利用酵母雙雜交系統篩選水稻中與OsCRK5互作蛋白

王子穎 龍晨潔 范兆宇 張蕾

（武漢大學生命科學學院 雜交水稻國家重點實驗室，武漢 430072）

水稻（Oryza sativa L.）是世界三大糧食作物之一，全球約有40%的人口以稻米作為主要糧食并廣泛種植［1］，因此水稻的產量和糧食安全極為重要。在生長發育過程中，水稻會受到高溫、干旱、鹽脅迫等各種環境因素的影響。其中，干旱脅迫是影響水稻生長最終導致減產的重要環境因素之一［2］。

鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CDPKs）是植物中主要的鈣離子結合蛋白，對于鈣離子信號的感知和解碼具有重要意義［3］。CDPKs在植物中廣泛存在，其中水稻有31個CDPKs家族成員，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有34個，小麥（Triticum aestivum）中存在23個，玉米（Zea mays）中存在40個［4-8］。研究發現，CDPKs參與了植物發育的多個方面，如花粉管和根毛的生長、莖和根的發育、葉片衰老以及代謝等過程。同時，CDPKs還廣泛參與植物生物和非生物脅迫反應［9-12］。

CRK（CDPK-related kinase）是一類在蛋白序列和結構上與CDPKs高度同源的蛋白激酶，廣泛存在于植物中，如水稻、擬南芥、甜瓜（Cucumis melon L.）、毛果楊（Populus trichocarpa）、辣椒（Capsicum annuum）、油菜（Brassica rapa.）以及番茄（Lycopersicon esculentum）等［13-17］。其中，擬南芥中CRK 功能的研究取得了一定的進展。研究發現，AtCRK1能夠顯著提高植株對鹽脅迫和高溫的抵抗能力［18］。Baba等［19］對crk1突變體進行連續光照發現，突變體表現出侏儒癥及萎黃病特征，表明AtCRK1還參與了光調控的植物生長發育過程。AtCRK2通過影響赤霉素受體蛋白（GID1）的穩定性參與調控GA信號［20］。AtCRK3的互作蛋白AtGLN1;1在葉片衰老過程中發揮作用［21］。AtCRK5可以通過磷酸化PIN2調節生長素的運輸，進而參與調控根的向重力性生長［22］。水稻中CRKs的研究相對較少。Yadav 等［23］利用定量PCR和RNA原位雜交技術檢測了水稻CRK基因在不同組織和器官中的表達情況，結果表明CRK家族成員的表達具有組織特異性。

酵母雙雜交系統于1989年首次開發，距今已有30年多的時間，但它依然是鑒定和驗證蛋白質互作的最常見和最直接的方法［24］。該系統最大的優點是待測蛋白在實驗過程中能夠保持天然構象，從而提高了檢測的準確性和靈敏度［25］。這項技術的基本原理是，兩種待測蛋白分別與DNA結合域或轉錄激活域融合表達，當兩個融合蛋白之間發生相互作用時，轉錄激活因子能夠激活報告基因的表達，使酵母可以在缺陷型培養基上繼續生長。通過酵母菌斑的生長狀態可以判斷兩種待測蛋白是否存在相互作用［26］。

實驗室前期研究發現OsCRK5參與了水稻干旱脅迫反應，但是具體的分子機制尚不清楚。本研究通過酵母雙雜交系統篩選OsCRK5的互作蛋白，并通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗進一步驗證蛋白互作的可靠性，為闡明OsCRK5調控水稻抗旱的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：酵母菌Y2H Gold、AH109；大腸桿菌DH5α；農桿菌GV3101。

植物材料：水稻品種為粳稻Hejiang19。

載體：酵母雙雜交系統為美國Clontech公司的Yeast Two-Hybrid System，文庫載體為pGADT7，誘餌載體為pGBKT7，陽性對照載體為pGBKT7-53和pGADT7-T，陰性對照載體為pGBKT7-53和pGADT7-Lam。

水稻cDNA酵母文庫：由武漢大學生命科學學院楊紅春實驗室贈送。

培養基：酵母缺陷培養基購于北京酷來搏科技有限公司。酵母全培養基YPDA和細菌LB培養基所使用的蛋白胨及酵母提取物購于英國OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 干旱處理水稻幼苗 將野生型Hejiang 19和OsCRK5-RNAi轉基因植株的種子滅菌后放置在MS固體培養基上萌發，在30℃恒溫光照培養箱中培養一周。將一周大的水稻幼苗從MS固體培養基上轉移到水培液中繼續在培養箱中培養。待植株生長至20 DAG后，向水培液中加入20% PEG4000模擬干旱環境。對干旱處理后植株表型進行觀察，并在固定時間點取材，提取RNA并反轉為cDNA，以cDNA為模板進行定量PCR分析。

1.2.2 pGBKT7-OsCRK51-444誘餌載體構建和自激活檢測 以cDNA為模板，用引物OsCRK51-444-pGBKT7 FP:5′-CATGGAGGCCGAATTCATGGGGCA GTGTTACGC-3′和OsCRK51-444-pGBKT7 RP:5′-GCA GGTCGACGGATCCGCACTCATCTCGCAACC-3′擴增OsCRK5基因的1-1 332 bp片段，該片段編碼OsCRK5蛋白的1-444氨基酸序列。擴增的片段5′和3′端均與線性化載體pGBKT7的末端同源。利用重組的方法，將擴增的OsCRK5基因片段構建到誘餌載體pGBKT7。

將pGBKT7空載體與pGBKT7-OsCRK51-444誘餌載體分別轉化酵母Y2H Gold感受態細胞，酵母感受態制備與轉化的步驟參考Yeastmaker Yeast Transformation System 2操作手冊。將部分轉化菌液涂布于SD/-Trp+X-α-gal+AbA固體培養基，30℃倒置培養2-3 d，觀察菌斑顏色。另取部分轉化菌液，稀釋后滴加在SD/-Trp和SD/-Trp/-Leu/-His固體培養基上，30℃倒置培養2-3 d，觀察菌斑生長狀態。從菌斑顏色和生長狀態判斷誘餌載體蛋白是否具有自激活能力。

1.2.3 酵母總蛋白的提取和誘餌蛋白表達的檢測 挑取多個含有誘餌載體的單克隆菌斑進行培養，然后分別提取酵母總蛋白，使用Western blot方法檢測誘餌蛋白的表達。用Myc抗體（小鼠單克隆抗體）作為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，使用HRP-DAB顯色試劑盒進行顯色。

1.2.4 酵母cDNA文庫篩選互作蛋白 根據Western blot的實驗結果，選擇誘餌蛋白表達量最高的酵母菌株進行后續實驗。參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作手冊，將1 mL水稻cDNA酵母文庫與含有誘餌載體pGBKT7-OsCRK51-444的酵母感受態細胞混合，培養16 h，將菌液均勻涂布到SD/-Trp/-Leu/-His三缺固體培養基上。30℃倒置培養5 d。挑取陽性菌斑，接種到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade+X-α-gal+AbA四缺固體培養基上，30℃倒置培養3 d。長出陽性菌斑的固體培養基在4℃保存備用。

1.2.5 酵母質粒提取和鑒定 將四缺固體培養基上的陽性菌斑接種到液體培養基中進行培養，然后提取質粒。以質粒為模板，用pGADT7載體上的特異鑒定引物（FP：5′-CGATGATGAAGATACCCCAC-3′；RP：5′-GAAATTGAGATGGTGCACG-3′）進行PCR擴增，將PCR產物送擎科生物公司測序。利用NCBI網站上的Blastn功能對測序結果進行比對分析。

1.2.6 酵母雙雜交驗證蛋白互作 以水稻cDNA為模板，分別用特異引物pGADT7-OsDi19-1 FP：5′-CG GGATCCATCGAGTGATGGACTCGGAGCACTGGAT-3′和pGADT7-OsDi19-1 RP：5′-ACGATTCATCTGCAG ATCTCCAAATAAAGTAGTGAGCAGC-3′、pGADT7-OsWR1 FP：5′-ACGGGATCCATCGAGTGATGGTACA GCCAAAGAAGAA-3′和pGADT7-OsWR1 RP：5′-AC GATTCATCTGCAGTCAGATGACAAAGCTACCCT-3′進行片段擴增，將擴增后的OsDi19-1和OsWR1 CDS全長序列分別構建到pGADT7載體中。將pGADT7-OsDi19-1和pGBKT7-OsCRK5、pGADT7-OsWR1和pGBKT7-OsCRK5轉化酵母細胞。轉化后的菌液稀釋不同倍數后滴加到二缺、三缺和四缺固體培養基上，觀察菌斑生長狀況。pGADT7-T和pGBKT7-53質粒共同轉化的酵母菌作為陽性對照，pGADT7-T和pGBKT7-Lam質粒共同轉化的酵母菌作為陰性對照。

1.2.7 熒光雙分子互補實驗（BiFC）驗證蛋白互作 利用同源重組的方法，將OsDi19-1的CDS全長構建到pSPYNE-35S載體中。擴增OsDi19-1 CDS序列使用的引物序列為：pSPYCE-35S-OsDi19-1 FP：5′-ACTGTCGACCTCGAGATGGACTCGGAGCACTGG AT-3′和pSPYCE-35S-OsDi19-1 RP：5′-CATCCCGG GAGCATCTCCAAATAAAGTAGTGAGCAGC-3′。使用同樣的方法將OsWR1的CDS全長構建到pSPYNE-35S載體中。擴增OsWR1 CDS目的片段使用的引物序列為：pSPYCE-35S-OsWR1 FP：5′-AACACGGG GGACATGGTACAGCCAAAGAAGAA-3′和pSPYCE-35S-OsWR1 RP：5′-AGCCCGGTTAACGATGACA AAGCTACCCT-3′。同時將CRK51-626片段構建到pSPYCE-35S載體中。使用的引物序列為pSPYNE-35S-OsCRK51-626FP：5′-ACTGTCGACCTCGAGGG TACCATGGGGCAGTGTTACGC-3′和pSPYNE-35SOsCRK51-626RP：5′-CATCCCGGGAGCGGTACCCCGC CTCGCGTTGCTA-3′。

pSPYNE-35S-OsCRK51-626、pSPYCE-35S-OsWR1和pSPYCE-35S-OsDi19-1分別轉化到農桿菌GV3101中。將攜帶pSPYNE-35S-OsCRK51-626和pSPYCE-35S-OsWR1（或者pSPYNE-35S-OsCRK51-626和pSPYCE-35S-OsDi19-1）的農桿菌菌液混合后注射到小葉煙草葉片中，避光培養12-16 h，然后在光照條件下繼續培養1-2 d。激光共聚焦顯微鏡下觀察實驗結果。

2 結果

2.1 OsCRK5-RNAi轉基因植株具有干旱敏感表型

20% PEG處理水稻幼苗30 min后，OsCRK5基因在野生型水稻葉片中的表達水平明顯上升（圖1-A）。相比于野生型水稻，此時OsCRK5-RNAi轉基因植株的葉片失水明顯，卷曲嚴重（圖1-B, C）。同時，干旱誘導表達的基因OsLEA3和OsDREB2A在OsCRK5-RNAi轉基因植株中上升程度明顯低于野生型（圖1-D）。上述結果表明OsCRK5在水稻的干旱脅迫調控中發揮重要作用。

2.2 pGBKT7-CRK51-444誘餌載體的自激活測試

攜帶pGBKT7-CRK51-444質粒的酵母菌斑在SD/-Trp+X-α-gal培養基上正常生長且不變藍（圖2-A）。同時，含有pGBKT7-CRK51-444誘餌載體的酵母菌斑與含有pGBKT7空載體的陰性對照在三缺固體培養基上均不能正常生長（圖2-B）。上述結果說明pGBKT7-CRK51-444在Y2H Gold菌株中不存在自激活活性，可以作為誘餌載體進行后續的文庫篩選。

圖2 pGBKT7-OsCRK51-444質粒在酵母細胞中的自激活檢測Fig.2 Detection of self-activation of plasmid pGBKT7-OsCRK51-444 in yeast cells

2.3 酵母全蛋白提取和誘餌蛋白的表達檢測

Western blot方法檢測帶有Myc標簽的誘餌蛋白的表達情況。結果如圖3所示，2號菌斑中OsCRK5蛋白的表達量最高，因此選擇2號菌落進行后續文庫篩選實驗。

2.4 CRK5互作蛋白的初步篩選

將誘餌蛋白表達量最高的酵母菌株（2號菌）與酵母文庫菌株混合交配完成后在顯微鏡下進行檢查。40×視野下出現約10個酵母合子，表明酵母交配已大部分完成（圖4-A）。交配完成后的酵母菌液在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade+X-α-gal+AbA培養基上生長，其中的陽性菌斑呈現藍色（圖4-B）。本次篩選共得到77個陽性結果。

圖4 篩選獲得的部分陽性克隆Fig.4 Partial positive clones from screened

提取陽性菌株中的質粒，送擎科生物公司完成測序。經過序列分析和比對，篩選得到的部分基因和注釋結果如表1所示。依照蛋白功能對這些基因編碼的蛋白質進行分類，分類結果展示如圖5。其中有5%的蛋白質參與能量代謝過程，5%參與細胞代謝過程，5%與細胞結構相關，21%與轉錄相關，21%參與蛋白質的降解和貯存，11%參與細胞生長和分裂，32%參與蛋白質的合成過程。

表1 酵母文庫篩選部分互作蛋白信息Table 1 Information of part interacting proteins screened by yeast library

圖5 篩選基因的功能分類Fig.5 Functional classification of screening genes

2.5 酵母雙雜交驗證OsCRK5與OsWR1和OsDi19-1的相互作用

利用酵母雙雜交實驗再次驗證了OsWR1和OsDi19-1與OsCRK5之間的相互作用。結果如圖6所示，pGADT7-OsDi19-1和 pGBKT7-CRK51-444以及pGADT7-OsWR1和pGBKT7-CRK51-444共轉化的酵母菌株均能在四缺固體培養基上正常生長，說明OsDi19-1和OsWR1與OsCRK5在酵母中相互作用。

圖6 酵母雙雜交驗證OsCRK5與OsDi19-1和OsWR1的互作Fig.6 Yeast two-hybrid confirmed the interaction between OsCRK5 and OsDi19-1 or OsWR1

2.6 熒光雙分子實驗驗證蛋白互作

同時利用雙分子熒光互補實驗在小葉煙草的葉片表皮細胞中驗證了OsCRK5與OsWR1和OsDi19-1之間的相互作用。激光共聚焦觀察結果顯示，OsCRK5與OsDi19-1和OsWR1在植物細胞中存在相互作用（圖7）。

圖7 BiFC驗證OsCRK5與OsDi19-1和OsWR1的互作Fig.7 BiFC confirmed the interaction between OsCRK5 and OsDi19-1 or OsWR1

3 討論

OsCRK5在水稻生長發育和脅迫應答反應中的調控機制尚未研究清楚。本研究發現OsCRK5-RNAi植株具有干旱敏感的表型。利用酵母雙雜交系統篩選獲得了與OsCRK5互作的部分蛋白，并利用酵母雙雜交和BiFC實驗再次驗證了OsDi19-1和OsWR1與OsCRK5的互作。其中鋅指蛋白Di19-1是水稻中的干旱誘導蛋白，在調節多種應激反應中發揮重要作用［46］。Su等［47］使用RT-qPCR在高溫條件下驗證了OsDi19-1基因的表達量發生了變化。擬南芥Di19可以調節PR1、PR2和PR5基因的表達參與干旱脅迫反應［48］。AtDi19-3促進植株抗旱和抗鹽，其缺失突變體植株的根長相比于野生型較長，葉綠素和脯氨酸的含量降低［49］。另有文獻報道，棉花中Di19-1/-2（GhDi19-1/-2）蛋白可以在體外被CDPK磷酸化，并且GhDi19-1/-2可能作為ABA信號通路中CDPK的下游靶蛋白發揮作用［50］。氣相色譜結果表明，OsWR1可以通過調控下游基因改變長鏈脂肪酸和烷烴來調節蠟質合成［45］。Wang等［45］研究表明OsWR1可受ABA、干旱脅迫和鹽脅迫的誘導，且過量表達OsWR1可增強蠟/角質合成相關基因的表達，使蠟質合成增加，增強植物的耐旱性。有研究報道OsWR1的同家族蛋白OsWR2可以招募組蛋白脫乙酰酶OsHDA704，并共同參與ABA信號以及蠟質的生物合成等途徑［51］。

本實驗成功構建了CRK5的酵母雙雜交誘餌載體，并將其轉化Y2H Gold酵母菌。由于某些蛋白自身能夠結合轉錄激活因子從而直接激活報告基因的表達，本實驗驗證了誘餌蛋白OsCRK5的不存在自激活活性，且誘餌蛋白對酵母菌Y2H Gold無毒性作用。本實驗構建的pGBKT7-OsCRK5誘餌載體滿足檢測蛋白質相互作用的前提條件，可利用水稻cDNA文庫進行酵母雙雜交篩庫實驗。酵母雙雜交實驗是篩選和鑒定互作蛋白的常用方法，但是其缺點是具有較高的假陽性［52］。本實驗經過兩次篩選降低了假陽性，并且通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗再次驗證了OsCRK5與OsDi9-1和OsWR1存在相互作用。接下來需要進一步研究OsCRK5是如何通過互作蛋白Di19-1和WR1參與調節水稻干旱脅迫反應，進而揭示OsCRK5在水稻逆境脅迫中的分子調控機制。本研究結果為進一步研究OsCRK5的生物學功能提供了研究思路，同時為水稻抗旱的遺傳改良奠定分子基礎。

4 結論

利用水稻cDNA文庫，篩選獲得了OsCRK5的77個互作候選蛋白。從篩選得到的互作候選蛋白中選取與水稻抗旱相關的兩個蛋白OsWR1和OsDi19-1，通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗進一步驗證OsWR1和OsDi19-1與OsCRK5在酵母細胞和植物細胞中均存在互作關系。