尼帕病毒檢測技術研究進展

李芳韜,徐 璐,夏應菊,趙俊杰,鄒興啟,劉業兵

(中國獸醫藥品監察所,國家豬瘟參考實驗室,北京100081)

尼帕病毒(Nipah virus, NiV)是副粘病毒科亨德拉尼帕病毒屬的一種人畜共患的高致病性病毒[1-2]。為單股負鏈不分節段RNA病毒,病毒呈圓形或多形性,由囊膜和核衣殼組成[3]。NiV基因組全長約18.2 kb,包含6個編碼基因,分別編碼融合糖蛋白(F)、附著糖蛋白(G)、基質蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)、長聚合酶(L)、磷酸蛋白(P)等9種蛋白[4]。NiV的自然宿主是果蝠,豬作為重要的中間宿主,被攜帶NiV的果蝠或其污染物感染后,從而再將NiV直接或間接傳染給人類或狗、貓、馬、羊等其他易感動物[5]。因此,豬在NiV的傳播過程中具有重要意義。

NiV自1999年首次在馬來西亞被發現后,主要在東南亞和南亞地區流行[6]。人感染NiV后,主要表現為腦炎癥狀,死亡率接近40%;豬群中爆發NiV疫情后,豬群感染率接近100%,發病率因年齡而異,仔豬病死率可達40%,癥狀主要表現為肺炎,部分發生中樞神經系統病變[7-8]。以往的研究中在豬的上皮細胞中檢測到NiV抗原,證明NiV可能在上皮細胞(如口鼻、上呼吸道和下呼吸道)復制[8]。除了上皮組織,還在豬體內檢測到低水平的病毒血癥[9],可以從人和豬的腦脊液中分離出病毒[8]。小血管和淋巴血管內皮細胞是NiV易感宿主的主要病毒靶點,血管系統的感染可通過血管外擴散導致NiV侵染多個器官,例如腦、肺或脾臟[10]。除了血管系統外,淋巴系統也是NiV感染的重要靶點,人、豬和貓的淋巴結、脾臟和胸腺中均可以檢測到NiV抗原,出現淋巴樣壞死和衰竭[11]。同時,大腦也是主要的靶器官,除了在血管末端及周圍平滑肌中檢測到NiV抗原,還有多種類型的腦細胞被感染,包括脈絡膜神經叢的神經元、膠質細胞、室管膜細胞、上皮細胞等;肺部是人類和豬的重要靶標,在心臟、腎臟、肝臟、子宮和胎盤中也檢測到NiV病毒[8]。

通過臨床癥狀,難以鑒別NiV與豬群中長期存在的呼吸道癥狀為主要表征的病毒。雖然目前我國人群及豬群中暫未發現NiV感染病例,但我國與NiV主要流行國家經濟貿易往來密切,并且已在我國蝙蝠體內也檢測到NiV抗體,所以我國存在NiV流行的潛在風險[12]。NiV的高發病率和高死亡率,對養殖業和公共衛生安全構成了重大威脅。目前,尚無NiV特異性治療藥物和疫苗[13],因此通過實驗室診斷技術持續監測NiV疫情對防控該病的爆發至關重要。

NiV的實驗室診斷方法主要分為血清學診斷方法和分子學診斷方法。傳統的血清學診斷方法主要包括酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immuno-sorbent assay,ELISA)和血清中和試驗[14]。分子學診斷方法主要包括一系列針對病毒核酸的檢測方法,主要包括聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法和核酸測序方法。本綜述闡述了近年來在NiV診斷技術方面的研究進展,并討論了新興診斷技術相較于傳統診斷技術的進步之處,為臨床樣本中NiV的鑒定和監測方法的更新換代提供參考,對監測NiV從國外的輸入情況、防控豬群NiV疫情發生以及守護公共衛生安全具有重大意義。

1 血清學診斷方法

NiV血清學傳統診斷方法主要包括ELISA和血清中和試驗,常用靶標為NiV的F蛋白、G蛋白和N蛋白。其中,血清中和試驗需要在生物安全四級實驗室中進行,是NiV實驗室診斷的“黃金”標準;ELISA是一種安全性好、敏感性高、特異性強和經濟實惠的診斷工具,可用于臨床樣本的大規模流行病學調查和持續監測[15]。目前,檢測NiV常用ELISA方法包括捕獲ELISA檢測IgM抗體和間接ELISA檢測IgG抗體[16]。以往研究表明,第一代間接ELISA結果存在非特異性反應,須由在生物安全四級實驗室中操作的血清中和試驗進一步確定ELISA結果,使NiV陽性樣本的篩選不具有普適性[17]。因此,開發和評價用于篩查NiV疑似病例的 ELISA新方法,有助于監測豬群NiV疫情以及制定公共衛生預防措施。隨著診斷技術的發展和進步,近些年來逐漸研發出更多適用于NiV疫情監測的新方法,對于新技術的開發使現有的血清學分析得以改進,主要包括以下技術:

1.1 基于重組蛋白的ELISA鑒別方法 由于NiV具有高度危險性,利用重組蛋白代替全病毒作為ELISA檢測抗原,可適用于臨床樣本的流行病學調查。NiV的G蛋白和N蛋白可以用于建立NiV間接ELISA檢測方法,進行陽性血清的篩選以及NiV與亨德拉病毒(Hendra Virus,HeV)的鑒別診斷。使用不同的表達系統表達HeV和NiV截短形式的G蛋白以及NiV的全長N蛋白,以這些重組蛋白為基礎,采用ELISA檢測豬血清中HeV或NiV特異性抗體[18],以達到鑒定NIV或HeV目的。因為HeV和NiV的交叉反應性,可以通過使用基于全長N蛋白的ELISA對血清進行初篩,然后再用基于截短G蛋白的ELISA區分HeV和NiV感染。但是HeV和NiV均屬亨德拉尼帕病毒屬,抗原之間密切相關,為了排除交叉反應與假陽性現象,仍需進行血清中和試驗才能確認為NiV陽性。

1.2基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA 采用基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA方法,可以用于檢測咽拭子、鼻拭子、腦脊液、尿液和血液中的NiV感染。經研究表明,該方法能夠更快速地診斷常規PCR方法無法檢測到的新型NiV[19]。雖然PCR是診斷NiV感染最敏感的技術,但當病毒變異后,可能會造成PCR鑒定方法失效。因此,這種基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA方法可以在血清學層面鑒定到新型NiV感染,補充傳統血清學方法和PCR方法在檢測過程中可能遺漏的陽性病例。

1.3 Luminex測定抗體法 血清學診斷方法除了傳統的ELISA和血清中和試驗診斷方法,還有一種Luminex測定法已開發用于NiV的血清學檢測,包括設計用于抗體檢測和鑒別的Luminex結合測定法,以及設計用于病毒中和的Luminex阻斷測定法[20]。該技術通過在不同熒光編碼的微球上進行抗原-抗體結合反應,運用激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的,一個反應孔內可以完成多種不同的生物學反應,可同時檢測上百種生物靶標,并且在數小時內完成檢測。通過對臨床樣本的篩選結果進行比較,結合測定法和阻斷測定法可以替代傳統的ELISA和血清中和試驗[17]。因此,Luminex測定法是一種快速、靈敏、特異的檢測臨床樣本血清中NiV的有效替代方法。并且該方法不需要在活細胞上培養病毒,無需在生物安全四級實驗室中進行,適用于臨床疾病診斷和流行病學監測可能需要的大批量操作條件[7]。

ELISA可以用來準確測定大批量生物樣品,但傳統ELISA只能分析一個目標分子,不具備同時分析多種目標分子的能力。在ELISA基礎上發展的Luminex測定法不僅可以替代傳統方法,還可以在一次實驗中完成對多種目標分子的分析,從而建立了更加高效、快速的分析平臺。

1.4 基于假病毒的中和試驗 由于NiV中和試驗不具有普適性,因此可以通過構建NiV假病毒,設計基于假病毒的NiV中和試驗。已有研究通過基因重組技術構建了單獨表達F或G蛋白的重組水泡性口炎病毒作為已知抗原,并在此基礎上建立了檢測NiV抗體的空斑抑制試驗;或利用基因重組技術構建了共表達F、G蛋白與綠色熒光蛋白(GFP)的重組水泡性口炎病毒,作為已知病毒抗原檢測NiV血清樣本。上述表達綠色熒光蛋白或熒光素酶的NiV假病毒被稱為第一代假病毒。在檢測過程中,基于NiV第一代假病毒的中和試驗仍需要特定的檢測設備以檢測熒光蛋白或熒光素酶。所以,在上述假病毒的基礎上,NiV第二代假病毒采用表達分泌型堿性磷酸酶的水泡性口炎病毒模型重組F和G蛋白,通過使用ELISA酶標儀測量上清液中的分泌型堿性磷酸酶活性,從而開發出一種新型的基于NiV假病毒的血清中和試驗檢測方法,其結果與傳統的活體NiV試驗獲得的抗體檢測結果一致[21]。

2 病原學診斷方法

分子學診斷方法主要包括一系列針對病毒核酸的檢測方法,除了傳統PCR方法外,還有實時熒光逆轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)、多重PCR、逆轉錄PCR和雙重套式RT-PCR等方法,以及多種核酸測序方法[20]。在臨床上,通過采集腦、肺、脾臟或淋巴結等組織,可用于NiV的初篩及進一步鑒定。針對NiV的M、N和P基因保守區域設計引物監測疑似NiV感染樣本,常用于東南亞地區爆發NiV疫情時的病毒鑒定[13]。其中,qRT-PCR作為目前應用最為普遍的分子學診斷方法[22],已被證明比傳統PCR靈敏1000倍,因此在多次疫情爆發時使用[19],其批間和批內差異小、重復性好、操作簡單、安全、快速,已成為病原分子診斷的金標準[7]。除了PCR方法外,還有更多新興分子學方法可以用于NiV診斷,主要包括以下技術:

2.1 Luminex測定核酸法 Luminex測定法除了可以應用于NiV的血清學檢測,還可以應用于NiV的核酸檢測,對HeV和NiV分離株進行檢測和鑒別,并且檢測靈敏度與qPCR相當[23]。已有研究通過利用低聚標記微球構建了用于HeV和NiV檢測和鑒別的多重鑒定方法,針對N蛋白和P蛋白編碼基因的多個位點構建Luminex測定法,使微球懸浮陣列系統能夠在一次反應中同時識別多個核苷酸靶標,其結果與已有的qPCR相比,Luminex測定法可明確鑒別HeV和NiV感染病例, 并且HeV檢測的敏感性與qPCR相當,具有較高的分析和診斷特異性和敏感性[23]。

2.2 二代測序 基于PCR結果的一代測序在過去NiV的發現和診斷中起關鍵作用,對NiV擴增產物的測序可以進一步證實檢測結果,并且對研究病毒基因突變和病毒基因演化方面具有重要作用。隨著二代測序的普遍應用,相比于一代測序大幅降低了經濟成本,并且在保持測序準確性的同時,大幅降低了測序時間。利用二代測序從初篩陽性的樣本中獲取NiV全長基因組,以及鑒定新型NiV毒株,是目前最快捷、有效的診斷與分析流程[24-25]。

隨著技術的進一步發展,具有巨大測序深度的高通量測序,在排除大量宿主及環境背景信息的干擾后能夠檢測到較小基因組的病毒,可以不進行PCR步驟、直接在臨床和環境樣本中檢測NiV核酸,為更加直接、精確地從樣本中鑒定NiV基因信息提供了技術支持。該深度測序診斷方法設計了基于生物素化RNA誘餌原理的病毒富集板,能夠特異性捕獲并富集宏基因組中的病毒信號,可顯著提高檢測背景信息復雜臨床樣品的敏感性,對于感染多種病原的樣本,能夠同時檢測到不同種病原的遺傳信息[26]。

3 小結與展望

血清中和試驗雖然是NiV實驗室診斷的“黃金”標準,但是在臨床采樣檢測和攻毒實驗中,血清中和試驗的檢測陽性率低于qRT-PCR和ELISA檢測陽性率[22,27]。ELISA試驗作為普遍應用的血清學檢測方法,無需在生物安全四級實驗室中即可進行檢測;然而,其敏感性和特異性略低于分子檢測技術,如RT-PCR、qRT-PCR和其他分子生物學方法,無法快速、敏感和特異性地檢測到NiV[13]。在NiV疫情再次爆發時,PCR方法和基因組測序結果對于NiV的遺傳學分析和分子特征研究是必不可少的,但是由于引物靶向序列的局限性,PCR診斷方法無法適應病毒的快速變異,可能會造成PCR鑒定方法失效。因此,只有將多種檢測方法相結合,才能更加快速、高效地診斷NiV,對防控豬群NiV疫情發生、監測NiV從國外的傳入情況以及守護公共衛生安全具有重大意義。

在目前的研究中,為了更精確的篩查臨床樣本中的NiV陽性病例,可先采用qRT-PCR方法初步篩選大量臨床樣本中的陽性樣本,再采用ELISA方法對陽性樣本的血清抗體進行進一步篩選及確認,最后利用二代測序(NGS)對組織和拭子樣本進行NiV的全基因組測序。隨著NiV假病毒相關研究的進一步發展,NiV的血清中和試驗無需在生物安全四級實驗室中進行,使血清中和試驗作為NiV實驗室診斷的“黃金”標準有望在日后進一步推廣;而具有巨大測序深度的高通量測序,能夠排除大量宿主及環境背景信息的干擾,并且可以不進行PCR步驟、直接在臨床和環境樣本中檢測NiV核酸,為更加直接、精確地從樣本中鑒定NiV基因信息提供了技術支持,也有利于NiV檢測進一步從實驗室推廣到臨床。

NiV的高發病率和高死亡率,對養殖業和公共衛生安全構成了重大威脅。目前,通過臨床癥狀難以鑒別NiV與豬群中長期存在的呼吸道癥狀為主要表征的病毒,為臨床診斷NiV造成了巨大困難。所以,在發展實驗室診斷技術的同時,應進一步簡化操作步驟,發展易于臨床操作的快速診斷分析技術,以降低我國NiV流行的潛在風險,防控該病的輸入與爆發。