小麥葉銹菌與小麥互作的酵母雙雜交cDNA文庫構建與應用

溫曉蕾 李建嫄 李娜 張娜 楊文香

（1.河北農業大學植物保護學院植物病理學系 河北省農作物病蟲害生物防治技術創新中心 國家北方山區農業工程技術研究中心，保定 071001；2.河北科技師范學院農學與生物科技學院 河北省作物逆境生物學重點實驗室，秦皇島 066000；3.邢臺學院生物科學與工程學院，邢臺 054000；4.河北省植保植檢總站，石家莊 050000）

由小麥葉銹菌（Puccinia triticina Eriks.）引起的葉銹病是世界范圍內最重要的小麥（Triticum aestivum）病害之一，威脅著全球的糧食安全［1］。全球每年因葉銹病造成10%-50%的產量損失［2-3］。在中國每年有超1 500萬hm2的小麥受到葉銹病影響［2］，一般可造成10%-40%的產量損失［4］。小麥葉銹菌為專性寄生真菌，依靠吸器在活體組織中攝取養分并分泌大量的效應蛋白［5-7］，作用于寄主細胞的不同位點，并與蛋白質、DNA等分子相互作用，通過調節它們的位置、穩定性和功能來干擾寄主植物的免疫反應，促進病原菌的侵染［8-11］。因此，明確效應蛋白的作用機制，是揭示病原菌致病機制的關鍵。

病原菌效應蛋白的互作寄主靶標是研究病原菌效應蛋白和寄主互作的關鍵。關于病原菌的效應蛋白已經在多種植物病原菌中取得了顯著的進展［12-16］。銹病中以亞麻柵銹菌（Melampsora Lini）、松楊柵銹菌（Melamposora larici-populina）、菜豆銹病菌（Uromyces appendiculatus）、小麥稈銹菌（Puccinia graminis f.sp.tritici）和小麥條銹菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）報道較多。大量研究表明銹菌效應蛋白與寄主互作存在復雜的網絡，效應蛋白可以通過作用于腺嘌呤激酶［17］、NPR1［18］、加工小體（P-bodies）［19］、TaLOL2［20］、TaNUDX23［21］、小麥的葉綠體［22］、RNA［23］、TaCZSOD2［24］等靶標影響寄主的抗病性。目前研究較為全面的是小麥稈銹菌的AvrSr35及AvrSr50，它們直接被小麥抗稈銹病基因Sr35和Sr50識別［25-26］，其中AvrSr35作用于Sr35的NBS結構，通過與N端的識別激發Sr35的抗病反應［27］。而小麥葉銹菌效應蛋白的研究較為滯后，目前僅處于發現效應蛋白參與抗病相關反應階段。Segovia等［28］發現小麥葉銹菌分泌蛋白Pt3和Pt27，誘導了小麥近等基因系Lr9、Lr24和Lr26中β-glucoronidase表達量降低，推測這兩個效應蛋白參與了近等基因系TcLr9、TcLr24和TcLr26的抗葉銹作用。齊悅等［29］發現Pt18906能激發TcLr27+31的雙層防御反應，Pt13024在小麥TcLr30上表現出無毒作用［30］，Pt2567對Lr28表現無毒效應［31］。Bi等［32］發現小麥條銹菌與葉銹菌中的PNPi（puccinianon-expresser of pathogenes is- related genes 1（NPR1）interactor）可以在質外體中靶向小麥病程相關蛋白TaPR1a的C端，從而抑制植物免疫。目前尚無葉銹菌效應蛋白互作靶標相關研究。

本研究利用轉錄組分析10個不同毒力的小麥葉銹菌的表達，篩選到來自吸器的635個效應蛋白。其中小麥葉銹菌效應蛋白Pt34084在葉銹菌侵染前期、中期高表達，并且可以抑制由Bax誘導的PCD，推測其可能與葉銹菌致病性存在相關性［33］。為了解析葉銹菌與寄主植物的互作機制，構建了小麥葉銹菌侵染小麥的cDNA酵母文庫，并以Pt34084為誘餌載體進行互作靶標的篩選，旨在通過靶標的鑒定來揭示寄主與病原菌互作的模式類型，為深入揭示葉銹菌致病及其變異機理提供理論依據，進而為開辟持久有效的小麥葉銹菌防控策略奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料 小麥感病品種Thatcher由河北農業大學植物保護學院銹病研究室提供。

1.1.2 試劑與供試菌株 SD/-Trp（PT1049）、SD/-Leu（PT1050）、SD/-Trp-Leu-His-Ade（PT1066）、3-AT（PY1052）、金單子素A（PY1052）、Y2Hgold（PG1029）、Y187（PG1030）、Oligotex mRNA Kits（70022）、Supscript double stand cDNA Kit（11917010）、Trimmer-2 cDNA normalization kit（NK002）購自陜西普因特生物工程有限公司；EcoR I（R3101）、Pst I（R3140）購自北京NEB；質粒小提試劑盒（B518191）購自生工生物工程股份有限公司。接種用小麥葉銹菌株為13-5-28-1（JHKT），對小麥品種Thatcher表現為毒力，由本研究室提供。

1.1.3 試驗設備 臺式高速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific, Heraeus Multifuge X1R）、PCR儀（Bio-Rad, T100 Thermal Cycler）、凝膠成像系統（Bio-Rad, Gel Doc XR+）。

1.2 方法

1.2.1 植物樣品的采集 使用毛筆將小麥葉銹菌夏孢子孢懸液涂抹到小麥第一片展開的葉片上，20℃避光保濕16 h后，轉移到溫室22℃，光照14 h，黑暗10 h條件下培養，分別于接種后0、6、12、24、36、48、72、96、120 h和6 d、9 d、12 d時取小麥苗相同位置的葉片組織，每個處理重復3次，液氮速凍后存于-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 總RNA的提取及檢測 采用Trizol法［34］提取小麥葉片總RNA。總RNA的濃度和純度用蛋白核酸定量檢測儀檢測，用1%（質量分數，下同）的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.2.3 cDNA文庫的構建 使用Oligotex mRNA Kits（Qiagen）對小麥葉片總RNA進行分離純化，樣本的mRNA用于第一鏈的合成。在預冷的0.5 mL無菌離心管中混合3 μL mRNA、1 μL SMART IV Oligonucleotide、1 μL CDS-3M PCR Primer。將上述混合液置于72℃條件下孵育2 min，冰上冷卻2 min，高速短暫離心10 s，每一管中添加10 μL混合液，含2.0 μL 5×First-Strand Buffer，1.0 μL DDT（20 mmol/L），1.0 μL dNTPs Mix（10 mmol/L），1.0 μL PowerScriptTMReverse Transcriptase，ddH2O補足至10 μL，輕彈混勻，42℃孵育1 h，置于冰上終止第一鏈的合成。按照下列反應系統開展LD PCR（long distance PCR）擴增雙鏈cDNA：在0.5 mL反應管配置以下混合物，2 μL First-Strand cDNA、80 μL Deionized H2O、10 μL 10× Advantage 2 PCR buffer、2 μL 50× dNTPs Mix、4 μL M1 PCR Primer、2 μL 50× Advantage 2 Polymerase Mix、ddH2O補足至100 μL，輕彈混勻，稍離心10 s。反應程序為95℃預變性1 min；95℃變性10 s，68℃退火6 min（每循環增加5 s），20 循環，68℃后延伸5 min；16℃保存10 min。反應結束后，取5 μL產物于1%含EB的瓊脂糖凝膠上電泳檢測cDNA合成結果。

取上述cDNA分別進行乙醇沉淀，最終溶解在14 μL DEPC水中。取12 μL cDNA加入4 μL 4×雜交buffer，98℃ 2 min，68℃ 5 h。之后加入4 μL 5×DSN buffer，然后加入0.2 μL的DSN酶（1 U/μL），置于68℃反應3 min。加入10 μL EDTA，混勻，加入等體積的酚氯仿抽提一次。最后將抽提產物進行乙醇沉淀，溶于80 μL DEPC水中。取cDNA DSN treatment 79 μL，添加10 μL 10×PCR Buffer、4 μL 10 mmol/L（each）dNTPs、5 μL 50 mmol/L MgSO4、1 μL PCR Primer（100 ng/μL）、1 μL Taq DNA Polymerase，總體積100 μL。PCR反應程序：95℃預變性1 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s；72℃延伸6 min，5個循環。使用1%濃度的瓊脂糖膠電泳cDNA產物，切膠回收1 kb以上的片段。用14 μL的DEPC水溶解回收產物，完成cDNA文庫均一化處理。

使用同源重組的方法，將均一化的cDNA連接到pGADT7載體上，電轉化到DH10B中，收集并提取文庫質粒，將提取好的文庫質粒采用PEG/LiAc介導的酵母轉化法［20］轉至酵母菌感受態Y187中，涂布至150 mm SD/-Leu平板，30℃培養3-4 d，收集菌體，存于-80℃，即為文庫菌液。

1.2.4 cDNA文庫質量檢測 取10 μL酵母文庫轉化液稀釋1 000倍，從中取出100 μL涂布SD/-Leu平板上，30℃倒置培養2-3 d計數。按下列公式計算出文庫庫容量：

文庫滴度（CFU/mL）=菌落數×稀釋倍數/涂布體積×1 000

文庫庫容量（CFU）=（平板單克隆數×懸浮細胞液總體積）/涂板菌液體積×1 000

取10 μL cDNA文庫菌液，使用YPDA培養基稀釋至105，取100 μL液體涂布100 mm SD/-Leu平板上，30℃倒置培養3-5 d，統計菌落數。按下列公式計算出文庫滴度。

cDNA文庫滴度（CFU/mL）=菌落數×稀釋倍數/涂布體積×1 000

隨機挑取平板上的單克隆，以GALAD/T7 3′AD為引物（F: 5′-TAATACGACT CACTATAGGG-3′，R:5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′），PCR擴增插入片段，計算文庫重組率及插入片段平均大小。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物大小。

1.2.5 誘餌載體的構建 以小麥葉銹菌cDNA為模板，選擇EcoR I及Sal I兩個酶切位點，設計特異性引物Pt34084-F（5′-ATATGGCCATGGAGGCCGAATT CTGGGATCCAGCAACGGG-3′）和Pt34084-R（5′-TTA TGCGGCCGCTGCAGGTCGACCTAATCACTGTTGTCA GGAGAA GTG-3′）擴增候選效應基因Pt34084（去信號肽）編碼區。20 μL PCR反應體系為：Buffer 10 μL，dNTP 0.4 μL，cDNA 2 μL，引物各0.8 μL，酶0.4 μL，ddH2O25.6 μL。反應程序為94℃ 3min；94℃ 30 s，60℃ 40 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，目的條帶膠回收后-20℃保存。利用重組酶將上述PCR擴增產物與經EcoR I、Sal I線性化誘餌載體pGBKT7進行連接、轉化并挑斑測序。測序無誤的單克隆搖菌擴增后，按照生工質粒小提試劑盒說明書提取重組載體后于-20℃保存備用。

1.2.6 誘餌載體pGBKT7-Pt34084毒性及自激活檢測 利用PEG/LiAc介導的酵母轉化法分別將重組誘餌載體pGBKT7-Pt34084、pGBKT7-GAL4、pGBKT7體轉入酵母菌株Y2Hgold中，取100 μL分別涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal培養基上，平板倒置于30℃培養箱內培養3-5 d，以pGBKT7-GAL4為陽性對照，觀察生長狀況及菌落顏色變化。

1.2.7 誘餌載體pGBKT7-Pt34084自激活抑制實驗 從SD/-Trp平板分別挑取Y2Hgold［pGB KT7-Pt34084］菌斑于裝有200 μL 0.9%（質量分數）NaCl的1.5 mL EP管中，混勻，調OD600值至1，并梯度稀釋OD600值至0.1、0.01，分別點斑至含不同濃度3-AT及ABA（表1）的SD/-Trp/-His/-Ade平板上，以SD/-Trp為對照，30℃培養箱內倒置培養4 d。

表1 SD/-Trp/-His/-Ade不同組分濃度Table 1 SD-Trp/-His/-Ade concentrations of different components

1.2.8 酵母雙雜交文庫的篩選 挑取酵母菌株Y2Hgold［pGBKT7-Pt34084］單菌落，裝有10 mL的YPD PLus液體培養基的試管中，30℃，250 r/min培養8-12 h，制備誘餌菌株感受態，并利用PEG/LiAc介導的酵母轉化法將文庫質粒轉入到誘餌酵母感受態中。取10 μL轉化液稀釋1 000倍后取100 μL涂布在SD/-Leu/-Trp平板上，倒置于30℃培養箱內培養5 d，統計轉化效率。剩余轉化液全部涂布于60個120 mm的SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/3-AT（20 mmol/L）/ABA（400 ng/mL）平板上，倒置于30℃培養箱內培養3-5 d，挑取陽性克隆子至SD/-Leu/-Trp液體培養基中過夜培養，利用酵母質粒提取試劑盒提取質粒后進行PCR，將PCR產物鑒定并送測序。將基因序列在NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行比對，獲得候選互作效應蛋白的注釋情況。

2 結果

2.1 總RNA質量分析

以小麥葉銹菌菌株13-5-28-1侵染后小麥不同時間點葉片為材料，提取總RNA，經電泳檢測，有28S和18S兩條帶，且條帶完整，沒有彌散，亮度之比約為2∶1（圖1-A），使用Oligotex mRNA Kits（Qiagen）分離純化樣本獲得的mRNA（圖1-B）條帶清晰，呈彌散狀分布，條帶分布均勻，質量合格，mRNA總量為6.2 μg，滿足建庫需要。

圖1 總RNA提取（A）及mRNA分離（B）Fig.1 Total RNA extraction（A）and mRNA isolation（B）

2.2 酵母文庫的構建及質量檢測

將提取的文庫質粒轉入Y187后，經SD/-Leu平板上檢驗克隆數約為700和1 200個（圖2-A, B），依據公式統計文庫庫容量為1.05×107CFU/mL（標準＞1×106CFU/mL），滴度為1.2×109CFU/mL（標準＞1×108CFU/mL），均符合建庫要求，可用于后期互作蛋白篩選。

圖2 酵母雙雜交文庫庫容（A）及滴度的鑒定（B）Fig.2 Identification of volume（A）and titer of yeast twohybrid library（B）

從文庫中隨機挑取23個單菌落并提取質粒，利用載體引物進行PCR檢測，并用1%的瓊脂糖凝膠檢測，23個陽性克隆均有插入片段，且插入片段大小分布在500-2 000 bp范圍內（圖3），平均插入片段大于等于1 kb，文庫陽性率為100%，文庫指標合格。

圖3 小麥葉片cDNA文庫插入片段大小檢測Fig.3 Detection of insert size in wheat leaf cDNA library

2.3 小麥葉銹菌效應因子Pt34084誘餌蛋白的載體構建

2.3.1 誘餌載體構建 將誘餌載體pGBKT7用EcoR I及Sal I進行雙酶切后，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后如圖4-A，目的條帶切膠回收。以小麥葉銹菌侵染感病品種Thatcher cDNA為模板，用Pt34084（669 bp）特異性引物進行PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳（圖4-B）。將PCR產物與線性化pGBKT7載體進行連接、轉化并挑斑測序準確的質粒進行保存備用。

圖4 pGBKT7雙酶切產物（A）及Pt34084 PCR產物電泳圖（B）Fig.4 Electrophoresis maps of pGBKT7 double digestion product（A）and Pt34084 PCR product（B）

2.3.2 pGBKT7-Pt34084誘餌自激活及毒性檢測 將誘餌載體pGBKT7及重組載體pGBKT7- Pt34084轉入Y2Hgold酵母菌株中后，以pGBKT7-GAL4為陽性對照，分別吸取100 μL轉化液涂布在SD/-Trp、SD/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal培養基上，Y2Hgold［pGBKT7-Pt34084］生長狀況與對照誘餌載體Y2Hgold［pGKKT7］及陽性對照Y2Hgold［pGBKT7-GAL4］一致（圖5），表明重組誘餌載體對Y2Hgold酵母菌株無毒性；但發現其能在SD/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal生長，說明自身具有自激活性（圖6）。為了抑制Y2Hgold［pGBKT7-Pt34084］自激活性，使用0.9%NaCl調整OD600為1、0.1、0.01后，在含有不同濃度的3-AT、ABA SD/-Trp/-His/-Ade進行點斑培養，在3-AT、ABA的濃度為20 mmol/L、400 ng/mL時可以抑制Y2Hgold［pGBKT7- Pt34084］的生長（圖7），因此可以進行酵母文庫篩選試驗。

圖5 重組誘餌載體pGBKT7- Pt34084毒性檢測Fig.5 Toxicity detection of recombinant bait vector pGBKT7-Pt34084

圖6 Y2Hgold［pGBKT7-Pt34084］自激活活性檢測Fig.6 Self-activation activity assay of Y2Hgold［pGBKT7-Pt34084］

2.4 效應蛋白Pt34084互作蛋白的初步篩選及其序列分析

轉化后取10 μL轉化酵母菌液稀釋1 000倍后，涂布100 μL至SD/-Trp/-Leu培養基上，計算本次篩庫的總轉化子數目≥1×106（圖8-A），滿足酵母雙雜交篩庫的要求。挑取SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/20 mmol/L 3-AT/400 ng/mL ABA平板上（圖8-B）陽性克隆進行測序分析。

去掉移碼序列，共獲得16個與效應蛋白Pt34084可能存在互作關系的蛋白（表2），分別為光照后葉綠素熒光增加蛋白、光系統組裝蛋白2、類過氧化物酶11、細胞壁連接的類受體激酶、蛋白酶體組裝伴侶4、富含絲氨酸的無特征蛋白、蛋白磷酸酶2C、60 S核糖體蛋白、E3泛素蛋白連接酶、甲硫氨酰氨基肽酶、含鹵酸脫鹵酶類水解酶結構域蛋白、4個未知蛋白以及1個假定蛋白，其中假定蛋白、甲硫氨酰氨基肽酶來自小麥稈銹菌，其余均來自普通小麥、山羊草或二粒小麥。經GO注釋分析，候選互作蛋白存在于葉綠體類囊體膜、葉綠體基質、胞外、細胞膜等細胞器中，參與植物的光合作用、ATP的合成、過氧化氫分解代謝、光系統I組裝、蛋白磷酸化、植物的抗病反應以及細胞表面受體信號通路等（圖9）。

表2 Pt34084 候選效應蛋白Table 2 Pt34084 candidate effector protein

3 討論

高質量的cDNA文庫是進行酵母雙雜交試驗并成功獲得靶標蛋白的前提。小麥葉銹菌侵染小麥時潛育期較長，從接種到釋放出橙紅色的夏孢子需要經歷7-10 d［35］，因此在構建酵母雙雜交文庫時，收集了葉銹菌侵染小麥0-12 d時間段的樣品，以確保富集葉銹菌侵染小麥后各個時間段所激發表達的蛋白。RNA完整性、文庫庫容及滴度是評價cDNA文庫質量主要指標［36-38］。試驗中提取RNA樣本條帶清晰，無明顯降解，純度及完整性較高，并且分離純化后的mRNA呈彌散狀均勻分布，質量合格，為構建文庫奠定了基礎。均一化處理使表達豐度高的基因降低，表達豐度低的基因提高，從而使不同基因的表達豐度變得相當，以保證每個基因被篩選到的概率相同，避免出現篩選同一個基因的現象。

酵母雙雜交技術是獲得未知互作蛋白的主要手段之一，也是研究蛋白功能及解析作用機制有效的方法，在多種病原菌效應蛋白研究中應用廣泛。張引弟等［39］利用酵母雙雜交技術篩選獲得了與致病疫霉菌效應蛋白PITG_07586相互作用的3個靶標蛋白，為研究PITG_07586如何調控植物免疫提供重要依據。張凇［40］以果生炭疽菌效應蛋白CfCE92為誘餌，以果生炭疽菌侵染嘎啦葉片為材料，構建酵母雙雜交文庫，從中篩選出來與植物防衛反應相關基因NDPK，并應用雙分子熒光技術證實二者存在互作關系，進而推測CfCE92通過與NDPK互作抑制寄主防衛反應，促進果生炭疽菌侵染。Liu等［24］從小麥條銹菌與小麥互作的酵母雙雜交文庫中篩選獲得了與小麥條銹菌效應蛋白PstGSRE1互作的靶標蛋白TaCZSOD2，通過抑制TaCZSOD2的活性從而降低小麥總CuZnSOD2活性，進而抑制H2O2的積累，從而促進自身侵染。目前，小麥葉銹菌效應蛋白研究較為滯后，關于小麥葉銹菌效應蛋白的靶標蛋白鮮有報道。本研究以小麥葉銹菌效應蛋白Pt34084為誘餌，利用該酵母cDNA文庫，初步獲得效應蛋白Pt34084的16個候選靶標蛋白，部分靶標蛋白與植物光合作用、抗病性相關等。細胞壁連接的類受體激酶（WAK）屬于植物受體激酶，主要參與防御病原菌、細胞伸長、金屬離子脅迫反應等。Zhong等［41］沉默煙草NbWAK后接種TYLCV發現，煙草葉片發生嚴重卷曲、皺縮。棉花中的WAK基因通過調節生長素和赤霉素的水平參與棉纖維的生長［42］，在擬南芥中過表達AtWAK1可以增強植物對鋁脅迫的耐受性［43-44］。過氧化物酶（POD）是植物體內重要的保護酶，在植物生長發育及抵御生物及非生物脅迫時起著重要作用［45］，也是小麥苗期抗葉銹篩選的重要生理指標［46］，Hemetsberger等［47］證實了玉米瘤黑粉效應蛋白Pep1與玉米細胞外的過氧化物酶POX12結合并抑制活性氧的產生。此外，光照后葉綠素熒光增加蛋白、光系統I組裝蛋白2與植物光合作用相關，在小麥條銹菌中，效應蛋白Pst_12806可與小麥細胞色素 b6-f 復合體鐵硫亞基（Triticum aestivum cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit, TaISP）互作，影響寄主植物的光合作用［22］。因此，后續均可作為重點研究對象進行點對點互作蛋白的驗證。同時，為了避免酵母雙雜交假陽性，在后續試驗中應結合雙分子熒光互補技術（BFiC）、免疫共沉淀技術（COIP）做進一步的互作驗證。這些候選互作蛋白為研究小麥葉銹菌效應蛋白如何干擾寄主防御反應奠定了基礎。

4 結論

本研究通過葉銹菌菌株13-5-28-1（JHKT）侵染小麥感病品種Thatcher互作體系，成功構建了葉銹菌與小麥互作的均一化酵母雙雜交cDNA文庫，成功構建效應基因Pt34084重組載體，并利用該文庫進行了互作蛋白的篩選，通過比對去掉移碼序列共獲得16個來自于銹菌及小麥的可能與效應蛋白Pt34084存在互作關系的蛋白。