類胡蘿卜素降解菌株的原位篩選及其在雪茄提質增香中的應用

吳巧茵 施友志 李林林 彭政 譚再鈺 劉利平 張娟 潘勇

（1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2.江南大學生物工程學院，無錫 214122；3.江南大學未來食品科學中心，無錫 214122；4.湖北中煙工業有限責任公司，武漢 430040）

類胡蘿卜素是雪茄煙葉（Nicotiana tabacum）質體色素的重要組成部分，包括葉黃素、β-胡蘿卜素、番茄紅素和新葉黃素等，常見的類胡蘿卜素降解產物包括β-紫羅蘭酮、檸檬醛、二氫獼猴桃內酯、β-大馬酮等［1］，不僅香氣閾值低、香氣芬芳，是常用的煙用香精成分，還具有抗炎癥、抗氧化、清除強自由基活性等藥理潛能，在食品、化妝品和香水中的應用也十分廣泛［2-4］。類胡蘿卜素的降解方式主要為物理降解、化學降解和生物降解，物理降解以光降解和熱降解為主，降解較為緩慢、難以控制。目前工業生產類胡蘿卜素降解產物通常采用化學降解法，但化學試劑的大量使用對于環境的污染較大，且廢水處理成本較高。生物降解法較為安全，從煙葉中獲得的微生物來源較為可靠，在工業生產中使用較為便利［5］。

近年來有關煙葉來源的類胡蘿卜素降解菌株的研究較少，主要以分離篩選煙葉表面微生物為主，其中楊雪鵬等［6］獲得了一株美洲愛文氏菌（Ewingella americana），對葉黃素降解率最高可達90.02%；龍章德等［7］發現一株西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）可降解β-胡蘿卜素，增加煙葉二氫獼猴桃內酯、橙花基丙酮等物質含量。煙葉內生菌不僅種類多且具有與菌群和宿主互作、降堿增香等功能，還有食品安全性的優勢，具有巨大的經濟前景和科學研究價值［8］。例如，陳頤等［9］發現2株內生細菌黃色氣微菌（Aeromicrobium flavum）和嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）分泌氧化酶活性較高并能使煙葉類胡蘿卜素降解速度加快；袁濤［10］通過分析一株根瘤菌屬（Rhizobium）W44T的代謝通路，發現其具有合成類胡蘿卜素的潛能。但由于內生菌具有難以培養、豐度低且生長十分緩慢等特質，目前仍有大量內生菌資源未被發現［8,11］。近年來高通量篩選和原位培養技術的迅速發展，通過模擬煙葉微生物生長環境可獲得少量難以培養的微生物，利用類胡蘿卜素在400-500 nm具有最大吸收的特性，從優質雪茄煙葉中原位培養并大量篩選可降解類胡蘿卜素內生菌的可行性增加［12-14］。

本研究結合原位培養和流式細胞分選技術，從雪茄煙葉中原位篩選可降解類胡蘿卜素的內生菌，將其應用于來鳳CX81中部二級煙葉中發酵，并對發酵煙葉的類胡蘿卜素降解產物含量和感官質量進行分析，旨在為雪茄工業微生物菌劑的制備和煙葉內生菌資源的挖掘提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 湖北來鳳CX81中部二級煙葉原料用于原位培養煙葉內生菌和煙葉發酵，由湖北中煙工業有限責任公司提供，煙葉香氣質中等、香氣量一般、刺激性較大；湖北十堰CX14中部一級煙葉、厄瓜多爾E-HABANA 2 000上部煙葉和多米尼加CRIOLLO 98上部煙葉用于篩選可降解β-胡蘿卜素的微生物，香氣質較好、香氣量較足、煙香較豐富，由湖北中煙工業有限責任公司提供。

1.1.2 試劑 β-胡蘿卜素97%，購自上海源葉生物科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、氯化鈉等試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 微量元素培養基 含Na2HPO4·12H2O 6.15 g/L、KH2PO41.52 g/L、(NH4)2SO40.5 g/L、Mg-SO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2·2H2O 0.05 g/L、微量元素溶液I 10 mL/L。其中，微量元素溶液I：EDTA 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、微量元素溶液II 100 mL/L；微量元素溶液II：ZeSO4·7H2O 0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.03 g/L、 H3BO30.3 g/L、CoCl2·6H2O 0.2 g/L、CuCl2·2H2O 0.01 g/L、NiCl2·6H2O 0.02 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.03 g/L。培養基成分配制參考文獻［15］。

1.1.4 富集培養基 β-胡蘿卜素作為唯一碳源，按照5 g/L的含量加入微量元素培養基，可富集原位培養微生物中可降解β-胡蘿卜素的菌株。

1.1.5 LB培養基 蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉 10 g/L，LB固體培養基中瓊脂按照15 g/L含量添加。

1.1.6 復篩培養基 蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、β-胡蘿卜素5 g/L。

1.1.7 主要儀器 電子天平EX124ZH（奧豪斯儀器（常州）有限公司），恒溫培養箱BXP-450（上海博訊實業有限公司），恒溫恒濕培養箱BXS-400S（上海博訊實業有限公司），恒溫振蕩搖床ZQZY-CF（上海知楚有限公司），孔板離心機CR21N（天美創科儀器有限公司），孔板搖床ZQZY-3cs8H（上海知楚有限公司），酶標儀Cytation 3（美國Biotek公司），三重四級桿氣質聯用儀TSQ8000（賽默飛世爾科技有限公司），流式細胞分選儀BD FACSArica III（美國BD公司）等。

1.2 方法

1.2.1 煙葉微生物原位培養 取優質煙葉樣品10 g于500 mL帶擋板三角瓶，加入75%乙醇至浸沒煙葉，于10℃、220 r/min振蕩10 min。表面消毒后的煙葉使用無菌水沖洗3次，煙葉樣品使用液氮充分研磨促進內生菌的釋放，將研磨的粉末添加入20 g/L CX81煙葉的90 mL LB培養基中，于37℃或30℃、220 r/min條件下振蕩培養48 h，厭氧微生物的原位培養需置于二氧化碳培養箱，培養48 h即可獲得煙葉原位培養微生物。

1.2.2 富集培養 將原位培養液按照1%、2%、5%（體積分數）接種量分別加入添加20 g/L煙葉的富集培養基中，富集具有降解類胡蘿卜素功能的內生菌，富集培養條件設置為30℃、37℃，轉速為220 r/min，培養24 h。富集培養后于4 000 ×g離心10 min收集菌體沉淀。

1.2.3 流式細胞分選 采用PI染液分選富集培養物中的活細胞，PI染色濃度和染色時間參考［16］，使用PBS重懸菌體沉淀并多次清洗菌體，最終調節菌體濃度為OD600=0.1-0.2。用1 mL PI染液于4℃避光孵育15 min，富集培養物中的活細胞將被分選到裝有200 μL富集培養基的96淺孔板中，30℃或37℃、170 r/min培養72 h。將初步分選具有類胡蘿卜素降解能力（發酵液顏色變淺或發酵液OD495較空白對照小）的菌株接種到裝有800 μL復篩培養基的96深孔板中，30℃或37℃、170 r/min培養72 h，12 000×g離心2 min取發酵上清液檢測發酵液OD495和觀察發酵液顏色，可篩選獲得高效降解類胡蘿卜素的菌株，將獲得的菌株進行劃線純化。β-胡蘿卜素降解率的計算以未接種活細胞的孔板為空白對照，β-胡蘿卜素降解率（%）=（空白對照-菌株發酵上清液）/空白對照×100%。

1.2.4 菌種鑒定 菌株采用16S rDNA測序進行分子鑒定，引物為通用引物27F和1492R，PCR反應程序和反應體系參考文獻［17］。

1.2.5 煙葉發酵 以湖北中煙工業有限責任公司提供的湖北來鳳CX81中部二級煙葉為樣品，取200 g煙葉于自封袋中，菌株接種至LB培養基中37℃、220 r/min培養24 h，培養至菌液OD600為1，按照2%接種量均勻噴灑到煙葉表面并使得煙葉最終含水量為28%，室溫回潮一夜后于37℃、濕度為70%恒溫恒濕培養箱中發酵20 d。以添加相同體積無菌水的煙葉作為對照，標記為CK。

1.2.6 發酵煙葉感官質量分析 煙葉樣品的感官評價由湖北中煙工業有限責任公司進行，按照1-5分對樣品的香韻、定性指標和定量指標進行打分，不存在記0分。香韻類型包括：木香、豆香、花香、蜜甜香、醇甜香、焦甜香、清甜香、花粉香、奶香、干草香、烘焙香、樹脂香、果香、藥草香、堅果味、皮革味、咖啡味、胡椒味。定性指標分為：苦、甜、咸、辣、澀。定量指標分為：煙氣濃度、煙氣強度、透發性、醇和度、雪茄風格彰顯度、香氣質、香氣量、雜氣、刺激性、余味、甜潤感、燃燒性、灰色。質量得分按照公式進行計算：質量得分=（香氣質×0.18+香氣量×0.16+雜氣×0.10+刺激性×0.12+余味×0.16+甜潤感×0.10+燃燒性×0.10+灰色×0.08）/5×100。

1.2.7 發酵煙葉類胡蘿卜素降解產物測定 采用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（HSSPME/GC-MS），對發酵質量得分較高的煙葉進行煙葉類胡蘿卜素降解產物測定，SPME纖維組件二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷作為萃取頭，發酵結束的煙葉在40℃低溫烘干并研磨成粉末，取1.5 g煙葉粉末于頂空瓶中，添加2-辛醇作為內標，濃度為100 μg/μL。氦氣流速為1 mL/min，烘箱溫度固定為40℃保持2 min，在15℃/min下升溫至250℃并保持5 min，離子源溫度為210℃，傳輸線溫度為280℃。HS-SPME/GC-MS程序和類胡蘿卜素降解產物分析方法參考文獻［18-19］。

2 結果

2.1 β-胡蘿卜素降解菌株的原位篩選

優質雪茄煙葉內生菌經原位培養、富集培養后，使用流式細胞分選技術分離煙葉內生菌，具體流程如圖1所示，從富集培養物中共分選480個菌株，如圖2所示，初篩得到42株具有β-胡蘿卜素降解能力的菌株，其中復篩后有21株菌株β-胡蘿卜素降解率在50%以上，降解率在80%以上的菌株按照由高到低的排序為2B1＞2B2＞1D3＞C31＞C7＞1F9＞2E5＞C42＞A71。

圖1 β-胡蘿卜素降解菌株的原位篩選Fig.1 In situ screening of β-carotene-degrading strains

圖2 菌株β-胡蘿卜素降解率Fig.2 β-carotene degrading rates of strains

對具有較好β-胡蘿卜素降解能力的21株菌株進行菌種鑒定，結果發現篩選得到的菌屬包括農桿菌屬（Agrobacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、微桿菌屬（Microbacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、布氏桿菌屬（Brucella）和腸球菌屬（Enterococcus），共10個屬（圖3）。

圖3 菌株系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains

2.2 發酵煙葉感官質量分析

將21株具有較好β-胡蘿卜素降解能力的菌株進行雪茄煙葉發酵實驗，并對發酵結束的煙葉進行感官質量分析，共有8株β-胡蘿卜素降解菌株發酵煙葉質量得分高于CK（表1）。結果表明，菌株C31、C11、H4發酵煙葉質量得分明顯高于CK，香氣質、香氣量、刺激性等各項指標有較好的提升。其中C31香氣豐富度較好，香氣質、香氣量明顯優于CK，煙氣刺激性明顯下降；C11較CK香氣豐富度提升，香氣量充足，煙氣刺激性、雜氣較輕；H4煙葉刺激性和余味指標提高，雜氣略有減輕；A5、F5、A72等菌株減輕了煙葉雜氣、刺激性，改善了余味、燃燒性等指標。

表1 發酵煙葉質量得分Table 1 Quality score of fermented tobacco leaves

以雷達圖表征質量得分較高的C31、C11和H4發酵煙葉定性指標、定量指標和香韻類型（圖4）。發酵煙葉C31、C11和H4香韻類型多于CK，主要表現為C31煙葉共有9種香韻類型，木香、堅果味較為突出，還輔以豆香、烘焙香、蜜甜香等香韻；C11木香最為突出，花香較為明顯，并輔以樹脂香、干草香、焦甜香等香韻，共有8種香韻類型；H4木香、豆香和焦甜香較為突出，輔以堅果味、藥草香等香韻，共有9種香韻類型。從煙葉定性指標和定量指標可以看出，菌株C31、C11、H4發酵煙葉辣味、澀味減輕，甜味增加，煙氣醇和度、透發性提升，煙葉感官質量得到明顯的改善。以上結果說明類胡蘿卜素降解菌株C31、C11、H4能夠增加國產煙葉香韻類型，提升醇和度和透發性，實現了雪茄煙葉的提質增香。

圖4 發酵煙葉感官質量雷達圖Fig.4 Radar chart of sensory quality of fermented tobacco leaves

2.3 發酵煙葉類胡蘿卜素降解產物變化

對感官質量較好的C31、C11、H4發酵煙葉進行類胡蘿卜素降解產物測定，結果如圖5和表2所示，C31、C11、H4發酵煙葉中類胡蘿卜素降解產物含量顯著增加，分別是CK的1.38、1.28、1.43倍，表明菌株接種煙葉發酵能夠促進煙葉類胡蘿卜素降解。其中，菌株強化發酵煙葉中法尼基丙酮、甲基庚烯酮、香葉基丙酮、六氫假紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯等物質含量增加。不同菌株發酵煙葉中類胡蘿卜素降解產物差異較大，C31煙葉法尼基丙酮含量最高，橙化基丙酮、香葉基丙酮、甲基庚烯酮含量較高；C11香葉基丙酮含量最高，巨豆三烯酮含量也明顯高于C31和H4；H4煙葉中類胡蘿卜素降解產物種類最多，橙化基丙酮和甲基庚烯酮含量最高，二氫獼猴桃內酯含量略低于C31和C11。

表2 發酵煙葉類胡蘿卜素降解產物Table 2 Carotenoid-degraded products in fermented tobacco leaves

圖5 發酵煙葉類胡蘿卜素降解產物含量Fig.5 Content of carotenoid-degraded products in fermented tobacco leaves

3 討論

3.1 煙葉內生菌的原位篩選

煙葉內生菌廣泛存在于煙葉根際、莖、葉，因其豐富的多樣性及抗病蟲害、促進煙草生長、降低有害物質等特點成為行業研究的重要方向，但目前仍主要采用傳統平板分離技術進行內生菌篩選［8,20-21］。煙葉中包含的信號分子、關鍵酶、蛋白及電子供體或受體等某些關鍵營養物質可促進煙葉內生菌的生長，但由于煙葉化學成分復雜，難以對煙葉內生菌生長繁殖的自然條件進行模擬［11,22］。本研究將20 g/L的煙葉加入原位培養基，同時β-胡蘿卜素作為富集培養基的唯一碳源，提供較匱乏的營養物質，適合培養具有降解β-胡蘿卜素能力且生長緩慢的內生菌。

流式細胞術在煙草中的研究相對于其他植物較少，主要應用于煙氣細胞毒理學分析、煙草原生質體分析、檢測煙草青枯菌密度等［23］；流式細胞分選技術作為目前較為廣泛使用的一種高通量篩選技術，Zheng等［24］基于一種羰基的特異性熒光探針建立了一套細胞分選方法，標記并分選出產羰基化合物的菌株，說明流式分選技術可應用于煙葉微生物的篩選。本研究通過原位篩選得到21株具有較好β-胡蘿卜素降解能力的菌株，包括農桿菌屬、根瘤菌屬、鞘氨醇桿菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬等，這些菌屬在已有研究中報道為煙葉內生菌或根際微生物中常見的菌屬，通常具有促進煙草生長、增加煙葉香氣、可降解煙堿等有害物質等作用［8,20,25-26］。以上結果表明，本研究中原位培養和富集培養的培養基和條件適合生長緩慢的微生物和內生菌的培養，與現代篩選技術相結合可實現煙葉特定功能內生菌的高通量、高效、靶向篩選。

3.2 類胡蘿卜素降解菌株及降解產物對煙葉品質的影響

類胡蘿卜素降解產物是煙葉香氣組成和影響煙葉品質的重要物質，劉晶等［27］研究表明國外產地雪茄煙中甲基庚烯酮、巨豆三烯酮、法尼基丙酮等類胡蘿卜素降解產物含量較高，這使得國外雪茄煙葉在煙氣濃度、豐滿度和醇和度等方面優于國產雪茄煙葉，與本研究中煙葉醇和度提升的結果相似［1,27-28］。因此通過接種類胡蘿卜素降解菌株促進煙葉類胡蘿卜素的降解，可作為提升國產雪茄煙葉香氣和品質的技術手段。但目前雪茄煙葉中類胡蘿卜素降解菌株的篩選和應用鮮有報道，龍章德等［7］從烤煙鮮葉中分離到一株腸桿菌屬可高效降解β-胡蘿卜素，產物為β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯、β-環檸檬醛等物質；蔡文等［17］篩選到一株高斯芽孢桿菌高產蛋白酶，加入烤煙發酵煙葉類胡蘿卜素降解產物含量明顯提高。本研究篩選的菌株C31、C11和H4應用于國產雪茄發酵，煙葉類胡蘿卜素降解產物含量分別為CK的1.38、1.28、1.43倍，法尼基丙酮、甲基庚烯酮、香葉基丙酮、六氫假紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯等物質增加，增強了煙葉烘焙香、清甜香、花香和木香等香韻，表明類胡蘿卜素降解菌株應用于國產雪茄能改善煙葉質量、提升煙葉香氣。

王玉華等［26］研究發現香葉基丙酮、法尼基丙酮、二氫獼猴桃內酯與焦甜香顯著正相關，其中法尼基丙酮與香氣質正相關；巨豆三烯酮與干草香、正甜香顯著正相關，具有溫和甜潤的木香、玫瑰花香味；甲基庚烯酮與清甜香顯著正相關，能夠較好地提升香氣質。本研究中C31煙葉法尼基丙酮含量最高，橙化基丙酮、香葉基丙酮、甲基庚烯酮含量較高，與煙葉木香、烘焙香、甜味的增強和香氣質的增加相符；C11香葉基丙酮含量高于C31和H4，使發酵煙葉花香明顯增強，巨豆三烯酮增強了煙葉干草香、木香香韻，以上結果與王鵬澤等［28］的研究結果相似。二氫獼猴桃內酯含量與煙葉香氣量正相關，這可能是C31、C11香氣量較H4改善較為明顯的原因，與姜慧娟等［29］的研究相似。茅中一等［30］研究發現，香葉基丙酮具有清甜香和花香、二氫獼猴桃內酯具有清香、甲基庚烯酮具有清香和果香，與本研究結果相似；且甲基庚烯酮、香葉基丙酮閾值較低，這表明通過增加香葉基丙酮、甲基庚烯酮等物質含量能夠強化煙葉花香和清甜香，這有助于特征香韻雪茄的定制。本研究對功能菌株強化發酵提升雪茄及其他發酵產品特征香韻提供了技術基礎和可借鑒的研究思路。

從發酵煙葉感官質量看，并非類胡蘿卜素降解能力越好、類胡蘿卜素降解產物含量越高則煙葉香韻和感官質量得分越高，可能是因為內生菌難以在接種煙葉表面存活或受菌群間相互作用的影響使得煙葉感官質量一般，且煙葉致香物質含量、比例和香韻組成的復雜性導致不同煙葉感官質量存在一定的差異［13,31］。除類胡蘿卜素降解產物增加外，煙葉感官質量改善可能與煙葉其余化學成分相關，如陳倫旺［32］從煙葉表面微生物中分離出一株假單胞菌屬（Pseudomonas）不具備類胡蘿卜素降解能力，但發酵煙葉中類胡蘿卜素降解產物含量增加。此外，枯草芽孢桿菌311（Bacillus subtilis）和彎曲芽孢桿菌117（Bacillus flexus）除類胡蘿卜素降解能力外，還分別能夠產蛋白酶和淀粉酶，使發酵煙葉總氮和煙堿含量變化。因此，類胡蘿卜素降解內生菌C31、C11和H4對于煙葉原生菌群和化學成分的影響有待進一步研究。

4 結論

本研究從優質煙葉中共獲得了21株具有較好的類胡蘿卜素降解能力的內生菌，其中C31、C11、H4煙葉類胡蘿卜素降解產物含量顯著提升，分別提高了1.38、1.28、1.43倍，法尼基丙酮、巨豆三烯酮、香葉基丙酮等類胡蘿卜素降解產物含量增加。煙葉焦甜香、木香、花香等香韻增強，香氣質提升、香氣量足、刺激性降低、雜氣減輕，煙葉感官質量得到明顯改善。