水稻幼苗酵母單雜文庫構建及LAZY1上游調控因子篩選

黃小龍 孫貴連 馬丹丹 閆慧清

（1.貴州師范大學生命科學學院，貴陽 550025；2.貴州省植物生理與發育調控重點實驗室，貴陽 550025；3.西南喀斯特山地生物多樣性保護國家林業和草業局重點實驗室，貴陽 550025）

在悠久的人工選擇馴化過程中，水稻（Oryza Sativa L.）的株型生長習性由野生稻的散生生長到如今栽培稻的直立生長，分蘗角的改變大大提高了產量，使水稻成為了一種重要的糧食作物［1］。LAZY1是最早發現的控制水稻分蘗角的基因［2］。水稻lazy突變體已廣泛研究了數十年，現更名為lazy1［3-5］。當水稻地上部分完全喪失向重性響應后，植株表型為散生或匍匐生長，人們形象地將控制這種表型的基因命名為“LAZY”。水稻lazy1突變體的地上部向重性喪失，植株表現為散生生長，分蘗角大于50°，細胞學結果顯示其胚芽鞘和葉鞘中有正常淀粉體，但生長素的不對稱分布受損，進一步研究表明LAZY1通過調控地上部分莖中生長素橫向的極性運輸，從而抑制植物的向重性響應［6］。LAZY1在不同的植物中功能保守，在大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、短柄草（Brachypodium distachyon）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等植物中均鑒定到了LAZY1的同源基因［7-12］。

水稻LAZY1在胚芽、未伸長莖維管束的外周細胞、葉鞘枕部及莖鞘維管束內側細胞中特異表達［8］。這種表達方式受LAZY1啟動子上的特定順式元件和相應的轉錄因子的共同調控［13］。在玉米ZmLAZY1啟動子中共鑒定得到4個生長素響應元件和14個光響應元件，生長素和黑暗處理均可誘導玉米ZmLAZY1的表達［12］。水稻LAZY1在黑暗處理下的表達也明顯高于光照處理下的表達［2］。目前對于調控LAZY1基因的上游轉錄因子知之甚少，前期研究僅發現水稻中轉錄因子熱激蛋白OsHSFA2D是LAZY1的上游調控因子［13］，因此對于LAZY1的表達調控仍然是個謎。

本研究通過構建水稻萌發3 d的酵母單雜交文庫，以LAZY1啟動子為誘餌對該酵母單雜交文庫進行篩選，結合雙熒光素酶實驗驗證，得到了結合LAZY1啟動子并正調控LAZY1表達的轉錄因子OsMBF1，為進一步揭示LAZY1的表達調控網絡提供了理論基礎，有助于揭示水稻由散生變為直立生長的奧秘。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 酵母菌株AH109和Y187保存于本實驗室。將酵母菌株劃線接種于YPDA固體培養基，30℃，250 r/min恒溫搖床培養4-7 d后待用。水稻種子置于MS培養基中無菌培養。

1.1.2 試劑 Library Construction Screening試劑盒（Clontech, Cat.No.630490）, TRIzol Reagent（Invitrogen,Cat.No.15596-018）, Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒（Promega, Cat.No.E1910），SMART試劑盒（Clontech, Cat.No.634925），NucleoSpin RNA試劑盒（MNG, Cat.No.740955.50），Mate &PlateTM試劑盒（Clontech, Cat.No.630490），酵母質粒DNA提取試劑盒（TIGEN, Cat.No.DP112）。載體pMD19-T、大腸桿菌DH5α感受態細胞、T4連接酶、EcoR I和Mlu I等酶均購自TaKaRa公司。引物合成及測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 水稻LAZY1基因啟動子的克隆及序列分析 通過RAPDB（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/tools/dump）數據庫獲得LAZY1基因轉錄起始位點上游1 000 bp序列。以日本晴（Oryza sativa L.ssp japonica cv Nipponbare）的DNA為模板，以LAZY1-F和LAZY1-R引物（表1）進行PCR擴增，擴增產物經電泳、切膠回收后連接至pMD19-T載體。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于含50 mg/L氨芐的固體LB培養基，37℃過夜培養，挑取單克隆，選取PCR驗證為陽性的單克隆菌株送上海生物工程有限公司進行測序。利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線數據庫對LAZY1啟動子上的順式作用元件進行分析。

表1 本實驗中所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 誘餌載體pHIS2-LAZY1的構建及轉化 將LAZY1啟動子片段和pHIS2載體分別用EcoR I和Mlu I進行雙酶切，酶切產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后回收，純化然后用T4連接酶連接。按上述T載克隆方法獲得陽性重組克隆，將重組質粒送上海生物工程技術公司測序，獲得pHIS2-LAZY1誘餌載體。以LiAc熱激轉化法將誘餌載體pHIS2-LAZY1轉化進入AH109酵母菌株［14］，轉化后的酵母菌株涂布于SD/-Trp培養基，30℃倒置培養3 d，通過菌落PCR篩選得到pHIS2-LAZY1誘餌菌株。

1.2.3 誘餌載體的自激活檢測 分別將pHIS2-LAZY1誘餌表達載體轉入酵母菌株AH109，pGADT7空載體入酵母菌株Y187，按照Mate&PlateTM試劑盒，30℃，30-40 r/min接合約20 h后收集菌體，涂布于氨基酸營養缺陷型SD/-His/-Leu/-Trp/（SD-LTH）的固體培養基上。如果在上述缺陷型SD-LTH平板的固體培養基上生長，在篩庫時需加入組氨酸抑制劑3-氨基-1,2,4-三唑（3-Amino-l, 2, 4-triazole, 3-AT）以抑制組氨酸His泄露。因此，分別在培養基中加入0、20和40 mmol/L的3-AT觀察接合菌的生長，以確定最適合的3-AT濃度。同時分別以pHIS2-p53+AD53、pHIS2+AD53和pHIS2+AD作為陽性對照、陰性對照和空白對照。

1.2.4 cDNA文庫的構建和轉化 利用Trizol抽提日本晴萌發3 d幼苗的總RNA，經NucleoSpin RNA試劑盒分離獲得mRNA，接著使用SMART試劑盒反轉錄合成First-Strand cDNA后，經LD-PCR得到雙鏈cDNA，使用CHROMA SPINTMTE-400 Column純化后得到雙鏈cDNA文庫，接著同樣利用LiAc熱激轉化法將5 μg的cDNA文庫和3 μg的pGADT7-Rec載體共轉化入酵母菌株Y187，將上述懸浮酵母細胞液（預留50 μL用于檢測酵母庫容和重組率）涂布SD-Leu平板培養3-5 d后, 4℃放置3-4 h，以文庫保存培養基收集酵母菌落，重懸離心，加入200 mL文庫保存培養基重懸，1.5 mL離心管分裝，每管1 mL，得到酵母單雜文庫菌，-70℃保存。同時共轉化pGADT7-Rec和SV40大T PCR片段作為陽性對照，單獨轉化pGADT7-Rec空載體作為陰性對照，將上述預留的50 μL酵母懸浮液分別稀釋到1∶10和1∶100，取100 μL后分別涂到SD-Leu培養基平板上，培養3-5 d后，選取適合稀釋濃度的平板，計算文庫篩選克隆數，文庫篩選克隆數=培養基（CFU/mL）×稀釋倍數×重懸體積。

1.2.5 酵母單雜交文庫篩選 挑取含有pHIS2-LAZY1誘餌菌株單克隆至50 mL YPDA液體培養基，30℃，250 r/min恒溫搖床培養至OD值至0.8，700×g離心5 min后收集菌體，將50 mL pHIS2-LAZY1誘餌菌和1 mL的酵母單雜文庫菌混合后加入到100 mL 2×YPDA培養基中，30-50 r/min，30℃，接合約20 h，完成酵母單雜篩庫。取100 mL接合菌液分至2個50 mL離心管中，1 000 ×g室溫離心10 min，棄上清液。然后再加入2×YPDA洗酵母細胞，1 000×g室溫離心10 min，棄上清液。用滅菌水清洗酵母細胞后，兩管合并，1 000 ×g室溫離心10 min，棄上清液。加入約15 mL滅菌超純水重懸酵母細胞，取100 μL涂布于SD-LTH/40 mmol/L 3-AT培養基平板，30℃倒置培養4-6 d。

1.2.6 陽性克隆的檢測和質粒提取 挑取上述SDLTH/40 mmol/L 3-AT培養基上的接合菌的單克隆，以T7和AD引物（表1）進行菌液PCR，電泳檢測得到的陽性接合菌株，以酵母質粒DNA提取試劑盒提取質粒，將質粒送至上海生物工程有限公司測序。測序結果在水稻的全基因組數據庫進行blast比對，篩選得到LAZY1候選上游因子的基因ID和CDS全長序列。

1.2.7 酵母單雜驗證 將LAZY1基因的啟動子序列經Sac I和Sma I酶切后，與經相同酶切的pAbAi載體連接，構建pBait-AbAi誘餌載體。經BstB I酶切后線性化，轉化Y1HGold后，轉化產物在SD/-Ura的缺陷培養基上生長。轉化成功的酵母克隆即為誘餌酵母，這些克隆中包含穩定的pBait-AbAi，可用來篩選蛋白與基因之間的互作。從SD/-Ura培養皿上挑取誘餌酵母菌株，用100 μL 0.9%的NaCl懸浮菌體，調OD600至0.002，取100 μL懸浮菌液分別涂在對照［不含金擔子素 A（aureobasidin A, AbA）］和含500 ng/mL AbA的SD/-Ura固體培養基上，30℃倒置培養3 d。將含有LAZY1啟動子的pAbAi誘餌載體菌株制備成誘餌酵母感受態，再將經BamH I和Sac I雙酶切構建后的pGADT7-OsMBF1質粒轉化到誘餌酵母感受態中涂布于SD/-Ura/AbA平板上，30℃恒溫培養3-5 d。

1.2.8 雙熒光素酶檢測 PCR擴增得到OsMBF1的CDS序列，通過重組方法將CDS連到‘None’載體得到none-OsMBF1效應載體。同時，將1 000 bp的LAZY1啟動子克隆到190LUC載體，得到190LUCLAZY1報告載體，引物見表1。然后，通過PEG轉化將none-OsMBF1效應載體和190LUC-LAZY1報告載體共轉化到水稻原生質體中［15］，以空載體none和190LUC-LAZY1作為陰性對照。最后，使用Dualluciferase Reporter Assay System試劑盒和Infinite200 Pro microplate reader（Tecan）儀器檢測fLUC/rLUC比值，進行3次生物學重復，每次重復測量3次。數據通過統計處理軟件SPSS（version 20.0）處理，采用單因素方差進行差異顯著性分析，P-value ＜ 0.05*表示差異顯著，P-value ＜ 0.01 **表示差異極顯著。

2 結果

2.1 LAZY1啟動子的克隆及順式元件分析

以日本晴葉片基因組DNA為模板，克隆得到LAZY1啟動子的片段，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示產物大小與目標長度1 000 bp一致（圖1-A）。測序所擴增LAZY1啟動子片段的結果如圖1-B所示，與水稻預期的LAZY1啟動子序列一致，表明LAZY1啟動子序列克隆成功。

為了分析LAZY1啟動子所含有的順式元件，利用PlantCARE數據庫對LAZY1啟動子進行順式元件的分析，結果顯示LAZY1啟動子除了含有CAAT-box和TATA-box等基本啟動子元件外，還含有光響應元件、植物激素響應元件和其它響應元件，其中光響應元件有ATCT-motif、Box 4、TCCC-motif、GATA-motif、G-box等元件，植物激素響應元件有脫落酸響應的ABRE元件、生長素響應的TGA-element元件以及茉莉酸甲酯響應的CGTCA、TGACG-motif等元件，其他元件包括抗旱響應的MBS及3個功能未知的作用元件（表2）。

2.2 pHIS2-LAZY1誘餌菌株的獲得和自激活檢測

為了得到pHIS2-LAZY1誘餌菌株，將構建的pHIS2-LAZY1誘餌載體轉化酵母AH109，挑選單克隆進行PCR陽性鑒定，檢測結果顯示PCR片段長度為1 kb，與目標大小一致（圖2-A），說明誘餌載體成功轉入酵母細胞得到pHIS2-LAZY1誘餌菌株。

圖2 陽性pHIS2-LAZY1誘餌菌株的鑒定及最低3-AT抑菌濃度的確定Fig.2 Identification of positive pHIS2-LAZY1 transformed bait-yeast strains and the determination of minimum inhibitory concentration of 3-AT

由于內源性酵母的轉錄因子可能導致組氨酸泄漏，因此需要加入3-AT來抑制這種泄露，在氨基酸營養缺陷型培養基SD-LTH中分別加入0、20和40 mmol/L的3-AT，通過觀察酵母生長情況以確定最適的3-AT抑制濃度。結果表明當3-AT濃度為0和20 mmol/L時，檢測組（pHIS2-LAZY1+AD）和陰性對照（pHIS2+AD53）一樣都會生長。當將3-AT濃度升高至40 mmol/L時，檢測組和陰性對照中酵母細胞的生長完全受到抑制，而陽性對照則正常生長。結果說明pHIS2-LAZY1在酵母AH109中不會發生自激活，因此，40 mmol/L 3-AT可作為最低抑菌濃度進行酵母單雜文庫篩選。

2.3 酵母單雜文庫的構建

提取日本晴萌發3 d后的幼苗RNA，電泳檢測結果顯示有完整的3條目的條帶，其中28S和18S條帶亮度明顯（圖3-A），表明RNA質量較好。通過SMART技術擴增合成雙鏈cDNA，純化電泳結果顯示條帶分散且分布均勻，純化后的cDNA片段大小在400-3 000 bp之間（圖3-B），說明所獲得的cDNA文庫中各基因的表達量均為平均水平，可用于后續反應。

將上述cDNA文庫與pGADT7-rec載體共轉化酵母菌株Y187，得到酵母單雜文庫菌。分別將稀釋后10倍（圖3-C）和100倍（圖3-D）的酵母細胞在YPDA平板上生長，根據菌斑生長情況使用1/100平板進行計數，cDNA文庫共轉的菌斑個數為370，即庫容為370×1 000×30=1.11×107CFU/mL，大于1×106CFU/mL的庫容要求。同時SV40大T PCR共轉的菌斑個數為148，空載體轉化的菌斑個數為11，由此可見cDNA文庫共轉的克隆數是空載體的10倍以上，即超過90%的克隆都包含同源重組后的pGADT7質粒。使用T7和AD引物進行菌落PCR，電泳檢測結果顯示酵母文庫菌中cDNA插入片段范圍為500-3 000 bp（圖3-E），上述結果表明成功獲得了可用于后續LAZY1上游調控因子篩選的酵母單雜文庫菌。

2.4 酵母單雜文庫篩選LAZY1的上游調控因子

為了得到與LAZY1啟動子作用的上游調控因子，通過pHIS2-LAZY1誘餌菌與酵母單雜文庫菌接合完成酵母單雜文庫篩選，離心收集酵母接合菌后涂布于缺陷型SD-LTH/40 mmol/L 3-AT的平板上，培養4 d后，發現平板上有酵母接合菌落，說明酵母單雜文庫菌中有獵物蛋白與pHIS2-LAZY1誘餌菌上的LAZY1啟動子結合。挑取結合菌落的單克隆進行PCR檢測，選取擴增條帶明亮、片段長度大于500 bp的PCR產物進行測序，通過Blast比對后去除重復結果，最終得到21個LAZY1的上游調控因子，通過功能注釋和文獻得到這21個基因的信息，這些上游調控因子包含了1個轉錄因子Os08g27850、2個激素相關蛋白Os11g44810和OsGLN2、1個細胞色素蛋白OsCYP20-2、1個幾丁質家族蛋白Os04g41620、8個與蛋白質合成和代謝的相關蛋白（Os02g55140、Os02g1531、Os04g20990、Os03g59310、Os12g08260、Os03g59320、Os04g53620、Os01g69950）以及8個參與糖脂類和能量代謝的相關蛋白（Os11g07020、Os01g54940、OsRBCS4、Os07g05360、Os01g05670、Os08g33820、Os01g41710、Os12g07210）（表3）。轉錄因子Os08g27850，屬于擬南芥中AtMBF1同源基因，故命名為OsMBF1。

2.5 OsMBF1正調控LAZY1的轉錄

轉錄因子往往直接調控下游基因的表達，為了檢測轉錄因子OsMBF1是否調控LAZY1的轉錄活性，采用酵母單雜和雙熒光素酶檢測方法檢測OsMBF1對LAZY1轉錄活性的影響。圖4顯示在含500 ng/mL AbA的SD/-Ura固體培養基上酵母菌不能生長，設定抑制誘餌酵母生長的AbA濃度為500 ng/mL。通過pAbAi酵母單雜體系檢測發現OsMBF1可以與LAZY1啟動子產生酵母，表明兩者能夠在體外進行互作。

將none-OsMBF1效應載體和和190LUC-LAZY1報告載體通過PEG轉化法瞬時轉入水稻原生質體，以空載體none和190LUC-LAZY1作為陰性對照，以fLUC/rLUC的比值代表LAZY1啟動子的相對轉錄活性。測量結果顯示，與對照相比，當加入轉錄因子OsMBF1時，LAZY1啟動子的相對轉錄活性顯著增加（圖4），說明OsMBF1在煙草體內能夠促進LAZY1的表達，是LAZY1的正調控因子。

3 討論

水稻LAZY1在幼苗的葉鞘維管束內側細胞和未伸長莖維管束的外周細胞中特異表達［8］，從而快速響應答生長素信號并調控生長素的橫向運輸［4］。同時，LAZY1在光、暗不同處理條件下的表達也明顯不同，暗處理水稻幼苗可顯著提高其表達［2］。通過對LAZY1啟動子序列的順式元件分析發現它含有生長素響應元件TGA-element和多個光響應元件，由此可見，LAZY1的這種特異表達正是通過啟動子上的這些生長素響應元件和多個光響應元件對生長素和不同的光暗進行響應。

本研究通過酵母單雜篩庫策略共獲得了21個與LAZY1啟動子結合的蛋白，除了轉錄因子和激素響應蛋白外，還包含有8個蛋白質合成和代謝相關基因。這與近年研究表明核糖體蛋白不僅能參與蛋白質的合成，還可直接或間接調控基因轉錄的結論相一致［19］。而一些具有特定結構的RNA識別基序的蛋白可以與DNA結合［19］，如煙草中的剪接因子CFM3可調控煙草NIA1基因的轉錄［20］。在本研究中也篩選得到了一個富含絲氨酸/精氨酸的SC35-類剪接因子SCL30（Os02g15310），是一種定位于細胞核中能夠識別RNA motif的蛋白質［21］。

轉錄因子可以直接或間接結合到下游目的基因的啟動子上，從而調控目的基因的轉錄活性。本研究通過酵母單雜篩庫得到了1個轉錄因子OsMBF1，雙熒光素酶檢測結果證明OsMBF1能夠結合到LAZY1啟動子上并促進LAZY1的表達，是LAZY1的正調控基因。擬南芥MBF1的C端是保守的含有50-60個氨基酸所組成的轉角-螺旋-轉角（helixturn-helix）結構域，能夠直接結合CTAGA的順式作用因子［22］。其中，在LAZY1啟動子的1 000 bp序列中含有2個CTAGA順式作用元件，推測其也有可能通過結合LAZY1啟動子的CTAGA元件從而調控表達。此外，MBF1也是一種轉錄共激活因子，能夠連接轉錄因子和TATA-box結合蛋白直接調控下游目的基因的表達，在進化上高度保守［23］。MBF1可以通過對生長素等激素的響應，參與調控植物的生長發育，包括花器官和種子的發育，從而提高產量［24］。而LAZY1作為生長素快速應答和橫向運輸調控途徑的關鍵基因，OsMBF1可能參與了LAZY1介導的生長素響應和運輸途徑。前期報道發現熱激蛋白OsHSFA2D是水稻LAZY1的上游調控基因，當OsHSFA2D發生突變后將導致LAZY1的表達下降，植株分蘗角增大［13］，但目前未發現OsHSFA2D可以直接結合LAZY1的啟動子。在擬南芥、小麥（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）、苔蘚（Polytrichastrum alpinum）甚至低等植物紅藻中發現，MBF1能夠增強植物對非生物應激脅迫的反應，特別是在熱應激反應中的反應，熱脅迫處理將會導致MBF1的表達量增加［25-26］。在水稻中異源過表達小麥TaMBF1能夠促進植株對熱脅迫的能力［27］，推測MBF1與熱激蛋白可能存在潛在聯系，但是還需要進一步實驗證明。

4 結論

本研究通過酵母單雜交篩庫和雙熒光素酶的體內轉錄活性實驗得到了水稻散生基因LAZY1的正調控轉錄因子OsMBF1，有助于揭示LAZY1的轉錄調控機制。