抗、感品種棉花根系分泌物對尖孢鐮刀菌生長及基因表達的影響

婁慧 朱金成 楊洋 張薇

（石河子大學農學院 新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室，石河子 832003）

棉花（Gossypium spp.）是我國最重要的纖維經濟作物之一，同時也是重要的油料作物，2022年全國植棉面積為3 000.3千hm2。新疆是中國最大的棉花生產地區，2022年占全國棉花總種植面積的83.22%（國家統計公報，http://www.stats.gov.cn/sj/zxfb/202302/t20230203_1901689.html）。棉花生產是新疆農業生產的主要產業，隨著新疆棉花種植面積的擴大和連作年限的延長，棉花枯萎病的發生日趨加重，已成為影響新疆棉花生產可持續發展的一大難題［1］。

棉花枯萎病是棉花的一種常見土傳性的植物真菌病害，病原菌是尖孢鐮刀菌萎蔫專化型真菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum, Fov），由于其病原菌頑強、傳播迅速，危害極大，一旦發生難以治愈［2］。尖孢鐮刀菌通常從棉花的根尖或根部傷口入侵，在入侵棉花的過程中，孢子或微菌核受到棉花根系分泌物的刺激萌發，因此棉花根系分泌物與尖孢鐮刀菌致病密切相關［2-3］。Jia等［4］研究發現，連作馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）根系分泌物會促進尖孢鐮刀菌菌絲生長和孢子繁殖，同時增強其致病性，導致連作馬鈴薯枯萎病發生。Yang等［5］通過比較抗、感香蕉（Musa nana Lour.）品種培養液對香蕉枯萎病菌Foc4根系定殖的影響發現，抗、感品種根系分泌物中有機酸組分存在明顯差異，分析表明抗病品種具有促進拮抗菌生長，且抑制病原菌定殖的作用。Li等［6］通過對不同抗性西瓜［Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.］品種根系分泌物研究發現，感病品種根系分泌物可促進尖孢鐮刀菌菌絲生長、孢子萌發，抗病品種根系分泌物則具有抑制作用。

轉錄組學是一門在整體水平上研究細胞中基因轉錄的情況及轉錄調控規律的學科，從RNA水平研究基因的表達情況。目前已被應用于尖孢鐮刀菌生長發育和致病過程中的基因表達分析［7-8］。Yang等［5］通過對香蕉尖孢鐮刀菌（F.oxysporum f.sp.cubense）的轉錄組分析發現，氨基糖代謝通路對于厚垣孢子的形成具有關鍵作用。Lu等［9］通過高通量轉錄組測序分析發現，磷脂酶D信號通路受到抑制，可能會導致黏團專化型尖孢鐮刀菌生理1號小種（F.oxysporum f.sp.conglutinans）菌絲生長緩慢、致病力減弱。Sun等［10］研究發現，番茄尖孢鐮刀菌（F.oxysporum f.sp.lycopersici）轉錄因子FolCZF1的轉錄水平在分生孢子和早期侵染階段上調表達，進一步通過基因敲除獲得的FolCZF1突變體菌株在生長速度、產孢、分生孢子形態以及致病力等方面均表現出缺陷，表明FolCZF1為其生長發育所必需。雖然這些研究在一定程度上揭示了尖孢鐮刀菌生長發育及其致病的分子機制，但關于不同棉花品種的根系分泌物對尖孢鐮刀菌基因表達的影響仍未見報道。

本研究通過抗、感棉花品種根系分泌物與枯萎病菌的共培養，探究根系分泌物對棉花枯萎病菌生長的影響，同時對差異表達基因（DEGs）進行GO功能注釋和KEGG富集分析，從轉錄水平對其相互作用機制進行探討，為篩選潛在的關鍵致病基因及棉花枯萎病的防治奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花感病品種新海14號（XH-14）和抗病品種新海41號（XH-41），枯萎病菌株（F327）均由石河子大學農學院棉花分子育種實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 棉苗的種植 將棉花種子浸泡在75%酒精中消毒10 min，用蒸餾水沖洗3次。將其鋪至有3層紗布的發芽盒內生長至脫殼，用海綿包裹棉花根系穿過35孔泡沫板，防止根系受到傷害，然后將泡沫板放于裝有5 L霍格蘭營養液的塑料盆中，同時使用氧氣泵連續通氧。45 d后獲得根系分泌物粗收集液，經定容、過濾后調整濃度為0.2 g/mL（指每mL收集液中含0.2 g鮮根重的根系分泌物）。

1.2.2 尖孢鐮刀菌樣本的制備 采用查氏培養基培養Fov分生孢子，在25℃、220 r/min黑暗條件下培養5 d后，進行過濾，收集新鮮的分生孢子用于根系分泌物的培養。稱取0.5 g分生孢子懸浮在10 mL根系分泌物水溶液中，在25℃、220 r/min條件下進行培養，于培養后6、12、24和48 h分別離心收集菌體。液氮速凍后于-80℃冰箱保存，用于轉錄組測序。選取0 h的Fov樣本，標記為F0；感病品種XH-14根系分泌物培養的Fov，分別標記為G6、G12、G24和G48；抗病品種XH-41根系分泌物培養的Fov，分別標記為K6、K12、K24和K48；水培養的Fov，分別標記為W6、W12、W24和W48。共13個樣本，每個處理2個生物學重復，共構建26個文庫。

1.2.3 根系分泌物對尖孢鐮刀菌生長的影響

1.2.3.1 根系分泌物對菌絲生長的影響 將馬鈴薯培養基倒入玻璃培養皿中，冷卻凝固，將2 mL根系分泌物水溶液在培養基表面涂抹均勻。待分泌物浸入培養基表面后，用滅菌的5 mm打孔器在菌落上制作菌餅，接種于培養基中心位置，每皿1個菌餅，每個處理3個重復，以不加根系分泌物的培養基作為對照（CK），每個處理組設置3個重復。倒置于人工氣候箱中（溫度28℃，相對濕度75%）暗培養3、5、7 d，利用十字劃線法測定菌落直徑。

1.2.3.2 根系分泌物對孢子萌發的影響 將0.5 mL孢子混懸液與等量根系分泌物水溶液滴于凹玻片，放于恒溫箱（28℃）培養2、4、6、8和10 h，并統計孢子萌發數，以無菌水為對照（CK），每個處理組設置3個重復。

1.2.3.3 根系分泌物對菌生物量的影響 將直徑5 mm同齡等量的菌餅分別接種于抗、感品種根系分泌物培養基上，每個處理組設置6次重復。將培養皿倒置于恒溫箱（28℃）培養3、5、7 d，干重比色法測定菌的生物量。

1.2.4 根系分泌物培養尖孢鐮刀菌的轉錄組分析

1.2.4.1 RNA的提取 采用Tiagen公司RNA simple total RNA提取試劑盒提取Fov中的總RNA。

1.2.4.2 RNA測序文庫的創建 測序RNA測序文庫的創建和測序工作均由北京百邁客生物科技有限公司完成，使用Illumina HiSeq TM 4000測序儀進行測序。

1.2.4.3 RNA測序數據的分析及差異表達基因的篩選 通過HISAT軟件將Clean reads比對Fov的參考基因組（https://fungi.ensembl.org/Fusarium_oxysporum_f_sp_vasinfectum_25433_gca_000260175/Info/Index），統計Reads在參考基因組上的分布和覆蓋率，并對其進行FPKM轉換，從而獲得全部基因的表達水平。再用DEGseq進行差異分析，篩選閾值為qvalue＜0.005且|log2.Fold_change|＞1。然后，對DEGs（上調和下調）進行GO功能富集分析及KEGG代謝通路富集分析。

1.2.4.4 利用RT-qPCR對DEGs進行驗證 為驗證RNA-seq結果的可靠性，選擇12個DEGs進行RT-qPCR驗證。通過Primer Premier 5.0設計特異性引物，使用SYBR Green Mix在羅氏LightCycler?480上進行分析，按照2-ΔΔct法計算基因的相對表達量，以Fov微管蛋白基因（β-tubulin-F: 5′-CGTCTAGAGGTACCCATACCGGCA-3′, β-tubulin-R: 5′-GCTCTAGACTGCTTTCTGGCAGACC-3′）為內參基因（表1）。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。實驗參數為94℃ 1 min；94℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s；40次循環，設置3次重復。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 數據處理及作圖 用Graphpad Prism 8軟件對數據進行處理和繪圖。

2 結果

2.1 根系分泌物對尖孢鐮刀菌生長的影響

通過抗、感品種根系分泌物對尖孢鐮刀菌的處理，結果發現，隨著萌發時間的延長，XH-41根系分泌物處理組的孢子萌發率顯著低于XH-14根系分泌物處理組和CK對照組，其中XH-41處理組在第10小時時孢子萌發率為72.10%，與CK對照組相比顯著降低，降低了27.21%（圖1-A）。在培養第7天時，XH-14和XH-41根系分泌物處理組菌的生物量分別為101.31和68.51 mg，與CK對照組相比，XH-14根系分泌物處理組提高了10.94%，而XH-41根系分泌物處理組降低了24.98%（圖1-B）。XH-14根系分泌物處理組的孢子萌發率，顯著高于XH-41根系分泌物組和CK對照組，其中XH-14處理組在10 h時孢子萌發率為98.61%，與CK對照組相比有所增加，提高了0.62%。XH-41根系分泌物處理組抑菌圈顯著小于其他兩組處理，在7 d時菌落直徑為5.4 cm，相比XH-14根系分泌物處理組和CK對照組，分別降低了12.52%和3.41%。而在培養3-7 d的XH-14根系分泌物處理組菌落直徑為3.4-6.4 cm，顯著大于CK對照組（圖1-C, D）。以上結果表明，感病品種XH-14根系分泌物促進尖孢鐮刀菌的生長，抗病品種XH-41根系分泌物抑制尖孢鐮刀菌的生長。

圖1 根系分泌物對尖孢鐮刀菌生長的影響Fig.1 Effects of root exudates on the growth of Fusarium oxysporum

2.2 轉錄組分析

2.2.1 RNA-seq質量評估和轉錄組模式分析 通過對抗、感棉花根系分泌物培養的尖孢鐮刀菌26個樣本進行RNA-seq，共獲得175.85 Gb Clean data，各樣品Clean data均達到5.70 Gb，Q30堿基百分比在91.94%及以上。Clean reads比對到Fov參考基因組上的reads數Mapped reads占86.71%-94.79%（表2和圖2）。每個樣本的兩個生物學重復間FPKM分布的皮爾遜相關系數R2均在0.945-0.987之間（P＜0.001），表明RNA-seq數據可靠，具有較好的重復性。

圖2 尖孢鐮刀菌樣本間相關性分析Fig.2 Correlation analysis among the samples of F.oxysporum

表2 測序數據評估統計表Table 2 Evaluation statistics of sequencing data

2.2.2 尖孢鐮刀菌差異表達基因分析 此次分析共檢測到表達基因20 419個，已知基因18 905個，新基因1 514個。基于表達量定量結果，進行DEGs篩選（圖3）。感病品種XH-14根系分泌物處理組樣本與同時間水處理樣本（W6、12、24、48 h）相比，培養6、12、24和48 h后分別鑒定到1 583個（744個上調和839個下調）、1 117個（708個上調和409個下調）、1 611個（765個上調和846個下調）和1 715個（945個上調和770個下調）DEGs（圖4-A,D）。抗病品種XH-41根系分泌物處理組樣本與同時間水處理樣本（W6、12、24、48 h）相比，培養6、12、24和48 h后分別鑒定到926個（550個上調和376個下調）、589個（318個上調和271個下調）、1 920個（891個上調和1 029個下調）和1 653個（790個上調和863個下調）差異表達基因（圖4-B,D）。（G vs W）vs（K vs W）共獲得DEGs數量為4 248個，G vs W的DEGs數量為1 277個，K vs W的DEGs數量為716個，二者共同富集的DEGs數量為2 255個（圖4-C）。結果發現，抗、感品種根系分泌物培養的樣本均存DEGs，其中在感病品種XH-14根系分泌物培養的樣本中上調的DEGs多于抗病品種XH-41根系分泌物培養的樣本，與培養24、48 h相比，培養6、12 h的DEGs顯著上調。表明Fov對不同抗性品種的根系分泌物均能夠產生響應，但對感病品種根系分泌物的響應較為強烈。

圖3 尖孢鐮刀菌的差異表達基因統計Fig.3 Statistics of differentialy expressed genes of F.oxysporum

圖4 尖孢鐮刀菌的差異表達基因Fig.4 Differentially expressed genes of F.oxysporum

2.2.3 尖孢鐮刀菌的DEGs功能注釋 對已注釋的DEGs進行GO功能富集和KEGG通路分析，GO功能富集結果顯示，感病品種XH-14根系分泌物處理樣本中，在生物過程方面，DEGs主要富集在氨基酸轉運（amino acid transport, GO:0006865）、跨膜轉運（transmembrane transport, GO:0055085）、脂肪酸生物合成過程（fatty acid biosynthetic process,GO:0006633）等條目上；在細胞組分方面，主要富集在膜的組成部分（integral component of membrane,GO:0016021）條目上；在分子功能方面，主要富集在陽離子轉運ATP酶活性（cation-transporting ATPase activity, GO:0019829）、轉移酶活性、轉移酰基（transferase activity, transferring acyl groups,GO:0016746）、離子通道活性（ion channel activity,GO:0005216）等條目上（圖5-A）。抗病品種XH-41根系分泌物處理樣本中，結果（圖5-B）顯示，在生物過程方面，DEGs主要富集在跨膜轉運（transmembrane transport, GO:0055085）、三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle, GO:0006099）、氨基酸轉運（amino acid transport, GO:0006865）過程等條目上；在細胞組分方面，主要富集膜的組成部分（integral component of membrane, GO:0016021）條目上；在分子功能方面，主要富集在陽離子轉運ATP酶活性（cation-transporting ATPase activity, GO:0019829）、ATP酶活性（ATPase activity, GO:0016887）、磷酸二酯水解酶活性（phosphoric diester hydrolase activity,GO:0008081）等條目上。

圖5 XH-14（A）和XH-41（B）差異表達基因GO功能富集Fig.5 GO functional enrichment of XH-14（A）and XH-41（B）differentially expressed genes

KEGG富集分析結果顯示，感病品種XH-14根系分泌物處理樣本中，共有988個差異基因注釋在125個通路上，富集較為顯著的有檸檬酸循環（TCA循環，citrate cycle（TCA cycle）），涉及20個基因；類胡蘿卜素生物合成（carotenoid biosynthesis），涉及3個基因；核黃素代謝（riboflavin metabolism），涉及10個基因；谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism），涉及21個基因；淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）涉及40個基因（圖6-A）。抗病品種XH-41根系分泌物處理樣本中，共有882個差異基因注釋在123個通路上，富集較為顯著的有碳代謝（carbon metabolism）、類胡蘿卜素生物合成（carotenoid biosynthesis），涉及68個基因；其他聚糖降解（other glycan degradation），涉及11個基因；ABC運輸工具（ABC transporters），涉及36個基因；脂肪酸代謝（lipoic acid metabolism），涉及2個基因；角質、木栓素和蠟的生物合成（cutin, suberine and wax biosynthesis），涉及3個基因（圖6-B）。

圖6 XH-14（A）和XH-41（B）差異表達基因KEGG代謝通路富集Fig.6 Enrichment of KEGG metabolic pathway of XH-14（A）and XH-41（B）differentially expressed gene

2.2.4 細胞壁降解相關基因的分析 Fov從穿透根細胞壁到在宿主植物定殖期間內，會分泌多種細胞壁降解相關的酶，在植物細胞壁的降解和宿主-病原體互作中起重要作用。本研究對抗、感病品種XH-14和XH-41根系分泌物處理樣本的基因相對表達水平，進行聚類分析。共有24個DEGs富集到細胞壁降解相關通路，14個水解酶活性，水解O-糖基化合物（hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds, H）、2個α-L-葡糖苷酶活性（alpha-L-fucosidase activity, A）、3個β-半乳糖苷酶（betagalactosidase activity, B）、2個甘露糖寡糖葡萄糖苷酶活性（mannosyl-oligosaccharide glucosidase activity, M）、1個果膠裂解酶活性（pectate lyase activity, PL）、1個聚半乳糖醛酸酶活性（polygalacturonase activity, P）、1個纖維素酶活性（cellulase activity, C）。其中“水解酶活性、水解O-糖基化合物”基因富集最多，與K6、12、24、48 h處理相比，在G6、12、24、48 h處理下顯著上調，其中G6 h處理上調基因數目達到10個（圖7）。結果表明，在感病品種XH-14根系分泌物處理下，尖孢鐮刀菌中存在更多與細胞壁降解相關的基因，參與到Fov致病的相關代謝通路中使棉花感病。

圖7 細胞壁降解酶相關基因的聚類分析Fig.7 Cluster analysis of genes related to cell wall degrading enzymes

2.2.5 尖孢鐮刀菌的RNA-seq數據驗證 隨機選取12個DEGs進行RT-qPCR驗證，結果發現DEGs的表達趨勢與RNA-seq結果相一致，表明RNA-seq數據可信度高（圖8）。

圖8 尖孢鐮刀菌的差異表達基因的RT-qPCR驗證Fig.8 Validation of differentially expressed genes in F.oxysporum by RT-qPCR

3 討論

3.1 根系分泌物對尖孢鐮刀菌生長的影響

根系分泌物是植物與土壤及土傳病菌相互作用的橋梁，不僅可以通過改變土壤環境間接抑制土傳病菌，還可以通過自身作用直接抑制土傳病菌［11-13］。眾多學者對植物根系分泌物進行了研究，Liang等［14］研究結果表明，西瓜枯萎病菌在不同抗性水稻（Oryza sativa L.）品種的根系分泌物處理下會產生不同的響應，其中ELIO和4007品種的根系分泌物會抑制枯萎病菌孢子的萌發和菌的生長，顯著減少了西瓜枯萎病的發生。Chen等［15］研究發現，因抗病黃瓜（Cucumis sativus L.）品種的根系分泌物中含糖類物質較少，對尖孢鐮刀菌產生抑制作用；感病、中抗品種的根系分泌物中含糖類物質較多，能夠促進病原菌的生長。Lyu等［16］研究發現，抗病品種的根系分泌物抑制枯萎病菌絲生長、孢子萌發和產孢，未接菌與對照相比，提高抑制率，并在接菌后抑制作用增強；感病品種的根系分泌物則表現出促進作用。這與本研究結果一致，抗病品種XH-41的根系分泌物對棉花枯萎病病原菌生長發育具有一定的抑制作用，XH-41根系分泌物處理的菌落直徑明顯小于CK和感病品種XH-14根系分泌物處理的菌落直徑，并且其孢子萌發率和菌生物量均較低。由此推測抗病品種根系分泌物中可能存在某些物質，對尖孢鐮刀菌的生長起到抑制作用，而具體分子機制有待進一步地探究。

3.2 尖孢鐮刀菌與根系分泌物共培養的轉錄組分析

Fov能夠在土壤和死亡的植物殘體中存活多年，防治困難，引發的病害已成為農業上限制作物生產力的重要因素之一，目前人們對于其致病分子機制的了解還很有限［17-18］。Formela-Luboińska等［19］通過探究根腐病致病菌尖孢鐮刀菌PkF01孢子萌發的分子機制，對萌發孢子進行RNA-seq，在GO功能富集和KEGG通路分析中發現，與核糖體相關的DEGs顯著富集。Li等［20］為了揭示岷江百合（Lilium brownii var.viridulum Baker）抗枯萎病菌防衛反應的分子機制，從岷江百合轉錄組數據中挖掘了一個響應尖孢鐮刀菌侵染的病程相關蛋白（PR）4基因，通過RT-PCR和染色體步移擴增得到LrPR4的DNA序列及其啟動子片段，并初步分析其功能。徐麗嬌等［21］研究發現在干旱條件下，叢枝菌根真菌（AMF）的根外菌絲跨膜形成了H+外流和Ca2+內流，加快了菌絲和環境兩者間的物質交換，促進了AMF與寄主植物間的信號傳導，提高了作物對干旱的抵抗能力。本研究利用RNA-seq技術，對抗性不同棉花品種根系分泌物共培養的Fov轉錄組進行分析，在GO富集分析中發現，跨膜轉運（transmembrane transport,GO:0055085）條目在抗、感根系分泌物處理下均顯著富集，表明此條目中的基因可能與Fov和棉花間的互作密切相關，為后期篩選枯萎病菌致病相關基因奠定基礎。

3.3 尖孢鐮刀菌的細胞壁降解酶相關基因分析

在宿主植物的病原菌侵染過程中，病原菌可通過分泌多種細胞壁降解酶來突破宿主植物的細胞壁，然后侵染植物使其感病［22-23］。研究發現，鐮刀菌（Fusarium sp.）分泌的細胞壁降解酶主要有果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶和磷脂酶等［24-26］。Tini等［27］研究表明利用不同種類鐮刀菌侵染小麥，從而引發小麥赤霉病，發現禾谷鐮刀菌（F.graminearum）強致病力菌株（FH1和FH8）產生的細胞壁降解酶活性水平顯著強于弱致病力菌株（FH11和FH19）。Escobar等［28］通過轉錄組測序發現，番茄枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.lycopersici）的木聚糖酶基因xyl5和xyl2的表達受時期的影響，xyl5只在侵染前期響應，xyl2在侵染末期響應，xyl3和xyl4在整個過程中均有響應。Wang等［29］研究發現，β-1,4-內切木聚糖酶基因在感病棉花品種根系分泌物處理的大麗輪枝菌（Verticillium dahlia）中顯著上調，而在耐病品種根系分泌物和水處理的樣品中無明顯上調，表明感病棉花品種根系分泌物與黃萎病的發病相關。本研究結果表明，感病品種XH-14根系分泌物培養的Fov樣本中特有的上調的DEGs多于抗病品種培養的樣本，通過GO功能富集和KEGG通路分析，篩選到XH-14根系分泌物處理下與“水解酶活性、水解O-糖基化合物”（hydrolase activity,hydrolyzing O-glycosyl compounds）相關的基因，這一結果部分解釋了Fov容易導致感病品種感染枯萎病的原因，為探討和解析Fov與棉花相互作用的分子機理及Fov致病的分子機理奠定了基礎，對棉花枯萎病的防治具有指導性價值。

4 結論

抗病品種棉花根系分泌物抑制尖孢鐮刀菌的生長，感病品種棉花根系分泌物促進尖孢鐮刀菌的生長。顯著富集到細胞壁降解酶“水解酶活性、水解O-糖基化合物”GO條目。為篩選該病原真菌潛在的關鍵致病基因奠定基礎，為棉花枯萎病的防控提供理論依據。