轉錄組分析轉錄因子AtbHLH68調控細胞壁發育的分子機制

林紅妍 郭曉蕊 劉迪 李慧 陸海

（1.林木育種與生態修復國家工程研究中心，北京 100083；2.樹木花卉育種生物工程國家林業和草原局重點實驗室，北京 100083；3.北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083）

植物細胞壁是由纖維素（cellouse）、半纖維素（hemicellouse）、果膠（pectin）、木質素（lignin）多糖和蛋白質等物質組成的復雜結構，在植物細胞和組織中發揮機械支撐、水分和物質運輸、防御脅迫的作用［1-2］。纖維素是由纖維素合酶復合體（cellulose synthase complex，CSC）催化的葡聚糖鏈經多次聚合而成。每個CSC是由18-24個纖維素合成酶（cellulose synthase，CesA）組成的花環結構［3］。在擬南芥中，不同的CesA在初生壁和次生壁中發揮不同的功能［4］。半纖維素是由木聚糖（xylan）、木葡聚糖（xyloglucan）和甘露聚糖（mannan）等組成，木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase / hydrolase，XTH）是一類細胞壁修飾酶，催化小分子木葡聚糖發生水解或轉移［5-6］。木質素主要存在于特定細胞的次生壁中，包括導管細胞、纖維細胞等。木質素經過苯丙烷途徑合成，苯丙氨酸經過脫氨、羥基化和甲基化修飾以及氧化還原反應形成3種木質醇（monolignol），香豆醇、松柏醇和芥子醇，分泌到質外體后在過氧化物酶（peroxidase superfamily protein，PER）或漆酶（laccases，LAC）的作用下聚合形成H型、G型和S 型木質素［7］。果膠是一類富含半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）的分支雜多糖，在高爾基體中合成時被高度甲酯化。隨后被分泌到細胞壁上通過果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）作用去甲酯化，該過程受到果膠甲酯酶抑制劑（pectin methylesterase inhibitor，PMEI）調控［8-9］。去甲酯化的果膠在多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonases，PG）的作用下被水解成半乳糖醛酸二聚體或單體半乳糖醛酸［10］。果膠裂解酶（pectate lyase，PL）則是通過β-反式消除作用使GalA的C-5與C-4位生成碳碳雙鍵而導致α-1,4糖苷鍵斷裂，進而產生含有不飽和半乳糖醛酸的寡聚糖［11］。細胞壁中半纖維素與木質素共價連接，而與纖維素則通過氫鍵或范德華力結合，它們之間彼此交聯構成細胞壁骨架［12-13］。果膠則沉積在細胞壁骨架中，其修飾程度會影響細胞壁的強度［14］。細胞壁作為一個動態結構，其發育受到轉錄因子、功能基因和激素等的復雜調控［15-16］。

在真核生物中堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）蛋白是一個龐大的轉錄因子家族，擬南芥中133個bHLH轉錄因子可分為12個亞家族，AtbHLH68位于第10亞家族［17］。以往研究表明，在棉花中，轉錄因子GhbHLH18結合并激活GhPER8基因表達，促進松柏醇和芥子醇氧化為G型和S型木質素，GhbHLH18突變體的棉花纖維更長且韌性更強［18］。Zhao等［19］研究發現CmHLB與CmKNAT7相互作用，菊花中過表達基因CmHLB導致莖機械強度，細胞壁厚度和木質素含量上升。在擬南芥中異源表達轉錄因子SbbHLH1會導致木質素合成基因表達量以及木質素含量下降［20］。Cao等［21］研究表明玉米中的ZmIBH1-1 直接激活次生壁合成基因WAT1，轉錄組分析ZmIBH1-1 通過影響細胞壁修飾，細胞發育和激素相關基因來控制玉米葉片角度。以上研究結果表明bHLHs家族轉錄因子參與調控細胞壁發育。Le等［22］分別通過GUS組織定位染色實驗和RT-qPCR實驗發現AtbHLH68在擬南芥花序莖維管組織中高表達，因此推測其在細胞壁中發揮主要功能。

為探究轉錄因子AtbHLH68通過哪些途徑參與調控細胞壁合成，以pER8-AtbHLH68轉基因擬南芥為材料，對其進行雌二醇誘導，獲得轉錄組數據，篩選差異基因進行GO功能和KEGG通路分析，從而探究其影響的下游基因，最后利用RT-qPCR驗證轉錄組數據可靠性，該研究為闡明轉錄因子AtbHLH68在細胞壁發育方面的分子機制提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

構建pER8-AtbHLH68重組載體，花序侵染法遺傳轉化野生型擬南芥獲得轉基因pER8-AtbHLH68植株。雌二醇購買于上海源葉生物科技有限公司，所有引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 材料種植與樣品處理 pER8-AtbHLH68轉基因擬南芥種子萌發后將幼苗移栽至無菌土中，提取葉片DNA，并利用2×M5 Hiper超光速Mix試劑盒（聚合酶，北京）通過PCR法鑒定陽性植株，引物如表1所示。培養條件為溫度23℃，光照周期16 h/8 h，光照強度12 000 lx，濕度為70%。擬南芥抽薹15 d左右取其莖并分為對照組和實驗組兩組處理，對照組的處理溶液為DMSO水溶液，實驗組的處理溶液為10 μmol/L的雌二醇溶液。分別取2 h、4 h、6 h、8 h雌二醇處理的擬南芥莖以及DMSO處理的擬南芥莖，去除葉片、果莢和花苞后用錫箔紙包裹迅速投入液氮并存于-80℃冰箱中保存。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

1.2.2 RT-qPCR檢測雌二醇誘導后AtbHLH68表達量 將2 h、4 h、6 h、8 h雌二醇處理和8 h DMSO處理的擬南芥莖在研缽中用液氮快速粉碎，利用天根公司RNA提取試劑盒（RNAprep Pure 總RNA提取試劑盒，DP441）提取總RNA，使用反轉錄試劑盒（Fastking cDNA第一鏈合成試劑盒，KR116）反轉錄得到cDNA，使用SuperReal PreMix Plus試劑盒進行RT-qPCR，引物如表1，程序為天根公司的三步法，以Atactin2為內參基因，用2-ΔΔCT方法計算差異基因的相對表達量。

1.2.3 轉錄組測序 將雌二醇處理以及未處理的擬南芥莖，根據試劑盒說明書的方法進行總RNA提取，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，使用酶標儀Agilent 2100檢測所提RNA的濃度。合格的mRNA使用帶有OligodT的磁珠富集后用打斷Buffer片段化mRNA。片段化的mRNA經過一系列處理建成環狀RNA文庫，質量檢測合格后進行測序得到raw reads，利用華大過濾軟件SOAPnuke篩選得到clean reads。第一次質控結束后將clean reads利用HISAT對比到參考序列上，讀取比對率和reads在參考基因上的分布情況判斷第二次質控是否合格，如果通過兩次質控則可進行后續分析。基因組測序部分由華大基因DNBSEQ測序平臺完成。

1.2.4 差異基因篩選和分析 經雌二醇處理（4 h、6 h、8 h）以及DMSO處理（Control）的4個樣品表達水平測定完成，以Control為參考分別比較4 h、6 h、8 h雌二醇處理的樣品的差異基因，P＜0.05，|log2Ratio|＞1作為篩選差異基因篩選的條件。對所有顯著差異基因進行GO功能富集、KEGG通路富集分析。

1.2.5 RT-qPCR檢測轉錄組數據可靠性 為了驗證轉錄組數據的可靠性，隨機挑取VGD1、PMEI、CAD5、WRKY70、BBE13等基因進行RT-qPCR檢測。引物設計如表1所示。方法參照1.2.2。

2 結果

2.1 篩選pER8-AtbHLH68轉基因陽性苗

為篩選轉入pER8-AtbHLH68重組載體的陽性植株，將所有待測擬南芥標號并提取葉片基因組DNA，利用PCR法鑒定陽性苗。結果如圖1所示，1-19號泳道所對應的擬南芥均為pER8-AtbHLH68轉基因陽性苗，鑒定為陽性苗的轉基因擬南芥可進行下一步雌二醇誘導。

圖1 PCR法篩選轉基因pER8-AtbHLH68擬南芥陽性苗Fig.1 Screening of transgenic pER8-AtbHLH68 Arabidopsis positive plant by PCR

2.2 雌二醇誘導AtbHLH68表達量檢測

為了檢測雌二醇對AtbHLH68表達水平的影響，RT-qPCR分析雌二醇誘導2 h、4 h、6 h、8 h后pER8-AtbHLH68轉基因擬南芥莖中AtbHLH68的表達量。結果如圖2，10 μmol/L雌二醇處理4 h后莖中AtbHLH68表達量顯著上升，處理8 h后表達量為對照組的29倍。

圖2 RT-qPCR分析不同時長雌二醇處理下AtbHLH68基因表達量Fig.2 Expression level of AtbHLH68 under estradiol treatments at different time points by RT-qPCR

2.3 測序數據的過濾和質控

DMSO溶液處理8 h的擬南芥莖作為對照組和10 μmol/L雌二醇處理4 h、6 h、8 h的擬南芥莖作為實驗組，進行轉錄組測序分析。測序共得到clean date 178.18 M，Q20高于97.78%，Q30高于93.86%，測序質量較高。把每個樣品中reads對比到擬南芥基因組上，Total Mapping值均大于96%，Uniquely Mapping值均大于94%（表2）。

表2 轉錄組測序質控數據Table 2 Quality control data for transcriptome sequencing

2.4 差異基因分析

與對照組相比，雌二醇處理4 h的材料有差異基因4 670個，其中上調基因923個，下調基因3 747個；雌二醇處理6 h的材料有差異基因4 099個，其中上調基因1 325個，下調基因2 774個；雌二醇處理8 h的材料有差異基因2 334個，其中上調基因831個，下調基因1 503個（圖3-A, B, C）。與Control相比，對雌二醇處理4 h、6 h和8 h的差異基因進行Venn圖分析，結果顯示共檢測到差異基因7 186個，其中1 037個差異基因在3個時間點均存在顯著差異表達（圖3-D）。

圖3 4 h、6 h、8 h差異基因數目統計和韋恩圖Fig.3 4 h, 6 h and 8 h DEGs statistical number and Venn diagram

2.5 差異基因GO富集分析

由于10 μmol/L雌二醇處理8 h后AtbHLH68的表達量達到對照組29倍，因此我們對雌二醇誘導8 h產生的差異基因進一步分析。GO功能分類顯示，轉錄組中的差異基因富集在細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物過程（biological process）三大類中，共87種功能。在細胞組分中，主要富集了細胞壁（cell wall）、植物型細胞壁（plant-cell wall）、膜錨定成分（anchorde component of membrane）、胞外區（extracellular regin）、質外體（apoplast）等相關詞條（圖4）。細胞壁是由果膠、纖維素、半纖維素和木質素等物質組成。木葡聚糖是半纖維素的主要組分，編碼木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶的差異基因有9個，其中XTH12、XTH13、XTH14、XTH32基因下調，XTH8、XTH7、XTH15、XTH11基因上調。與木質素合成相關差異基因共有21個，包括PERs基因共9個，其中PER7、PER33、PER36等基因下調，PER3、PER52等基因上調；編碼漆酶的基因LAC17上調，編碼肉桂醇脫氫酶的基因中CAD7下調，CAD5、CAD8基因上調；編碼小檗堿橋酶（berberine bridge enzyme, BBE）基因有8個，包括BBE7、BBE10、BBE11、BBE13、BBE15、BBE17、BBE25、BBE26等基因均上調（表3）。

在分子功能中，差異基因主要富集在果膠酶活性（pectinesterase activity）、果膠酶抑制劑活性（pectinesterase inhibitor activity）、FAD結合活性（FAD banding）、天冬氨酰酯酶活性（aspartl esterase activity）、DNA結合轉錄因子活性的（DNA-banding transcription factor activity）、果膠裂解酶活性等（pectate lyase activity）功能中（圖4）。果膠大量存在于細胞壁，PMEs主要功能是去除果膠的甲酯基，其中PME4、PME25、PME37、PME43、PME48、PME21、PME12等8個基因下調，PME15和PME19基因上調。差異基因中PMEI19、PMEI14、PMEI11等5個PMEIs基因上調，1個PMEI基因下調。去甲酯化的果膠會被果膠裂解酶裂解，其中相關差異共有基因14個，5個基因上調，9個基因下調（表3）。

在生物學過程中，差異基因除了被注釋到細胞壁修飾相關功能外，在防御響應（defense responds）、水楊酸響應（response to salicylic acid）和茉莉酸響應（response to jasmonic acid）相關功能中也大量富集（圖4）。茉莉酸途徑標志基因VSP1以及參與茉莉酸生物合成基因OPCL1下調，受水楊酸以及茉莉酸共同誘導響應的編碼富含甘氨酸的蛋白的基因GRP23也下調。此外還有一些響應茉莉酸和水楊酸途徑的轉錄因子WRKY70、WRKY54、WRKY46表達量下調（表3）。

通過GO功能富集分析顯示，AtbHLH68誘導表達會引起擬南芥莖中一些細胞壁組分合成和修飾相關基因發生改變，包括半纖維素代謝、木質素合成、果膠修飾和代謝等功能，說明AtbHLH68可能通過影響這些基因的表達，從而調控擬南芥細胞壁的發育。

2.6 差異基因KEGG通路分析

為了了解AtbHLH68上調對擬南芥莖發育過程中代謝通路的影響，對雌二醇誘導8 h產生的差異基因進行KEGG通路注釋。分析得出差異基因顯著富集在8條代謝通路中，主要包括戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化（pentose and glucuronate interconversions）、植物病原體互作代謝通路（plant-pathogen interaction）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、角質亞油酸和蠟質的生物合成（cutin, suberine and wax biosynthesis）和苯丙烷生物合成途徑（phenylpropanoid biosynthesis）等（圖5）。

圖5 差異基因KEGG富集氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG enrichment of DGEs

果膠修飾與戊糖和葡萄糖醛酸轉化生物學途徑相關。果膠修飾與代謝經歷了去甲酯化并被降解為多糖片段或者寡糖。PME負責去掉果膠上的甲酯基，PMEI通過翻譯后修飾抑制PME活性。脫甲酯的果膠在PG或是PL的作用下發生水解或裂解作用（圖6-A）。差異基因富集在果膠修飾的代謝通路中，說明AtbHLH68不僅能影響果膠甲酯化修飾程度，還會影響果膠降解，從而參與果膠的修飾與代謝中來。

圖6 生物合成通路圖Fig.6 Biosynthetic pathway map

木質素的合成通過苯丙烷生物合成途徑來完成。產生于莽草酸途徑的苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase, PAL）和肉桂酸4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）作用下形成對-香豆酸，此后由于對香豆酰輔酶A3-羥化酶（pcoumaroyl-CoA3-hydroxylase，C3H）、咖啡酸鄰位甲基轉化酶（caffeicacid O-methyltransferase，COMT）和阿魏酸五羥化酶（ferulate5-hydroxylase，F5H）3種酶在不同位置羥基化或甲基化導致最后形成3種木質素單體結構。在木質素單體合成后期，肉桂醇脫氫酶催化香豆醛，松柏醛和芥子醛形成相應醇從而促進木質素單體合成。木質素單體在過氧化物酶或漆酶的作用下聚合為木質素。從圖中可以看出，差異基因主要富集木質素合成途徑后期，并集中在醛類物質催化形成醇類物質和不同類型木質素單體聚合過程中（圖6-B）。說明AtbHLH68通過參與苯丙烷生物合成途徑，在木質素合成后期發揮作用，可能會影響細胞壁木質素單體的生成與聚合。

以上結果表明AtbHLH68可能在木質素單體合成后期及果膠修飾和降解過程中發揮作用，從而影響細胞壁組分和結構。

2.7 RT-qPCR驗證

利用RT-qPCR對轉錄組結果可靠性進行分析。共檢測6個基因包括：果膠修飾相關基因AT5G62350、AT1G56100和VGD1，激素響應相關基因WRKY70，木質素合成相關基因BBE13和CAD5，結果如圖7，AT5G62350、AT1G56100、BBE13、CAD5表達量上調而VGD1、WRKY70表達量下調，與轉錄組中變化趨勢一致。

圖7 RT-qPCR檢測基因的表達量Fig.7 Detection of genes expressions by RT-qPCR

3 討論

bHLH轉錄因子在植物生長發育、光信號轉導、脅迫響應以及生物合成代謝過程中發揮重要作用［23-26］。本研究通過構建雌二醇誘導表達系統來誘導表達AtbHLH68，利用轉錄組篩選AtbHLH68調控的下游基因，挖掘AtbHLH68在莖發育中潛在的調控網絡。結果顯示AtbHLH68上調導致細胞壁組分和修飾相關的基因表達量發生變化，主要富集在果膠修飾與代謝和木質素合成過程中。

果膠作為細胞壁的重要組分，PME通過影響果膠去甲酯化的模式和程度，從而影響細胞壁強度和彈性。PME是修飾果膠甲酯化的關鍵酶，PMEI與PME通過翻譯后修飾調控PME活性，進而調節果膠甲酯化修飾的穩態［27-28］。轉錄組結果中大多數PME相關基因下調，而PMEI相關基因上調。轉錄因子如何影響果膠修飾相關基因表達從而導致果膠成分改變，有研究顯示AtMYB52可以直接結合并激活PMEI14和PMEI16，PMEI競爭結合PME的活性位點從而抑制PME與底物結合，myb52突變體中PME相關基因上調表達，果膠甲酯化程度顯著降低［29］。在轉錄組數據中，AtbHLH68基因表達水平上調后導致PMEI11、PMEI14以及PMEI19的表達量上調。然而AtbHLH68是否也能通過激活PMEIs從而在果膠修飾和降解過程中起作用值得深入挖掘。

此外，轉錄組分析表明，AtbHLH68表達水平上調導致次生壁組分合成相關基因表達量發生變化，包括XTHs、BBEs、PERs、CADs以及LACs等眾多基因。研究表明木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶在細胞壁重構、松弛細胞壁以及在細胞生長方面起作用［30-31］。BBE通過氧化苯丙烷途徑中的芳香烯丙基醇（如香豆醇、芥子醇）為相應的醛（如香豆醛、芥子醛），影響木質素合成［32］。Fernández-Pérez等［33］報道per52突變體會導致束間纖維木質素含量下降。H2O2能夠激活過氧化物酶并促進木質素聚合，而提前清除H2O2則會使細胞壁中木質素含量降低［34］。AtbHLH68表達量的改變導致木質素合成后期相關基因表達量的改變，因此轉錄因子AtbHLH68對木質素合成的影響有待探究。

轉錄組中還檢測到激素響應、生物和非生物脅迫響應相關差異基因。細胞壁作為植物細胞的保護屏障，細胞壁組分變化可能導致植物防御能力改變［35］。水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）參與生物和非生物脅迫響應［36］。轉錄組分析顯示參與水楊酸和茉莉酸途徑相關基因在AtbHLH68影響下顯著下調，轉錄因子WRKY70在兩個激素通路中都被富集并且大量表達，有研究發現WRKY70影響植物抵抗非生物脅迫的能力，Chen等［37］研究表明wrky70 wrky54 wrky46三突變體擬南芥抵抗干旱的能力增加，這說明WRKY70、WRKY54和WRKY46負調控擬南芥抗干旱作用。AtbHLH68表達量的上調影響激素響應與防御響應相關基因的表達，AtbHLH68是否在響應生物和非生物脅迫方面發揮功能還有待研究。

4 結論

本研究以雌二醇誘導表達AtbHLH68轉基因擬南芥莖為材料進行轉錄組學分析，結果顯示差異基因主要與果膠修飾和代謝、木質素合成以及激素響應相關。說明轉錄因子AtbHLH68可能通過直接或間接調控細胞壁組分合成相關基因的表達，從而影響細胞壁的發育。