苦豆子藥材提取過程中成分的量變規律研究

吳永超,張天宇,孫 悅,齊六衛,閆 琰*

(1.沈陽偉嘉生物技術有限公司,沈陽 110027;2.沈陽藥科大學,沈陽 110016)

苦豆子SophoraalopecuroidesL.是一種廣泛分布在新疆、內蒙古、寧夏等地的多年生荒漠植物[1],具有耐旱[2]、耐鹽堿[3-4]、適應性強的特點。苦豆子藥材為豆科植物苦豆子SophoraalopecuroidesL. 的種子,其中含有生物堿、多糖、黃酮類、揮發油、有機酸等多種活性成分[5-6],具有清熱燥濕,抗病毒[7-8]、抗菌[9-11]、止痛、抗炎[12]、殺蟲[13]、抗腫瘤[14-15]、抗腹瀉的作用。其中國內外學者研究比較多的成分為生物堿,已經鑒定出三十多種[16-17],主要含有金雀花堿[18]、槐定堿[19]、氧化苦參堿[20]、氧化槐果堿[21]、N-甲基野靛堿、苦參堿[22-23]、槐果堿[24]等多種生物堿成分,其種子中總生物堿含量為8.11%[25]。參考多篇文獻整理發現苦豆子生物堿提取工藝一般采用酸水提取和乙醇超聲提取,很少有報道研究直接水提工藝的生物堿成分變化規律[26-28]。

研究采用以水作為提取溶媒,系統研究不同浸泡時間、提取時間和提取次數對苦豆子藥材7種生物堿成分的提取效率的影響,通過HPLC法測定不同提取液的7種生物堿成分(金雀花堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基野靛堿、苦參堿、槐果堿)[29-31],揭示隨浸泡時間、提取時間和提取次數變化苦豆子提取液中7種生物堿成分的量變規律,為更加有效的利用苦豆子提供數據支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀、DAD檢測器(美國Agilent公司);PS-40AD型數控超聲波清洗器(深圳市科潔超聲科技有限公司);HH-4B數顯恒溫水浴鍋(常州榮華儀器制造有限公司);ME55型電子天平(METTLER TOLEDO公司)。

1.2 試藥 對照品分別為苦參堿(110805-202010,純度為98.7%)、氧化苦參堿(110780-202210,純度為92.8%)、槐果堿(112052-202001,純度為91.8%)和氧化槐果堿(111652-202202,純度為93.1%)購自中國藥品生物制品檢定所,金雀花堿(wkq22062209,純度≥98%)和N-甲基野靛堿(wkq23013007,純度≥98%)購自四川省維克奇生物科技有限公司,槐定堿(21061703,純度98.56%)購自成都格利普生物科技有限公司;乙腈、乙酸銨為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純;苦豆子購于亳州星嘉中藥原料有限公司,經鑒定為苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)的干燥種子。

2 方法和結果

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 色譜條件 色譜柱納譜分析ChromCore BRC18(150 mm×4.6 mm,3 μm);以乙腈(A)-0.1%乙酸銨(B)為流動相,洗脫梯度(0～5 min,95%B;5～20 min,70%B);檢測波長220 nm;流速為0.8 mL/min;進樣量10 μL;柱溫30 ℃;理論塔板數按氧化槐果堿計,應不低于4000。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品金雀花堿0.00628 g、槐定堿0.00730 g、氧化苦參堿0.00617 g、氧化槐果堿0.00553 g、N-甲基野靛堿0.00712 g、苦參堿0.00690 g、槐果堿0.00565 g,置于25 mL容量瓶中,用70%乙醇溶解并定容至刻度,制備成濃度為金雀花堿0.2512 mg/mL、槐定堿0.2920 mg/mL、氧化苦參堿0.2468 mg/mL、氧化槐果堿0.2212 mg/mL、N-甲基野靛堿0.2848 mg/mL、苦參堿0.2760 mg/mL、槐果堿0.2260 mg/mL的混合對照品溶液,備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取苦豆子提取液20 mL,置于蒸發皿中水浴蒸干,殘渣加70%乙醇溶解,定容到2 mL量瓶中,搖勻,過濾,即得。

2.1.4 線性關系考察 分別精密量取“2.1.2”項下制備的混合對照品溶液200 μL、300 μL、500 μL、1 mL、2 mL、5 mL、7.5 mL,置于10 mL容量瓶中,加70%乙醇稀釋至刻度,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。按“2.1.1”項下色譜條件進行測定,以每種生物堿對照品濃度為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得到7種生物堿的線性回歸方程、r值以及線性范圍,實驗結果見表1。

表1 7種生物堿的線性方程、相關系數(r)和線性范圍Tab 1 Linear equations,correlation coefficients(r)and linear ranges of seven kinds of alkaloids

2.1.5 精密度試驗 按“2. 1.1” 項下色譜條件,進樣10 μL,重復進樣6次,分別計算7種生物堿的峰面積的RSD值,結果見表2。

表2 7種生物堿精密度、重復性、穩定性和加樣回收率實驗結果(n=6)Tab 2 Experimental result of precision,repeatability,stability and average recovery of 7 alkaloids. (n=6)

2.1.6 重復性試驗 精密稱取6份同一批樣品,按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,用0.22 μm的有機系微孔濾膜過濾至進樣瓶中,進樣10 μL,分別計算7種生物堿的峰面積的RSD值,結果見表2。

2.1.7 穩定性試驗 取“2.1.6重復性試驗”項下供試品①,按照“2.1.1”項下色譜條件分別在 0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣10 μL,分別計算7種生物堿峰面積的RSD值,實驗結果見表2。

2.1.8 加樣回收率實驗 分別精密量取已知7種生物堿含量的樣品溶液6份,每份10 ml,每份樣品溶液分別加入金雀花堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基野靛堿、苦參堿、槐果堿,精密稱定,加入的量與已知樣品溶液中所含成分比例約為1∶1,混合均勻,按“2.1.3”項下供試品溶液的制備方法制備供試液,0.22 μm微孔濾膜過濾,按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,分別記錄峰面積,并計算回收率,加樣回收率實驗結果見表2。

2.2 水提工藝研究

2.2.1 不同浸泡時間考察 精密稱取100 g苦豆子藥材7份,每份加入8倍量的水,分別浸泡1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h,取樣,300目濾布過濾,得到不同浸泡時間的提取液,平行制備3份,分別量取并記錄提取液體積。

2.2.2 不同提取時間考察 取苦豆子200 g,精密稱定,加入8倍量水,浸泡4小時,分別提取1、2、3、4 h,300目濾布過濾,得到不同提取時間的苦豆子藥材提取液,平行制備3份,分別量取并記錄提取液體積。

2.2.3 不同提取次數考察 取苦豆子200 g,精密稱定,加入8倍量水,浸泡4小時,分別提取1、2、3、4次,每次提取2小時,300目濾布過濾,得不同提取次數的苦豆子提取液,平行制備3份,分別量取并記錄提取液體積。

2.3 結果 參照“3.1.3供試品溶液的制備”“3.1.1色譜條件”方法制備“3.2提取條件研究”項下所有提取液供試品溶液并檢測提取液中的金雀花堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基野靛堿、苦參堿、槐果堿的含量,苦豆子提取液供試品溶液高效液相色譜圖如圖1所示,不同浸泡時間、提取時間、提取次數的7種生物堿的結果如圖2所示。

注:1.金雀花堿;2.槐定堿;3.氧化苦參堿;4.氧化槐果堿;5.N-甲基野靛堿;6.苦參堿;7.槐果堿。圖1 苦豆子混合對照品溶液(A)和供試品溶液(B)的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC Chromatograms of mix standard solution(A)and test solution(B)of Sophora alopecuroides L

圖2 不同浸泡時間(A)、提取時間(B)和提取次數(C)苦豆子藥材水提的7種生物堿成分趨勢圖Fig 2 Trend of 7 alkaloid components in water extraction of Sophora alopecuroides with different soaking time (A), extraction time (B) and extraction times (C)

如圖2A所示,浸泡時間為1～6 h,隨著浸泡時間的增加,水提液中金雀花堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基野靛堿、苦參堿只有少量增加,氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐定堿增加明顯,且在浸泡3 h達到最高點,3 h之后,隨著時間的增加,氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐定堿均開始下降明顯,說明浸泡時間不能超過3 h;如圖2B 所示,苦豆子藥材提取時間為1～4 h,隨著提取時間延長,金雀花堿基本保持不變,除金雀花堿外其他6種生物堿成分均逐步增加,在提取3 h到達頂點,3 h之后開始下降,說明每次提取時間不能超過3 h;如圖2C所示,提取次數為 1～4次時,隨著提取次數增加,苦豆子中被提出的7種生物堿的量越多,但增長的趨勢在逐步減緩。

3 討 論

我國的苦豆子總產量占世界的62%[32],廣泛分布于我國的沙漠地區,是生長于沙土上耐鹽的多年生草本根莖地下芽植物,具有較強的生命力與繁殖力,植株特別是果實味極苦,青綠狀態下野生動物及畜禽均不采食,因而自然環境中儲備量較大,經適口性改良后,可用于畜禽預防、治療使用[33]。文中檢測的苦豆子中7種生物堿成分,屬于喹諾里西啶生物堿類成分,具有抗病毒、抗炎、抗潰瘍、抗腹瀉等功效[33-34],文獻報道,可明顯改善畜禽養殖過程中的仔豬、羔羊腹瀉。

研究采用高效液相色譜法,以水作為提取溶媒,研究不同浸泡時間、不同提取時間、不同提取次數對苦豆子藥材水提液中7種生物堿成分的量變規律,發現浸泡時間對氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐定堿影響明顯,且浸泡時間不宜超過3 h;提取時間對除金雀花堿外的其他6種生物堿的量有增加,且提取超過3 h后開始下降;隨著提取次數的增加,提取出的7種生物堿的量也在逐步增加。

實驗結果顯示,苦豆子中生物堿類成分的含量,對提取工藝的各個因素比較敏感,需精確控制提取條件,可為苦豆子生物堿成分的利用和實際生產中的苦豆子水提工藝提供科學依據,同時對于其他含有生物堿類成分的藥材,也具備一定參考價值。在實際應用當中,需綜合考慮生物堿類成分含量、能耗損失等因素,確定具體生產條件。