菌株構建 將質粒pNZ8148-2f分別轉化到L.lactis NZ3900、L.lactis NZ9000中，得到菌株NZ3900（pNZ8148-2f）和NZ9000（pNZ8148-2f）。

將質粒pNZ5319-UBAgwD1轉化到L.lactis NZ9000中，平板上長出的轉化子即為理論上的單交換菌株。對單交換成功的菌株連續傳代7次，排除質粒pNZ5319-UBAgwD1造成的假陽性。又以單交換突變株具有同源性極高的片段，具有遺傳的不穩定性，可以自發進行第二次重組。篩選能夠在5-氟尿嘧啶平板上生長而氯霉素平板上不生長的轉化子，獲得已成功完成雙交換的菌株，命名為NZ9000 1。利用同樣的重組技術可得帶有up-Pnis-manB-manAP32-gmd-wcaG-down片段的菌株NZ9000 2、帶有up-P32-manB-manA-gmd-wcaG-down片段的菌株NZ9000 3、帶有up-Pnis-manB-manA-gmd-wcaG-down片段的菌株NZ9000 4。

將質粒pNZ8148-CfF1轉化到NZ9000 1中，得到菌株NZ9000 5。利用同樣的方法將菌株NZ9000 1、NZ9000 2、NZ9000 3、NZ9000 4和質粒pNZ8148-CfF1、pNZ8148-CfF2分別組合，共得到8株不同的菌株NZ9000 5、NZ9000 6、NZ9000 7、NZ9000 8、NZ9000 9、NZ9000 10、NZ9000 11、NZ9000 12［25-26］。

1.2.3 菌株培養 常規的菌株培養在LB培養基中進行。進行發酵培養時，取甘油保存菌株10 μL接入到5 mL的LB液體培養基中，過夜培養作為種子液，按2%的量接種到發酵培養基中。發酵培養使用250 mL三角瓶進行，裝液量為30 mL，在振蕩搖床中培養，培養溫度為37℃，轉速為220 r/min。如菌株攜帶表1所示含有氯霉素抗性的質粒，則培養基中加入終濃度為50 mg/L的氯霉素。利用分光光度計檢測培養液OD600測試菌株的生長狀況，利用高效液相色譜/蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD）檢測發酵液中2′-FL的產量。

1.2.4 培養基優化 以含胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，不含氯化高鐵血紅素的發酵培養基為基礎，測定菌株生長和發酵生產2′-FL所需最適氯化高鐵血紅素的濃度，添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL，每組3個平行。

以含氯化高鐵血紅素2.5 μg/mL的發酵培養基為基礎，組合優化胰蛋白胨和酵母粉的濃度對菌株生長和發酵產2′-FL的影響。如表2所示，共有16組不同的組合形式，每組3個平行。

表2 胰蛋白胨與酵母粉協同優化濃度組合Table 2 Co-optimized concentration combination of tryptone and yeast extract

1.2.5 使用HPLC檢測發酵液中2′-FL濃度 取1 mL發酵液，利用超聲波破碎細胞，將破碎細胞懸液置于沸水中10 min，13 000 r/min離心10 min，收集上清。向上清中加入三倍體積的乙腈，混勻后13 000 r/min離心10 min。吸取上清，用0.22 μmol/L的有機系濾膜過濾處理后利用HPLC-ELSD檢測。所用的色譜柱為Carbohydrate ES 5 μm 250 mm × 4.6 mm，檢測器為蒸發光檢測器，流動相組成為：70%的乙腈（乙腈∶水，體積比），柱溫為30℃，進樣量為10 μL，流速為0.8 mL/min［27-28］。利用不同濃度的2′-FL標準品繪制峰面積對應濃度的標準曲線，計算樣品中2′-FL的含量。

2 結果

2.1 2′-FL補救合成途徑的構建與底盤菌株評價

L.lactis NZ9000中本身沒有乳糖吸收和分解利用途徑，不會利用作為2′-FL前體的乳糖，在構建2′-FL生產菌株時需要引入乳糖透過酶基因lacF。將片段fkp、futC、lacF與表達載體pNZ8148-1連接并轉化到E.coli JM109后，用引物fkp-F1和lacF-R1進行PCR驗證，如果構建不成功，則無條帶產生，如果構建成功，條帶大小約為4 000 bp。結果如圖3-A所示，PCR條帶約為4 000 bp，與片段fkp-futC-lacF理論大小一致，表明質粒pNZ8148-2f構建成功。

圖3 驗證菌株的菌落PCR電泳圖Fig.3 Electrophoresis diagram of PCR product for strain validation

利用發酵培養基，添加10 g/L的巖藻糖和5 g/L的乳糖，測試NZ3900（pNZ8148-2f）和NZ9000（pNZ8148-2f）搖瓶發酵過程中的2′-FL生產和菌株生長狀況。同時，為驗證基因fkp、futC和lacF過表達，以及質粒pNZ8148-1本身對菌株生長的影響，同時測試了不含質粒的野生菌以及含有空載質粒的野生菌生長狀況。2′-FL產量如圖4-A所示。隨著發酵時間的延長，產量逐漸提高，48 h產量達到最高，分別為0.16 g/L和0.40 g/L。菌株的生長曲線如圖4-B, C所示，菌株NZ3900（pNZ8148-2f）和NZ9000（pNZ8148-2f）生長速率稍慢于分別對應的帶有空載質粒的野生型菌株NZ3900（pNZ8148-1）和NZ9000（pNZ8148-1）。隨著生長周期的延長，NZ9000（pNZ8148-2f）的培養液菌體濃度能夠與其對照出發菌株持平，而NZ3900（pNZ8148-2f）則最終低于其對照菌株。綜上，將L.lactis NZ9000用作2′-FL生產的底盤菌種。

2.2 利用NZ9000構建從頭合成途徑生產2'-FL

尿嘧啶磷酸核糖轉移酶的編碼基因upp是乳酸乳球菌中公認的非必須基因，是常用的基因插入位點。在敲除upp基因的同時將基因P32、manB、manA、Pnis、gmd、wcaG整合到L.lactis NZ9000細胞中。將片段up、P32、manB、manA、Pnis、gmd、wcaG、down與表達載體pNZ5319連接并轉化到E.coli JM109后，用引物P32-F1和wcaG-R進行PCR驗證，如果構建不成功，則無條帶產生，如果構建成功，條帶大小約為5 000 bp。結果如圖3-B所示，PCR條帶約為5 000 bp，與片段P32-manB-manAPnis-gmd-wcaG理論大小一致，表明質粒pNZ5319-UBAgwD1構建成功。同理可得質粒pNZ5319-UBAgwD2、pNZ5319-UBAgwD3、pNZ5319-UBAgwD4。

將質粒pNZ5319-UBAgwD1化轉進L.lactis NZ9000中，用引物P32-F1和wcaG-R進行PCR驗證，如果單交換不成功，則無條帶產生，如果單交換成功，條帶大小約為5 000 bp。結果如圖3-C所示。條帶約為5 000 bp，與片段P32-manB-manA-Pnis-gmd-wcaG理論大小一致，證明菌株已成功進行單交換。將單交換菌株連續7次傳代，篩選能夠在5-氟尿嘧啶平板上生長而氯霉素平板上不生長的轉化子，用引物U-F和D-R進行PCR驗證，如果雙交換不成功，則條帶大小約為3 000 bp，與原始菌株L.lactis NZ9000在該位點的基因up-upp-down大小一致，表明菌株恢復成野生型，如果雙交換成功，條帶大小約為7 000 bp。結果如圖3-D所示，條帶約為7 000 bp，與片段up-P32-manB-manA-Pnis-gmd-wcaG-down理論大小一致，說明已成功完成雙交換，菌株NZ9000 1構建成功。同理可得菌株NZ9000 2、NZ9000 3、NZ9000 4。

將片段manC、futC、lacF與表達載體pNZ8148-1連接并轉化到E.coli JM109后，用引物manC-F和lacF-R進行PCR驗證，如果構建不成功，則無條帶產生，如果構建成功，條帶大小約為3 000 bp。結果如圖3-E所示，PCR條帶約為3 000 bp，與片段manC-futC-lacF理論大小一致，表明質粒pNZ8148-CfF1構建成功。同理可得質粒pNZ8148-CfF2。

利用發酵培養基，添加20 g/L的葡萄糖和5 g/L的乳糖，對菌株NZ9000 5、NZ9000 6、NZ9000 7、NZ9000 8、NZ9000 9、NZ9000 10、NZ9000 11、NZ9000 12進行搖瓶發酵，檢測2′-FL生產和菌株生長狀況，結果如圖5所示。8株菌株的2′-FL最高產量具有明顯的差異，NZ9000 6最多，產量約為0.28 g/L；NZ9000 8次之，為0.26 g/L；NZ9000 11最少，為0.09 g/L（圖5-A）。結果證明成功打通了L.lactis NZ9000從頭合成2′-FL的途徑。途徑酶表達水平的優化是構建生產菌株的重要步驟，該研究中，對途徑酶進行了不同程度的表達，構建出8個不同的菌株，結果（圖5-A）顯示，通過雙啟動子以P32-manB-manA-Pnis-gmd-wcaG的方式在基因組上過表達相關基因，通過雙啟動子以Pnis-manC-P32-futC-lacF的方式在質粒上過表達相關基因，構建出的菌株NZ9000 6，最有利于高產2′-FL。為了分析途徑表達水平對菌株生長的影響，利用菌株NZ9000、NZ9000（pNZ8148-1）為對照，比較了產量最高的菌株NZ9000 6和產量最低菌株NZ9000 11的生長曲線。兩者的生長速率和穩定期的生物量差別很小，但是均明顯低于原始菌株，說明2′-FL合成途徑的強化一定程度上影響了菌體生長（圖5-B）。

圖5 帶有從頭合成途徑菌株的2′-FL產量和生長曲線Fig.5 Productions and growth curves of different strains with 2′-FL de novo synthesis pathway

2.3 發酵培養基優化

2.3.1 添加氯化高鐵血紅素提高菌株生產性能 乳酸菌呼吸鏈不完整，TCA循環途徑受限，氯化高鐵血紅素能夠幫助L.lactis形成完整的呼吸鏈，來提高菌株的性能，但是L.lactis本身不具有氯化高鐵血紅素合成能力。該研究中，為了提高最優菌株NZ9000 6的水平，向發酵培養基中添加終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/mL的氯化高鐵血紅素，測試了菌株生產和生長狀況。結果如圖6所示，隨著氯化高鐵血紅素濃度從0-2.5 μg/mL逐漸升高，菌株生長10 h后的OD600無明顯變化，2′-FL產量明顯逐漸增加，濃度為2.5 μg/mL時產量最高，為0.66 g/L。綜合來看，濃度為2.5 μg/mL的氯化高鐵血紅素最適合菌株生長和發酵產2′-FL。

圖6 氯化高鐵血紅素濃度對菌株生長和2′-FL生產的影響Fig.6 Effects of hemin chloride concentration on cell growth and 2′-FL production

2.3.2 胰蛋白胨和酵母粉濃度協同優化提高菌株生產性能 由于L.lactis天然的代謝缺陷，其對營養要求較高。該研究中考察了胰蛋白胨和酵母粉濃度對菌株NZ9000 6生長和生產2′-FL的協同影響。在含有2.5 μg/mL氯化高鐵血紅素的發酵培養基基礎上，測試不同胰蛋白胨和酵母粉濃度組合（表2）的影響。胰蛋白胨濃度為15 g/L時，2′-FL的產量總體處在較高水平，其中，酵母粉濃度為6 g/L時，2′-FL的產量最高，為1.58 g/L，菌株生長也處于最高水平，菌株生長10 h后OD600為10.06。因此，選擇發酵培養基中胰蛋白胨為15 g/L，酵母粉為6 g/L用于菌株NZ9000 6生長和生產2′-FL（圖7）。

圖7 胰蛋白胨和酵母粉濃度對菌株生長和2′-FL生產的影響Fig.7 Effects of tryptone and yeast extract concentration on cell growth and 2′-FL production

3 討論

3.1 L.lactis NZ9000菌株是2'-FL生產的優勢宿主

2′-FL是一種含量最豐富的人乳寡糖，在嬰幼兒成長發育過程中起著至關重要的作用。L.lactis作為可直接用于乳制品的食品級微生物，同時也是一種重要的工業底盤菌種。構建生產人乳寡糖的L.lactis菌株具有重要意義，目前還沒有相關報道。出發菌株的特性對生產水平具有較大影響，本研究在常用的乳酸乳球菌底盤NZ3900和NZ9000中，利用含有fkp、futC和lacF基因的重組質粒，構建2′-FL補救合成途徑，2′-FL的產量分別為0.16 g/L和0.40 g/L，從而證實了L.lactis可用于生產2′-FL，結合菌株自身性狀和生長代謝分析，認為NZ9000更適合作為2′-FL生產的底盤菌。

3.2 優化途徑關鍵酶的表達對提高2'-FL生產具有重要作用

補救合成途徑需要昂貴的巖藻糖作為底物，利用從頭途徑合成2′-FL是實現其規模化工業生產的必然。以NZ9000為底盤，構建了2′-FL的從頭合成途徑，其中涉及到大量基因，而基因的表達優化是構建菌株，提高產量的重要方法。根據分析，L.lactis中缺乏合成2′-FL的途徑，而E.coli作為獲取方便、途徑明確的常用菌株，具有2′-FL相對完整的基因，H.pylori中futC表達活性相對較高，因此為保證基因的高效穩定表達，將E.coli來源的manA、manB、gmd和wcaG基因整合到L.lactis NZ9000染色體的upp位點上進行表達［29-31］，將manC和futC基因，以及為futC提供胞內底物的乳糖透過酶lacF基因通過質粒表達［32］。另外，manC和futC分別為途徑中固定GDP和釋放GDP分子的酶，分析其用質粒高表達可能能夠提高途徑的效率。本研究利用不同的啟動子對途徑酶的表達水平進行調控，經過48 h發酵后，2′-FL的產量出現了明顯的差異，最優菌株NZ9000 6的2′-FL搖瓶產量為0.28 g/L，是最低產量菌株的3.11倍，結果證明途徑調控對于菌株產量影響較大，NZ9000 6的2′-FL從頭合成途徑得到了較好的優化。改造后菌株NZ9000 6、NZ9000 11在生長速率和穩定期的生物量方面明顯低于野生菌株NZ9000、NZ9000（pNZ8148-1），可能是因為2′-FL合成途徑的強化對菌體自身的代謝造成負擔，影響菌體生長。

3.3 發酵培養基添加血紅素有利于2'-FL生產

乳酸菌屬于兼性厭氧微生物，缺失部分呼吸鏈，無法解除氧氣對菌株的毒害作用，也不能形成完整的三羧酸循環，可能限制菌株作為工業菌株的生產水平［33］。付龍云［34］通過在乳酸乳球菌中添加氯化高鐵血紅素，使細胞具有了完整的呼吸鏈，提高了細胞的生存能力。本研究進一步優化了培養基中氯化高鐵血紅素濃度，并協同優化了胰蛋白胨和酵母粉濃度。添加2.5 μg/mL的氯化高鐵血紅素后，菌株生長有明顯的改善，2′-FL產量明顯提升，達到0.66 g/L。在此基礎上，優化獲得了最佳的胰蛋白胨濃度15 g/L、酵母粉濃度6 g/L，菌株NZ9000 6生長和生產進一步改善。以往的研究中，利用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等作為底盤，通過2′-FL途徑過表達，利用適合底盤的發酵培養基，2′-FL搖瓶發酵水平一般為0.50-1.00 g/L［17-18,35］。本研究中，通過途徑優化和培養基優化，NZ9000 6的2′-FL搖瓶發酵產量達到1.58 g/L。未來，通過基因工程改造底盤的代謝缺陷，并進一步敲除2′-FL支路途徑、提高底盤和2′-FL途徑的適配性等，有可能進一步提高菌種的生產水平。

4 結論

本研究篩選出更適合2′-FL生產的L.lactis NZ9000。通過優化表達manA、manB、gmd、wcaG、manC、futC和lacF，在L.lactis NZ9000中構建了從頭合成途徑，實現了2′-FL的積累；優化發酵培養基中氯化高鐵血紅素濃度、協同優化胰蛋白胨和酵母粉濃度，進一步提高了2′-FL的產量，為實現2′-FL在可直接用于乳制品的食品級微生物乳酸乳球菌中的工業化生產奠定基礎。