啟動子RD29A對轉雪蓮SikCDPK1基因煙草抗逆性的影響

劉玉玲 王夢瑤 孫琦 馬利花 朱新霞

（1.石河子大學生命科學學院 綠洲城鎮與山盆系統生態兵團重點實驗室，石河子 832032；2.烏魯木齊職業大學 烏魯木齊 830000）

干旱與低溫是影響植物生長、制約作物產量的重要非生物因素。當受到極端逆境影響時，植物形態結構與胞內穩態發生變化，進而影響植物正常的生長代謝［1］。在長期進化過程中，植物形成了復雜且精細的信號轉導系統，來適應不斷變化的外界環境。Ca2+作為重要的第二信使介導逆境信號轉導過程，當植物感受到刺激信號時，胞質游離Ca2+濃度發生短暫而復雜的變化，將信號向下游傳遞，形成刺激-信使-細胞反應偶聯系統啟動防御機制［2］。鈣依賴性蛋白激酶CDPKs是Ca2+信號通路中關鍵的逆境傳感蛋白，多以基因家族形式存在，廣泛參與逆境脅迫響應過程，提高植物非生物脅迫耐受性［3］。

啟動子是調控基因表達的重要元件，決定轉錄的方向和效率。組成型啟動子驅動目的基因表達時，目的基因在植物各組織持續穩定表達，造成受體體內的物質和能量過度消耗，繼而影響目的基因的精準時空表達。而誘導型啟動子，在未受到誘導時不會表現出轉錄活性，只有在誘導后才會驅動下游目的基因的轉錄，對植物造成的副作用較小［4］。RD29A啟動子作為誘導型啟動子，其序列中包含保守的 DRE（TACC-GACAT）、C repeat DER 等逆境響應元件，這些基序可在干旱、低溫脅迫響應中發揮作用，激活下游相關抗逆基因轉錄與表達，減輕惡劣環境帶來的損傷［5］。在大豆（Glycine max L.Merr）中監測RD29A啟動子活性時發現，其干旱響應元件可以靶向調控目的基因表達來減輕非生物脅迫對大豆的傷害［6］。在RD29A啟動子驅動AtCDPK1轉化馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）的研究中發現，無脅迫時，AtCDPK1表達水平很低，但在干旱脅迫后AtCDPK1可持續高效表達，且RD29A∷AtCDPK1轉基因植株表現出一定的生長優勢［7］。RD29A啟動子驅動AtDREB1A/CBF3在番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）中表達時，目的基因可通過調節SOD與CAT活性，提高番茄干旱耐受性［8］。RD29A啟動子驅動LeNCED1基因轉化矮牽牛（Petunia hybrida），可使轉基因植株NCED轉錄水平增加，抗旱性顯著增強［9］。RD29A啟動子驅動AtDREB1a轉化鷹嘴豆（Cicer arietinum），可增強鷹嘴豆的耐旱性［10］。RD29A啟動表達Ta-Ub2基因，可使二穗短柄草（Brachypodium distachyon）耐旱性與耐寒性有所提高［11］。RD29A啟動表達RdreB1BI，轉基因草莓（Fragaria ananassa）表現出更強的耐寒性［12］。

天山雪蓮（Saussurea involucrata Kar.et Kir.）是典型的極端生境植物，也是重要的抗逆資源。實驗室前期研究發現35S啟動子驅動天山雪蓮SikCDPK1，可以增強轉基因煙草抗低溫和干旱脅迫耐受能力［13］，為探究逆境誘導型啟動子RD29A在低溫、干旱脅迫后，是否會提高轉基因煙草的低溫、干旱脅迫耐受性，本研究構建SikCDPK1基因與RD29A啟動子融合的植物表達載體，利用農桿菌介導的葉盤法轉化煙草，經過干旱與低溫誘導后，將其表型變化和葉綠素含量、POD、SOD活性、MDA含量與細胞膜透性變化等逆境生理指標相結合，分析RD29A啟動子對SikCDPK1抗逆性的影響，為SikCDPK1基因在植物遭遇低溫、干旱時更好發揮抗逆功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 煙草（Nicotiana tabacum L.）NC89（由本實驗室保存），用75%的酒精對種子表面消毒1 min，0.1% HgCl2（體積質量分數）溶液消毒7 min，無菌水沖洗3-4次，用無菌濾紙吸去種子表面多余的水分后，將種子均勻散播于1/2 MS 固體培養基表面，培養在25℃光照強度為 60 μmol/（m2·s）16 h光照/8 h黑暗的條件下。

1.1.2 主要試劑 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、RNA提取試劑盒、Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、qPCR 試劑盒、質粒小提試劑盒購自北京天根生物科技有限公司，T4 DNA ligase、限制性內切酶EcoR I、Xma I、BamH I、Sal I購自北京全式金生物技術有限公司，植物表達載體35S∷SikCDPK1及pMD19T-RD29A質粒均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 植物表達載體RD29A∷SikCDPK1的構建 用限制性內切酶EcoR I和Xma I分別酶切pCAMBIA2300∷35S∷SikCDPK1與pMD19T-RD29A質粒，酶切產物回收純化后用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，將連接產物轉化DH5α感受態細胞，在Kan抗性的LB培養基篩選后，分別使用引物RD29A-F、RD29A-R與SikCDPK1-F、SikCDPK1-R（表1）進行PCR檢測，將檢測結果為陽性的重組質粒命名為RD29A∷SikCDPK1。

表1 引物序列信息Table 1 Primers information

1.2.2 煙草遺傳轉化與轉基因煙草鑒定 將RD29A∷SikCDPK1與35S∷SikCDPK1質粒轉入根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101感受態細胞，在含Kan（50 μg/mL）與Rif（30 μg/mL）抗性的培養基中篩選后，將PCR檢測為陽性的農桿菌菌液采用葉盤法侵染無菌煙草葉片，暗培養2 d后，分別在含有Kan抗性的分化培養基與生根培養基篩選，選取生根狀況良好的煙草幼苗移入營養土，栽培溫室培養生長2個月后，采用CTAB法提取煙草葉片的基因組DNA，用SikCDPK1-F 與 SikCDPK1-R對轉35S∷SikCDPK1基因煙草PCR鑒定，用RD29A-F、RD29A-R與SikCDPK1- F、SikCDPK1-R對轉 RD29A∷SikCDPK1 煙草進行 PCR 鑒定。

1.2.3 干旱、低溫處理 選取長勢良好，生長狀態無明顯差異的非轉基因煙草和轉基因煙草株系（line1、line2），分別進行（1）干旱處理：自然干旱30 d，觀察并記錄煙草葉片萎蔫程度與形態變化；（2）低溫處理：人工氣候箱4℃處理48 h，觀察并記錄煙草的表型變化。（3）取干旱與低溫脅迫前后的煙草葉片，液氮速凍后保存于-80℃。

1.2.4 生理指標測定 參照《基礎生物化學》（第2版）［14］的方法，采用愈創木酚法測定POD活性，采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定SOD活性，采用分光光度法測定葉片葉綠素含量，采用TBA法測定MDA含量，采用電導儀測定葉片相對電導率。

1.2.5 數據分析 采用SPSS18.0軟件對實驗數據進行LSD多重方差分析，顯著性檢測設定為P＜0.05（顯著水平）和P＜0.01（極顯著水平），用Excel制作圖表。

2 結果

2.1 RD29A∷SikCDPK1融合表達載體鑒定

采用EcoR I和Xma I雙酶切pCAMBIA2300∷RD29A∷SikCDPK1重組質粒，獲得了預期大小為824 bp的RD29A啟動子片段（圖1-A），用BamH I和Sal I雙酶切pCAMBIA2300∷RD29A∷SikCDPK1重組質粒，獲得了預期大小為1 716 bp的SikCDPK1目的基因片段（圖1-B），表明RD29A啟動子與SikCDPK1基因都整合到pCAMBIA2300載體上，融合表達載體RD29A∷SikCDPK1構建成功。

圖1 RD29A∷SikCDPK1重組質粒雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion of RD29A∷SikCDPK1 recombinant plasmid

2.2 轉基因煙草分子鑒定

采用農桿菌介導法將RD29A∷SikCDPK1與35S∷SikCDPK1重組載體轉化煙草，Kan抗性篩選后，提取煙草基因組DNA，用SikCDPK1-F與Sik-CDPK1-R引物進行轉35S∷SikCDPK1煙草分子鑒定，擴增出大小為1 716 bp 的SikCDPK1目的基因片段（圖2-A）；用RD29A-F、RD29A-R與SikCDPK1-F、SikCDPK1-R引物進行RD29A∷SikCDPK1轉基因煙草分子鑒定，擴增出大小為1 716 bp SikCDPK1目的基因片段（圖2-B）與824 bp RD29A啟動子序列（圖2-C）。

圖2 轉基因煙草PCR鑒定Fig.2 Identification of transgenic tobacco by PCR

2.3 轉SikCDPK1基因煙草抗逆性分析

2.3.1 干旱脅迫后煙草表型分析 干旱處理前非轉基因煙草與轉基因煙草均長勢良好，生長狀態無明顯差異（圖3-A）；斷水30 d后（圖3-B），非轉基因煙草幾乎所有葉片變黃、萎蔫嚴重，而35S啟動子驅動的轉基因煙草只輕微黃化、葉片萎蔫彎曲，RD29A啟動子驅動的轉基因煙草幾乎無黃化，葉片只輕度失水萎蔫、生長點中心葉挺立，生長狀況較為良好，受脅迫影響不太明顯。說明RD29A∷SikCDPK1轉基因煙草對干旱的耐受性優于35S∷SikCDPK1轉基因煙草。

圖3 非轉基因煙草與轉基因煙草逆境脅迫前后表型變化Fig.3 Phenotypic characteristics of WT tobacco and transgenic tobacco under stress

2.3.2 低溫脅迫后煙草表型分析 非轉基因煙草與轉基因煙草在低溫脅迫處理前長勢一致，生長狀態良好（圖3-C），48 h 低溫處理后（圖3-D），非轉基因煙草表現出脫水癥，葉片嚴重下垂，并向下卷曲，顏色變為深綠色，葉緣周圍水漬成片，有明顯冷害癥狀；35S 啟動子驅動的轉基因煙草葉片萎縮，表面出現水漬狀斑點，自葉緣向葉脈處柔弱卷曲，葉基部顏色變暗。RD29A啟動子驅動的轉基因煙草葉片基本舒展，只有少許葉片受傷顏色變深，葉片輕微翻卷，受低溫脅迫影響不大。說明RD29A∷SikCDPK1轉基因煙草的低溫耐受性優于35S∷SikCDPK1轉基因煙草。

2.3.3 逆境脅迫相關生理指標分析 POD與SOD是防御系統中重要的保護酶，能與活性氧、自由基等發生氧化反應，清除植物在新陳代謝過程中產生的有害物質，降低植物受傷害程度。脅迫處理前非轉基因煙草與轉基因煙草的POD、SOD活性無明顯差異，干旱、低溫脅迫后，非轉基因煙草與轉基因煙草POD、SOD活性均上升，但非轉基因煙草POD、SOD活性升高不及轉基因煙草酶活性升高明顯，RD29A∷SikCDPK1轉基因煙草POD、SOD活性升高的最多，極顯著高于35S∷SikCDPK1轉基因煙草與非轉基因煙草（圖4-A，B）。35S∷SikCDPK1轉基因煙草的POD活性與SOD活性與非轉基因煙草相比均達到極顯著水平，但是SOD活性升高沒POD活性升高明顯。

圖4 非轉基因煙草與轉基因煙草脅迫處理前后生理指標測定Fig.4 Physiological indexes of non-transgenic tobacco and transgenic tobacco determined before and after stress

葉綠素是參與光合作用的主要色素，葉綠素含量高低能反映植株光合作用強弱。干旱、低溫處理前，非轉基因煙草與轉基因煙草葉綠素含量相差不大，干旱、低溫處理后，非轉基因煙草與轉基因煙草葉綠素含量均下降，但非轉基因煙草的葉綠素含量下降明顯多于轉基因煙草，RD29A∷SikCDPK1轉基因煙草葉綠素含量下降得最少，其葉綠素含量極顯著高于35S∷SikCDPK1轉基因煙草與非轉基因煙草（圖4-C）。

MDA是細胞膜脂過氧化的產物。逆境脅迫能刺激葉片產生更多的自由基，加速細胞膜脂過氧化，導致體內MDA 含量增加，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。干旱、低溫處理前，非轉基因煙草與轉基因煙草的MDA含量無明顯差異，干旱與低溫脅迫后，非轉基因煙草與轉基因煙草MDA含量均上升，但非轉基因煙草MDA含量升高的最快，增加幅度顯著大于35S∷SikCDPK1轉基因煙草，極顯著高于RD29A∷SikCDPK1轉基因煙草（圖4-D）。

相對電導率能反映質膜系統受損的程度，與植物的耐受性呈負相關。干旱與低溫脅迫前非轉基因煙草與轉基因煙草的相對電導率差異不大，脅迫處理后非轉基因煙草與轉基因煙草電導率均上升，且非轉基因煙草電導率上升速率均極顯著高于35S∷SikCDPK1轉基因煙草與RD29A∷SikCDPK1轉基因煙草（圖4-E），35S∷SikCDPK1轉基因煙草相對電導率上升速率也極顯著高于RD29A∷SikCDPK1轉基因煙草。

3 討論

3.1 SikCDPK1基因可提高植物逆境耐受性

植物維持正常的生理活動需要一個相對穩定的內環境、膜系統和氧化酶系統。長期處于逆境的植物會出現葉片皺縮、細胞受損破裂、氣孔運動降低、線粒體和葉綠體中的電子傳遞系統遭到破壞、活性氧（reactive oxygen species, ROS）誘導積累、各種重要的酶系統紊亂、細胞膜通透性增大、胞內物質外滲增多、葉綠體降解速率加快、光合速率減慢、光合作用減弱、丙二醛含量升高、植物自身過氧化物酶與超氧化物歧化酶的活性降低、抗逆性減弱、正常的生長代謝受阻［15］。在長期進化過程中植物已經形成了一個信號轉導途徑網絡，以控制其代謝并適應其環境。在這些途徑中，鈣在各種信號轉導途徑中扮演著重要的信使角色［16］。

Ca2+作為植物信號系統中的第二信使，在植物生長和發育中發揮著重要作用。當植物受到溫度、光照、鹽分、滲透壓等外部因素引發的刺激，會引發Ca2+濃度發生變化，這些變化可以被特定的鈣傳感器/受體識別和感知［17］。CDPKs是植物中重要的Ca2+信號感知蛋白，CDPKs已被證明在各種生理過程中具有重要作用，包括植物的非生物和生物脅迫反應。可通過EF-hands基序結構與Ca2+相結合，解除自我抑制，激活激酶結構域，向下游傳遞各種環境刺激觸發的鈣信號，調節植物的生理變化、免疫反應和脅迫響應［18-19］。AtCPK10和HSP1通過ABA和Ca2+信號通路參與氣孔運動的調節，提高植物耐旱能力［20］，OsCPK4通過減緩膜脂過氧化程度提高植物耐鹽和耐干旱能力［21］，ShCDPK6與ShCDPK26通過激活抗氧化系統產生SOD和POD，有效去除細胞中的活性氧，減輕低溫和干旱對植物的損傷［22］。本研究發現RD29A∷SikCDPK1和35S∷SikCDPK1轉基因煙草在低溫、干旱處理后的生長狀況都優于非轉基因煙草，進一步分析葉綠素、POD、SOD、MDA、相對電導率等逆境相關的生理指標發現，干旱和低溫脅迫后，轉基因煙草與非轉基因煙草相比，葉綠素含量增加，POD和SOD活性升高，丙二醛含量與相對電導率降低，說明SikCDPK1基因在逆境脅迫中可通過減緩葉綠體降解、提高過氧化物酶活性與活性氧清除能力、減小膜脂過氧化程度來減輕逆境引起的活性氧積累、膜通透性改變、細胞內外物質交換失衡等不良癥狀，使轉基因煙草的抗逆性增強。

3.2 RD29A啟動子可調控外源基因表達

啟動子是調控基因表達的重要元件。組成型35S啟動子驅動耐逆基因表達時雖能提高植物的耐逆性［22］，但因其不受時間與空間的約束，會持續、高效、過量地表達外源基因，和植物維持自身正常的生長代謝競爭利用能源物質，導致植物體 mRNA 轉錄受阻，相關蛋白合成量降低，使植物出現發育不良，或者轉基因種子休眠等情況。如35S∷TaFBA1轉基因煙草在抗旱性提高的同時，出現轉基因植株發育不良，轉基因植株種子休眠，發芽遲緩等現象［23］；35S∷AtDREB1C轉基因丹參（Salvia miltiorrhiza）在抗旱性提高的同時，出現了矮化現象［24］；35S∷AtCBF轉基因馬鈴薯在提高植株抗寒性的同時，出現轉基因植株開花延遲，馬鈴薯產量減少現象［25］。35S∷TaEXPB23轉基因煙草抗旱性增強，但植株苗期生長速度快，花期提前［26］。因此在提高植物抗逆性的同時，選擇適合的驅動外源基因表達的啟動子顯得尤為重要。RD29A啟動子不僅含有 DRE 等干旱、鹽脅迫響應元件，還含有生理節律調控元件Circadian，可以對干旱、低溫、鹽脅迫產生特異響應，無誘導時，啟動轉錄活性特別低或者不啟動轉錄，克服了組成型啟動子無誘導時也表達的缺陷，還能在調控外源基因表達增強植物耐逆性的同時不影響植物的正常生長發育。

本研究中RD29A∷SikCDPK1轉基因煙草在低溫、干旱處理后的生存狀況優于35S∷SikCDPK1轉基因煙草，POD活性、SOD活性、葉綠素含量顯著高于35S∷SikCDPK1轉基因煙草，相對電導率與MDA含量顯著低于35S∷SikCDPK1轉基因煙草，表明與35S啟動子相比，RD29A啟動子能更有效調控轉基因煙草通過減緩葉綠素降解速率、提高抗氧化系統酶活性和減小膜通透性，減緩低溫、干旱對煙草造成的損傷，增強煙草的低溫、干旱耐受性。

4 結論

與35S啟動子相比，啟動子RD29A可明顯提高轉雪蓮SikCDPK1基因煙草的干旱、低溫耐受性，使雪蓮SikCDPK1基因耐低溫、干旱效果發揮得更好。