鹽堿脅迫誘導的猴樟酵母cDNA文庫構建及CbP5CS上游調控因子篩選

韓浩章 張麗華 李素華 趙榮 王芳 王曉立

（宿遷學院，宿遷 223800）

猴樟（Cinnamomun bodinieri Levl.）屬于樟科樟屬常綠喬木，主要分布于我國南方地區，為我國主要的綠化樹種、經濟樹種和林用樹種，還是生物醫藥、食品添加劑、香料、化妝品、抗菌試劑等的重要來源［1］。猴樟幼苗的生長速度和抗寒性優于香樟，可以作為綠化樹種在我國長江以北地區進行栽培和應用，而我國部分地區城區綠地的鹽堿土壤環境限制了猴樟的引種推廣，耐鹽堿猴樟品種培育成為當務之急。植物對鹽堿脅迫響應機制亦十分復雜，脯氨酸是植物適應干旱、鹽堿、高溫等逆境脅迫過程中主要的滲透調節物質，對陸地棉（Gossypium hirsutum）、李（Prunus triloba）、羊草（Leymus chinensis）和紫花苜蓿（Medicago sativa）［2-5］的研究結果也表明，鹽堿脅迫條件下植物體內的脯氨酸含量會顯著提高，抗性強的樹種具有更高的脯氨酸含量。外源施用脯氨酸能夠促進植物光合能力和水分利用能力［6-7］，還能通過誘導紫花苜?？寡趸富钚蕴岣呖果}堿脅迫能力［5］。脯氨酸的生物合成和積累是植物應對滲透和氧化脅迫的重要反應之一，高等植物在滲透脅迫條件和低氮條件下脯氨酸的生物合成以Glu途徑為主導，△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）基因被認為是脯氨酸合成的關鍵基因［8］。目前，已在很多植物中發現調控脯氨酸代謝的轉錄因子，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）的AtNAC069［9］、bHLH轉錄因子MYC2［10］通過抑制P5CS基因的表達降低脯氨酸的積累。梨（Pyrus betulifolia）PbNAC1［11］、金柑（Fortunella crassifolia）FcWRKY40［12］通過上調脯氨酸合成關鍵酶基因的表達促進脯氨酸的積累。另外，FaNAC2通過促進NbP5CS1的表達、降低NbproDH2和NbP5CDH的表達，從而提高Fragaria×ananassa體內脯氨酸的含量［13］，白樺（Betula platyphylla）的BpERF11的過度表達導致了脯氨酸合成基因BpP5CS1和BpP5CS2的下調以及脯氨酸分解基因BpProDH和BpP5CDH的上調［14］。Qin等［15］發現檉柳（Tamarix hispida）轉錄因子ThCRF1可能通過與ThP5CS相互作用來調節脯氨酸的積累。

鹽堿脅迫對植物的影響首先從根系開始［16］，植物根系中脯氨酸含量［17］和P5CS表達量［18］在鹽堿脅迫處理后顯著提高，但植物脯氨酸合成響應鹽堿脅迫的分子機制并不清楚。本研究擬構建鹽堿脅迫誘導的猴樟根系酵母cDNA文庫，克隆CbP5CS啟動子序列，采用Y1H酵母單雜交技術篩選與CbP5CS啟動子存在互作的蛋白，再通過高通量測序技術鑒定調控猴樟脯氨酸合成的轉錄因子，以期為進一步研究鹽堿脅迫下猴樟脯氨酸合成調控途徑及其網絡提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料選自宿遷學院園林實驗基地猴樟苗圃地正常生長、長勢一致的1年生猴樟實生苗，苗高（30±2）cm，葉片數量統一為20片。試驗材料共90株，分2個處理，每處理45株，每處理分3個生物學重復，每重復15株，2021年8月20日將幼苗移入水培箱（600 mm×420 mm×380 mm，營養液體積40 L）中培養，采用KT板進行固定，利用增氧泵24 h充氧，之后每5 d用蒸餾水補充營養液體積至40 L。試驗所用的營養液配方為1/2霍格蘭營養液，微量元素和鐵鹽配方為通用配方，所用化學藥品均為分析純，采用蒸餾水進行配制。

基于課題組前期研究結果，試驗材料培養3周后，向2個處理營養液中加入Na2CO3，濃度分別為0（對照）、10 mmol/L，此時的營養液pH分別為7.58、9.49。于處理后的第6小時、48小時隨機選取各處理幼苗根系，液氮速凍后，-80℃凍存，備用。

1.2 方法

1.2.1 猴樟根系組織鹽堿脅迫誘導酵母單雜交核三框cDNA文庫構建 采用Trizol法提取1.0 g猴樟對照和鹽堿處理后6 h和48 h的根系總RNA。使用Oligotex mRNA Kit（Qiagen）分離純化樣本的mRNA。采用Switching Mechanism At 5′ end of the RNA Transcript（SMART）技術反轉錄合成第1鏈cDNA（引物見表1）。按照ADvantage試劑盒，采用LD-PCR技術將第一鏈cDNA擴增為三框雙鏈cDNA。三框引物分別為P1/P2/P3-F、P4-R（表1），擴增程序為95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 6 min，進行33個循環；72℃ 10 min，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。DSN均一化文庫構建基于雙鏈特異性核酸酶（Duplex-Specific Nuclease, DSN）（Primer M1見表1），使用Clontech CHROMA SPINTM+TE-1000層析柱進行純化（TaKaRa）進行小片段去除，取2 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將雙鏈cDNA與 pGADT7（lineared）同源重組，轉至大腸桿菌（Escherichia coli）感受態細胞DH5α，加入5 mL液體SOC培養基，37℃培養1 h。取上述菌液10 μL稀釋 10 000倍后，從中取100 μL涂布含有Amp+的LB平板，37℃倒置培養過夜，將三框文庫剩余轉化液分別加甘油至終濃度為20%保存于-80℃，即為原始文庫菌液。

1.2.2 文庫鑒定 取轉化后細菌原液10 μL稀釋100倍后, 從中取出10 μL涂布LB平板（含卡納抗性），第2天計數。文庫滴度（CFU/mL）=平板上的克隆數/0.1 mL×10 000，文庫總庫容量（CFU）=滴度（CFU/mL）×文庫菌液總體積（mL），庫容量至少應大于106。隨機挑取24個單克隆，使用T7/3′AD引物（表1）進行菌落PCR鑒定。取100 μL原始庫液涂布在含100 mg/L Amp+LB的培養基上，30℃、220 r/min培養至OD600=1，采用高純度質粒大提試劑盒（Tiangen, DP116）進行文庫質粒提取，于-20℃保存，即為文庫質粒。

1.2.3 猴樟CbP5CS基因啟動子克隆與序列分析 根據沉水樟（Cinnamomum micarnthum）基因組中的CmP5CS基因上游2 000 bp序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/57158），設計啟動子擴增引物（pHIS-cx-F：5′-TTCGCTATTACGCCAGCTG-3′；pHIS-cx-R：5′- GTTTATCTTGCCTGCTCATT-3′，表1），采用雙酶切法（EcoR I、Sac I）構建到酵母單雜交啟動子載體pHIS2上，測序正確后，命名為pHIS2-HHZ。利用啟動子在線分析軟Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析該啟動子的順式作用元件。

1.2.4 誘餌載體轉化酵母菌株及自激活檢測 為確定能夠抑制HIS3表達背景的最低3-AT濃度，首先將pHIS2-HHZ質粒通過LiAC的方法轉化Y187酵母感受態細胞，分別從轉化反應的平板上各隨機挑取3個單菌落，稀釋后涂板至對應的不添加histidine、但添加不同濃度（0、10、20、30、40、50、75 mmol/L）3AT的缺陷型平板上，30℃恒溫培養3 d。根據菌落的生長情況，確定最低3-AT的濃度。

1.2.5 酵母單雜交篩選cDNA文庫 在確定好3-AT濃度之后，利用共轉化的方法進行酵母單雜交篩選。用含有正確pHIS2-HHZ誘餌質粒的Y187酵母轉化子作為受體菌制備感受態，將文庫質粒pGADT7-樟樹核文庫質粒DNA轉入其中，涂SD-TLH+適宜濃度3AT平板，30℃恒溫培養3-4 d。將篩庫平板上長出的初始陽性轉化子劃線于SD-TLH+適宜濃度3AT選擇平板，30℃恒溫培養3-4 d，能夠正常生長的視為互作蛋白。

1.2.6 酵母陽性克隆PCR鑒定、測序及BLAST比對 采用快速擴增酵母陽性克隆試劑盒（yeast colony rapid detection kit，南京瑞源）從酵母細胞中擴增出陽性克隆，進行NGS測序，并與GenBank數據庫中的序列進行BLAST比對分析，去除空載和重復序列最終獲得符合要求的序列，再對其進行生物信息學分析。

1.2.7 酵母陽性克隆回轉驗證 依據比對結果，將劃線于SD-TLH+適宜濃度 3AT缺陷型平板上長出的陽性克隆轉化子分別用無菌水稀釋后點至SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+20 mmol/L 3AT缺陷平板，30℃恒溫培養3-4 d，驗證酵母陽性克隆菌落生長狀況。

2 結果

2.1 猴樟葉片RNA提取與質量檢測

為了鑒定所提取的RNA是否能用于下游建庫，從中分別吸取2 μL進行瓊脂糖電泳檢測和分光光度計測量，結果（圖1）顯示，圖片中能清晰地看到28S和18S兩條帶，5S條帶很弱甚至無，表明所提RNA完整性好，無降解。OD260/OD280在1.8-2.2之間，表明RNA純度高。因此，所提取RNA可用于下游建庫。

圖1 RNA提取電泳圖Fig.1 RNA sample assessment

2.2 ds cDNA均一化與小片段去除

為了判斷所獲得的ds cDNA是否合成，PCR結束后取5 μL進行瓊脂糖電泳檢測，結果（圖2）顯示，圖片中ds cDNA呈現彌散條帶，表示合成的cDNA質量較好，各個大小的條帶都有。為了驗證均一化與小片段是否去除，從純化后的溶液里吸取5 μL進行瓊脂糖電泳檢測，結果（圖3）顯示，圖片中ds cDNA呈彌散條帶，且無明顯亮帶，說明均一化成功；500 bp以下幾乎看不到條帶，表明小片段去除干凈。

圖2 ds cDNA瓊脂糖電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ds cDNA

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測均一化與去小片段Fig.3 Detection of normalization and removal of small fragments using agarose gel electrophoresis

2.3 克隆計數與文庫質量鑒定

為了確定文庫庫容，從電轉孵育后的菌液中吸取10 μL稀釋10 000倍，從中吸取100 μL涂布與含氨芐的LB平板，37℃倒置過夜培養，第2天取出平板后，劃線把平板平均分成4份。統計其中任意一份的克隆數目，結果約為122個/份，得到平板上克隆總數約為488個，根據公式：文庫庫容（CFU/mL）=克隆數/涂布體積×稀釋倍數，總克隆數（CFU）=庫容×菌液總體積，得到庫容為4.88×107CFU/mL，總克隆數為9.76×107CFU，該庫容量能夠保證酵母單雜交篩選得到可靠結果。為了檢測所構建文庫的條帶分布情況，從平板上隨機挑選24個克隆進行菌落PCR，引物為T7-F/AD-R（表1），PCR結束后取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖4），從圖中可知，所有泳道均有條帶，cDNA片段重組率為100%，且條帶在1 000 bp上下出現，說明文庫片段平均大小在1 000 bp。

圖4 文庫質量鑒定電泳圖Fig.4 Library quality assessment using agarose gel electrophoresis

2.4 猴樟CbP5CS基因啟動子克隆與序列分析

以猴樟根系總DNA為模板克隆 CbP5CS基因啟動子，經測序鑒定該序列長2 012 bp。利用Plant-CARE數據庫在線分析 CbP5CS基因啟動子的順式作用調控元件（表2）。結果顯示，共預測到15種順式作用調控元件和3種未知功能順式作用調控元件，包括CAAT-box和TATA-box組成型調控元件；光響應調控元件AE-box、AT～TATA-box、Box4、G-Box、TCCC-motif和GT1-motif；茉莉酸甲酯（MeJA）響應調控元件CGTCA-motif和TGACG-motif；脫落酸響應元件ABRE；厭氧誘導必需調控元件ARE；分生組織表達響應元件CAT-box；乙烯響應元件ERE；轉錄因子MYB和bHLH響應元件MYB、MYB-like sequence、MYC、Myb和Myb-binding site；赤霉素響應元件P-box和TATC-box；水楊酸響應元件SARE和TCA-element；壓力響應元件STRE；愈傷調節響應元件WRE3和WUN-motif。

2.5 誘餌質粒pHIS2-CbP5CS構建與自激活檢測

取轉化了誘餌載體的大腸桿菌菌液進行PCR擴增，將產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定，并對擴增得到陽性條帶的克隆質粒進行抽提和測序。結果（圖5）表明，菌落PCR結果與測序結果一致，條帶正確，說明CbP5CS啟動子片段連接到了表達載體pHIS2上。

圖5 誘餌質粒pHIS2-CbP5CS 菌落PCR鑒定Fig.5 Colony PCR identification of decoy plasmid pHIS2-CbP5CS

3AT是酵母HIS3蛋白合成的競爭性抑制劑，用于抑制His3基因的泄漏表達。由于HIS3報告基因的激活，陽性對照理論上在添加3AT抑制劑的平板上能正常生長，轉化子數量與不添加3AT相同，但是實際觀察到的生長值是比不添加3AT的平板降低約10%，并且隨著3AT濃度增加，降低率會增長。由自激活檢測結果（圖6）看出，在添加20 mmol/L 3AT 的平板上轉化子生長沒有菌落生長，顯示未激活HIS3報告基因，因此決定在20 mmol/L 3AT的基礎上進行酵母單雜篩選。

圖6 自激活檢測背景篩選和最小3-AT濃度Fig.6 Auto-activation detection background screening and minimal 3-AT concentration

2.6 酵母單雜交篩選候選基因

從SD-T平板挑取單克隆菌種接于50 mL液體SD-T培養基上，于30℃、225 r/min條件下振蕩培養18 h。轉接于500 mL液體YPDA培養基上，使初始OD600=0.2，再于30℃、225 r/min條件下振蕩培養4-5 h，至OD600=0.6。文庫DNA轉化后，從中取20 μL培養物梯度稀釋后涂效率平板SD-TL 1塊。其余涂SD-TLH+20 mmol/L 3AT共20塊，30℃恒溫培養3-4 d，觀察轉化結果。將上述SD-TLH +20 mmol/L 3AT篩庫平板上長出的初始陽性轉化子劃線于SDTLH+20 mmol/L 3AT選擇平板，30℃恒溫培養3-4 d。篩庫結果表明，篩庫的SD-TLH+20 mmol/L 3AT平板上生長出96個單克隆菌落（圖7）。將96個陽性酵母克隆全部PCR擴增，經過Seqman、BLAST比對，去除空載和重復序列最終獲得31個不同的序列（圖8）。

圖7 酵母單雜交篩庫結果Fig.7 Library results screened by yeast one hybrid

圖8 陽性酵母克隆比對結果PCR擴增圖Fig.8 Colony PCR amplification of the positive yeast cloning alignment

2.7 候選基因的生物學信息分析

對NGS測序獲得的31條EST序列在GenBank數據庫中進行BLAST搜索，篩選出期望值e-10以下的序列進行同源對比和功能注釋（表3）。結果表明，30條EST被功能注釋，另有1條為未能成功注釋；在獲得注釋的互作蛋白中，共有6個轉錄因子基因，分別為GW020491（鋅指CCCH結構域蛋白25異構體 x1）、GW028183（AtbHLH104）、GW000650（轉錄因子 TFIIIC）、GW007525（RING/FYVE/PHD鋅指超家族蛋白）、GW015686（GATA型鋅指轉錄因子家族蛋白）、GW027120（AtbHLH96）；從Read Count 讀數來看，GW028183、GW007525和GW027120基因與CbP5CS基因互作的可能性較高。

表3 EST序列比對結果Table 3 EST blast and annotation results

2.8 酵母陽性克隆回轉驗證

將上述劃線于SD-TLH+20 mmol/L 3AT缺陷型平板上長出的陽性克隆轉化子分別用無菌水稀釋，點至SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+20 mmol/L 3AT缺陷平板，30℃恒溫培養3-4 d。結果（圖9）表明，篩選得到的31個陽性克隆均能在SD-TL、SD-TLH、SDTLH+20 mmol/L 3AT缺陷型平板上生長。

圖9 酵母陽性克隆回轉驗證Fig.9 Rotation and confirmation of yeast positive colonies

3 討論

3.1 鹽堿脅迫誘導的猴樟根系酵母cDNA文庫構建

轉錄因子通過與其調控的基因啟動子區的相關順式作用元件進行特異性結合，來達到直接調控植物靶基因的轉錄表達，在植物生長發育、次生物質代謝和抗逆反應中起到重要的作用。酵母單雜交技術通常用于篩選與鑒定轉錄因子與下游基因啟動子的物理結合，以cDNA酵母文庫構建為核心，篩選與誘餌DNA特異結合的轉錄因子，從而獲得調控蛋白基因。人們通常采用cDNA文庫的代表性和重組序列的完整性指標對文庫的質量進行評價，文庫的代表性可用文庫的庫容量來反映，表征來源組織中所表達的遺傳信息（即mRNA）的完整性程度，當cDNA文庫中獨立重組子的克隆總數量即文庫滴定濃度大于等于1.7×105CFU/mL時，此文庫被稱為有效文庫，文庫滴定濃度大于等于1×106CFU/mL時，此文庫滿足低豐度mRNA的篩選要求。植物cDNA長度為0.5-3 kb之間，一般情況下會大于或等于1 kb，文庫插入片段過小或過大都會對文庫質量造成一定的影響，只有插入的cDNA片段大小接近全長cDNA片段時，文庫所體現的遺傳信息才更完整。本研究以猴樟根系組織為材料，利用SMART 技術成功構建了堿脅迫誘導的酵母單雜交核三框cDNA文庫，文庫滴定濃度約為4.88×107CFU/mL，文庫插入片段平均長度在1 000 bp左右，cDNA片段重組率為100%，符合cDNA文庫完整性、高質量的要求，可用于后續的酵母雜交試驗。

3.2 猴樟CbP5CS基因啟動子克隆與序列分析

高等植物的脯氨酸生物合成在滲透脅迫條件和低氮條件下以Glu途徑為主導，P5CS被認為是脯氨酸合成的關鍵基因［8］。Ca2+/CaM、H2O2、NO、ABA、H2S和SA等信號分子可誘發高等植物中脯氨酸的大量積累［19］。本研究以沉水樟基因組為參考基因組進行猴樟鹽堿脅迫誘導的轉錄組分析，篩選出鹽堿處理后顯著上調表達的脯氨酸合成酶基因CbP5CS，根據沉水樟基因組中的CmP5CS基因上游2 000 bp序列克隆出啟動子序列，通過分析共預測到15種已知功能的順式作用調控元件和3種未知功能順式作用調控元件，其中包含了多個參與光響應、茉莉酸甲酯（MeJA）響應、脫落酸響應、厭氧誘導響應、乙烯響應、赤霉素響應、水楊酸響應、愈傷調節響應、壓力響應的元件及多個轉錄因子MYB 和bHLH 結合位點?？梢酝茰yP5CS的轉錄表達與光照、MeJA、SA、ABA、GA、乙烯、缺氧、損傷和環境脅迫有關，其轉錄表達可能受到MYB、bHLH等轉錄因子的調控。

3.3 猴樟CbP5CS基因上游調控因子篩選

目前，已在很多植物中發現調控脯氨酸代謝的轉錄因子，但不同植物之間在脯氨酸合成調控機制方面存在差異。本研究結合酵母單雜交技術和NGS測序技術獲得了6 個調控猴樟脯氨酸合成的轉錄因子，包括4 個鋅指蛋（zincfinger protein, ZFP）和2個bHLH 轉錄因子。ZFP因具有指狀結構特征且能與鋅結合而得名，是真核生物中最重要的轉錄因子之一，在植物的基因表達與調控、生長發育與衰老、非生物脅迫及生物脅迫等過程中發揮著重要的作用。據報道，擬南芥中的AtZFP1在鹽堿脅迫下上調表達，過表達AtZFP1植株比對照擁有更高的K+、K+/Na+、葉綠素和脯氨酸含量以及更低的Na+和MDA含量［20］。在另一項研究中，ZFP182的過度表達促進了轉基因水稻中游離脯氨酸和可溶性糖等滲透劑的積累［21］。bHLH超家族以其高度保守的堿性/螺旋-環-螺旋結構域命名，在梨、蘋果、李子、水稻、小麥中和玉米中均鑒定出大量的bHLH基因在植物非生物脅迫響應中起作用［22-24］。Verma等［10］發現鹽脅迫通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯反應激活AtMYC2，AtMYC2可以與限速酶基因P5CS的啟動子結合，調節脯氨酸的生物合成。在鹽和干旱脅迫下，過表達AHDHL導致黃酮生物合成、脯氨酸生物合成和活性氧清除相關基因上調［25］。Zhang等［26］發現CabHLH035能與P5CS的啟動子結合，促進鹽脅迫下辣椒（Capsicum annuum）體內脯氨酸含量提高。這暗示ZFP和bHLH家族轉錄因子均有可能通過調控脯氨酸的合成，從而提高植物耐鹽堿性。

4 結論

構建了鹽堿脅迫誘導的根組織酵母cDNA文庫，克隆出CbP5CS啟動子序列，采用Y1H酵母單雜交技術篩選出與CbP5CS啟動子存在互作的蛋白，并通過高通量測序技術鑒定出6個與CbP5CS啟動子存在互作的轉錄因子，包括4個ZFP和2個bHLH轉錄因子。推測ZFP和bHLH家族轉錄因子均有可能通過調控脯氨酸的合成代謝，從而提高植物耐鹽堿能力。