基于極端混合池（BSA）全基因組重測序的羽衣甘藍白色葉基因定位

王騰輝 葛雯冬 羅雅方 范震宇 王玉書，2

（1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室，齊齊哈爾 161006）

羽衣甘藍（Brassica oleracea L.var.acephala DC）為十字花科蕓薹屬甘藍種的變種，外葉綠色為主要功能葉，心葉有紫紅、紅色、粉色和乳白色等多種顏色，為主要觀賞葉，因其較高的營養價值和獨特的觀賞性成為賞食兼用的作物。大部分十字花科植物葉色性狀屬于質量性狀遺傳。研究葉色的遺傳模式和葉色形成的關鍵基因，對羽衣甘藍新品種的選育具有重要的理論意義。

孫日飛等［1］研究發現大白菜紫葉性狀是由一對顯性基因控制。甘藍型油菜紫葉性狀則由不完全顯性核基因控制［2］。但紫菜薹紫色葉色卻是數量性狀，主效QTL區間內編碼bHLH轉錄因子的2個基因BrEGL3.1和BrEGL3.2被鑒定為控制葉色的關鍵基因［3］。Zhu等［4］通過側翼標記對羽衣甘藍粉葉基因進行錨定，同時，利用甘藍基因組信息，將Pi定位在C03染色體的頂端。白菜A07染色體上的R2R3-MYB調控基因BrMYB2，其缺失較多的短內含子促進一些結構基因的高轉錄是導致出現紫色表型的原因［5］。葉綠素的缺少是導致葉片白化的主要原因［6］。植物白色葉片形成往往受環境因素影響，如在自然光照下，白茶突變體‘Huangjinju’葉片出現白化現象，當處于低強度光照條件，葉片又會返綠［7］；大麥白化突變體‘SLTW’在低溫誘導后，于5葉期葉片開始出現白化現象，當溫度升高，白化葉片開始轉綠，直至恢復正常葉色［8］。而羽衣甘藍白色系品種外葉表現為綠色，僅心葉表現為白色，近年來，基因組測序技術的進步和成本的降低，加快了一些非模式生物的參考基因組組裝。基于全基因組重測序的BSA方法，在無須構建遺傳圖譜的情況下，可以高效挖掘目標基因，BSA-Seq技術也從模式物種拓展到了非模式物種，在許多作物中得到了廣泛的應用。

目前，利用BSA-Seq方法已成功定位出黃瓜早花［9］、番茄果重［10］、甘藍型油菜有限花序［11］、茄子萼下果色［12］、豌豆花色［13］等基因。但在羽衣甘藍中的應用報道較少。

本研究利用白色心葉DH系‘WB’和紅葉DH系‘WR’雜交構建F2代分離群體，通過對親本和2個子代混合池進行BSA-Seq全基因組重測序，定位與白葉性狀顯著關聯的區域，并通過分子生物信息學方法篩選候選基因，旨在篩選羽衣甘藍葉色形成相關的基因與位點，為羽衣甘藍新品種選育及分子標記輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

羽衣甘藍親本白色心葉DH系‘WB’和紅葉DH系‘WR’為小孢子培養獲得的DH純系。以‘WR’為母本、‘WB’為父本雜交獲得F1，F1自交獲得F2代種子，秋季在溫室種植F2代，于觀賞期觀察記錄每個F2單株的心葉顏色。利用卡方檢驗對羽衣甘藍心葉顏色性狀的遺傳分析進行檢驗。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及混池的構建 從F2群體中挑選20個紅葉F2單株和20個白葉F2單株，構建成2個混合池，命名為R和B，取幼嫩植株葉片，利用QIAGEN植物DNA提取試劑盒提取DNA，等量混合構成2個親本混池和2個子代混池，委托上海伯豪生物科技有限公司完成測序分析。利用DNA超聲波粉碎成插入長度為350 bp的片段，雙端處理文庫質檢合格后，用Illunima HiSeq進行測序，2個親本和2個混合池的測序深度分別為20×和50×。

1.2.2 測序數據處理 利用Trimmomatic軟件［14］將原始測序序列Raw Reads中的接頭和低質量序列去除，再運用BWA軟件［15］比對甘藍參考基因組（https://brassicadb.org/brad/datasets/pub/Genomes/Brassica_oleracea/V1.1/）。采用GATKv3.6.0［16］軟件進行SNP和InDel標記的檢測。使用VariantFiltration進行過濾，并利用ANNOVAR［17］軟件對變異位點在基因組上的位置區域進行注釋。

1.2.3 SNP-index計算 基于基因分型的結果，篩選親本間純合差異的多態性位點。以親本互為參照，計算2個子代混合池在每個多態性位點上的SNP頻率（SNP-index）［18］。為減少測序錯誤和比對錯誤造成的影響，將計算出2個子代中SNP-index都小于0.3且SNP深度都小于7的位點及1個子代SNP-index缺失的位點過濾掉。同時，計算2個子代池中SNP-index的差值，作ΔSNP-index。

1.2.4 目的基因的篩選與功能注釋 選擇2 Mb為滑窗、50 kb為步長，對△SNP-index在各染色體上的分布進行作圖，選取99%置信水平作為篩選的閾值，超出置信水平的窗口作為候選區間，把候選區間的SNP位點所在的基因篩選出來進行注釋。利用Blast軟件對候選區間鑒定的基因進行GO（gene ontology）數據庫注釋，從而對候選基因進行篩選和功能預測。

2 結果

2.1 心葉顏色性狀的遺傳分析

羽衣甘藍心葉顏色各世代分離鑒定統計如表1所示，以WR為母本，WB為父本的F1代均表現心葉紅色，F2分離群體中紅色心葉和白色心葉分離比例經卡方測驗符合3∶1的孟德爾分離比例（χ2=0.20＜χ20.05=3.84）。遺傳規律分析表明，羽衣甘藍白色心葉相對于紅色為隱性性狀。

表1 ‘WR’和‘WB’雜交組合后代分離比例Table 1 Segregation of the crosses between ‘WR’ and ‘WB’ in progeny populations

2.2 測序質量評估與分析

對20株白葉F2單株和20株紅葉F2單株構建的混合池，以及兩親本開展全基因組重測序（表2），共獲得150.00 G的原始數據，過濾后，4個樣本的Clean Data在18 125.99-54 943.91 M，總數據量為144.24 G。平均每個樣品覆蓋深度在55.16×，基因組平均覆蓋度為89.65%，測序數據有95.09%-95.90%以上的序列可以成功比對參考基因組，測序數據質量較高（Q20≥97.81%），說明所有樣本測序質量合格，數據比對率高，有利于后續的變異檢測及性狀的基因定位。

表2 不同樣品測序比對結果Table 2 Sequencing comparison results of different samples

2.3 SNP檢測和注釋

根據測序結果進行SNP位點分析（表3），4個樣本中，紅葉親本‘WR’中最少，為964 912個，白葉混合池中數量最多，為1 021 699個。4個樣本之間，同一類型的SNP數量和比例大致相當。所有SNP變異的位置信息包括7種類型，其中，以位于基因區間的SNP位點最多，其次是非同義突變、同義突變、終止子獲得、終止密碼子丟失，剩余的起始密碼子丟失、5′非翻譯區類型的SNP較少。

表3 變異位點注釋統計表Table 3 Annotation of variation sites

2.4 BSA分析與候選區域的篩選

統計2個極端子代混池SNP-index在染色體上的分布情況，計算2個子代混池的△SNP-index，當置信度為99%時，分布于羽衣甘藍3條染色體的8個區域出現了超過臨界值水平的極顯著峰（圖1）。顯著關聯區間分布在羽衣甘藍Chr.2：35.10-37.05 Mb、Chr.3：51.60-52.80 Mb、Chr.9：5.85-7.85 Mb、Chr.9：9.15-10.60 Mb、Chr.9：11.90-21.65 Mb、Chr.9：22.00-24.25 Mb、Chr.9：28.10-33.05 Mb和Chr.9：33.25-35.35 Mb。這些顯著關聯區間覆蓋的染色體長度為1.2-9.75 Mb，8個關聯區間內共包含510個基因（表4）。其中，第9染色體上SNP的富集程度顯著高于其他染色體，且Chr.9：11.90-21.65 Mb和Chr.9：22.00-24.25 Mb兩個關聯區間頂點峰值最高，暗示這兩個區間內可能具有調控羽衣甘藍心葉顏色的關鍵基因。

圖1 所有染色體的△SNP-index圖Fig.1 △SNP-index map of all chromosomes

表4 SNP位點關聯分析獲得的關聯區域Table 4 Correlation regions obtained by SNP correlation analysis methods

2.5 候選基因注釋與功能分析

結合BRAD數據庫中注釋信息，2個候選區段內預測到172個有注釋的基因，其中94個基因注釋到GO數據庫的21個功能組中（圖2），包括8個生物學進程、7個細胞組分和6個分子功能，在生物學進程中，這些基因主要參與代謝過程、細胞過程、單一有機體、定位等生物學過程；在細胞成分中，這些基因主要集中在膜、細胞、細胞組分、細胞器等成分；在分子功能中，這些基因主要參與結合、催化活性、轉運活性等功能。

圖2 候選基因GO富集分析Fig.2 GO enrichment of the candidate genes

根據數據庫中詳細注釋信息進一步篩選與目標性狀相關的基因，共得到8個與羽衣甘藍白葉形成有關的基因（表5）。Bol005195編碼的葉綠體ATP合酶δ亞基為光合作用必須蛋白。Bol030253為五肽重復序列超家族蛋白（pentatricopeptide repeat（PPR）superfamily protein），通過基因注釋及同源性比較，發現該基因可能編碼葉綠體蛋白。Bol030286編碼葉綠體膜整合金屬蛋白酶FtsH11。以上3個基因編碼的葉綠體蛋白穩態對葉綠體維持正常功能十分重要。Bol030235為β-類胡蘿卜素羥化酶2（BETA CAROTENOID HYDROXYLASE 2, CYH, BCH2）基因，通過隱黃質將β-胡蘿卜素轉化為玉米黃質。Bol012077、Bol1012077、Bol029431和Bol030318為跨膜蛋白（transmembrane protein）基因，具有跨膜轉運作用，推測這4個基因在葉綠素的跨膜轉運中發揮作用。

表5 候選基因功能注釋Table 5 Functional annotation of candidate genes

3 討論

自然界中，大多數植物葉子都是綠色的，葉綠素可以吸收藍紫色和紅橙光并將光能轉化為化學能。一些植物會長出白色葉子，研究證明白色的葉子或苞片可以用來吸引傳粉者，白葉的特殊功能可能增強植物的生殖適合性［19-20］。羽衣甘藍白色葉的形成機制很少被研究。本研究以2個不同葉色材料為親本構建了BSA-Seq群體，利用測序獲得的SNP進行關聯分析，獲得候選區段，對控制羽衣甘藍白色心葉的基因進行分析。2個候選區域內，共有172個具有注釋信息的基因，根據注釋及同源性比對信息共篩選出8個候選基因。

光合色素合成的場所為葉綠體，因此葉綠體的結構和發育情況直接影響光合色素的合成，進而影響葉色。Bol005195（AtpD）編碼葉綠體atp酶δ亞基，進而影響葉綠體合成酶的豐度和活性，Maiwald等［21］發現擬南芥AtpD-1突變體溫室生長表現為色素缺乏，通過回補試驗，恢復了野生型葉片顏色，表明AtpD-1的表型是由于缺乏AtpD功能所致，AtpD的產物對葉綠素合成十分必要。Bol030253編碼的五肽重復序列蛋白是一種退化的35個氨基酸重復基序，葉綠體中的PPR蛋白通過影響葉綠體的發育調控植物的葉色變化［22］。Liu等［23］研究發現玉米PPR26突變體出現葉綠素缺乏、淡綠甚至白化致死。劉勝坤等［24］證明玉米突變體74101的黃葉表型由定位于細胞核中的ZmNPPR5控制。Bol030286編碼膜結合蛋白酶FtsH11，擬南芥中同源的FtsH11亞細胞定位在葉綠體包膜內，被認為是線粒體和葉綠體的雙重靶標，FtsH11在長光周期生長期間對葉綠體的結構和功能至關重要，FtsH11突變體在長日或連續光照下生長中出現到褪綠變白的表型［25］。Bol030235為β-類胡蘿卜素羥化酶2基因，β-胡蘿卜素羥基化是類胡蘿卜素生成的關鍵調節步驟。AcBCH1沉默表達的獼猴桃中，玉米黃質、葉黃素和β-隱黃質含量降低，β-胡蘿卜素含量增加，而轉基因獼猴桃幼苗中，β-胡蘿卜素含量降低［26］。CHY沉默的馬鈴薯塊莖中，β-胡蘿卜素增加了38倍，總類胡蘿卜素增加了4.5倍，而β-胡蘿卜素羥基化的直接產物玉米黃質隨之減少［27］。以上4個基因與葉綠體結構和光合色素的形成有關，因此，推測參與白色葉形成。跨膜蛋白可以單獨或者與其他蛋白組成跨膜蛋白復合體一起執行轉運功能，一些跨膜蛋白參與了脂肪、碳、維生素及一些色素的代謝過程［28］。本研究中共鑒定出4個跨膜蛋白基因Bol012077、Bol007709、Bol029431和Bol030318，可能對葉綠素分子的轉運產生影響，從而影響葉色。

白色葉片的形成和發育是一個復雜的生理過程，目前尚缺乏系統全面的研究，本研究通過基于全基因組重測序的BSA分析尋找到了一些與白葉形成相關的基因，對于這些基因是否是白色葉片形成的關鍵基因，以及如何調控葉色的形成將在后續工作中通過轉基因等技術進行功能驗證。

4 結論

羽衣甘藍白色心葉相對于紅色為隱性性狀。所有SNP變異的位置信息包括7種類型，其中，以位于基因區間的SNP位點最多。Chr.9：11.90-21.65 Mb和Chr.9：22.00-24.25 Mb區間內可能具有調控羽衣甘藍心葉顏色的關鍵基因。進一步篩選獲得8個與羽衣甘藍白葉形成有關的基因，分別為Bol030253、Bol029431、Bol012077、Bol007709、Bol030318、Bol030235、Bol030286和Bol005195。