干擾素基因刺激蛋白（STING）通路對乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細胞炎癥因子分泌及吞噬功能的影響

楊逸帆， 杜萬威， 王霞， 楊廣德， 李麗， 傅涓涓， 潘修成

徐州醫科大學附屬醫院感染性疾病科， 江蘇 徐州 221002

肝硬化是多種慢性肝病的共同階段，在我國HBV慢性感染是其主要病因。進展期肝硬化或失代償期肝硬化等晚期肝硬化階段往往伴隨突出的免疫功能障礙，被稱為肝硬化相關免疫障礙（cirrhosis-associated immune dysfunction，CAID）［1］。一方面表現為全身性炎癥反應，而另一方面表現為免疫功能低下［2］。

在肝硬化狀態下，腸源性脂多糖通過Toll樣受體（TLR）4激活單核巨噬細胞分泌大量炎癥因子被認為是系統性炎癥反應的主要機制［3-4］。近年研究［5-6］發現，微生物或宿主細胞來源的DNA通過環鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）誘導炎癥分子表達在機體抗感染免疫和系統性炎癥反應中發揮重要作用。

STING是調控Ⅰ型IFN基因表達的重要接頭蛋白。細胞內游離的雙鏈DNA在cGAS作用下，催化合成的環鳥苷酸-腺苷酸（cyclic GMP-AMP，cGAMP）直接激活STING蛋白，然后通過TANK結合激酶1（TBK1）介導IFN調節因子3核轉移進而誘導Ⅰ型IFN表達以及通過核因子-κB誘導IFN-β、IL-6和TNF-α表達［7-10］。

筆者前期研究［11-13］發現肝硬化患者肝組織單核/巨噬細胞STING表達明顯升高，這些細胞的激活導致血清促炎細胞因子水平增加，包括TNF-α、IL-6、Ⅰ型IFN和IL-17等。然而迄今為止，尚無關于肝硬化狀態下CAID與STING通路誘導的固有免疫應答之間關系的研究報道。本研究擬通過STING信號通路對乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細胞功能的影響，進一步闡明乙型肝炎肝硬化患者免疫失調的發生機制，從而為乙型肝炎肝硬化的免疫治療提供新的思路和靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2020年5月—10月于本院感染性疾病科住院治療的乙型肝炎肝硬化患者。納入標準：（1）HBsAg陽性，病程超過6個月；（2）肝硬化病史診斷明確，診斷標準參照2016年美國肝病學會的實踐指南［14］。排除標準：（1）混合感染HCV、HDV、HIV；（2）合并其他肝臟疾病，包括脂肪性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病、肝豆狀核變性與血色素沉積；（3）合并任何惡性腫瘤或其他嚴重慢性疾病；（4）孕婦；（5）無法對患者本人或法定代理人知情告知。另選取同期本院體檢中心健康體檢者作為對照。

1.2 材料 人外周血單核細胞分離液試劑盒（Solarbio，中國），IFN-α、IFN-β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（Elabsience，中國），2′，3′-cGAMP（Invitrogen，法國），STING抑制劑CCCP（Selleck，美國），Phagotest單核細胞吞噬活性定量測定試劑盒（Glycotope Biotechnology GmbH，德國）。

1.3 主要方法

1.3.1 外周血單核細胞的分離純化 分別采集乙型肝炎肝硬化患者和健康體檢者外周靜脈血，使用外周血單核細胞分離液試劑提取其單核細胞，重懸細胞后用單核細胞培養基以106個/mL的密度重懸細胞，將細胞鋪于細胞板中，置于細胞培養箱中進行貼壁培養2～4 h。除去細胞培養上清，加入含有2% EDTA和2%FBS的PBS，置于細胞培養箱中消化2～3 min，鏡下看到貼壁細胞形狀變圓后加入含10% FBS的RPMI1640終止消化，常溫離心細胞后重懸單核細胞。

1.3.2 單核細胞培養及處理 將乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細胞分為Control組、cGAMP組和cGAMP+CCCP組，Control組細胞加入等量的PBS后將細胞置于細胞培養箱培養12 h；后兩組細胞加入cGAMP（1 μg/mL），其中cGAMP+CCCP組于培養1 h后加入CCCP（l μmol/L）。留取培養上清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 ELISA法檢測細胞因子 根據ELISA試劑盒說明書分別檢測研究對象細胞培養上清IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α水平。

1.3.4 單核細胞吞噬實驗 采集乙型肝炎肝硬化患者與健康體檢者外周靜脈血3 mL，分為Control、cGAMP、cGAMP+CCCP三組，分別加入PBS（1 μg/mL）、cGAMP（1 μg/mL）、cGAMP（1 μg/mL）+ CCCP（l μmol/L）（培養1 h后加入CCCP）室溫靜置12 h。將熒光標記E.coli加入以上各組共同孵育。實驗嚴格按照Phagotest試劑盒說明書中的步驟進行操作。經處理后的樣本使用流式細胞儀分析單核細胞吞噬細菌能力。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件繪制統計圖。計量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 共納入乙型肝炎肝硬化患者35例（乙型肝炎肝硬化組），其中男19例，女16例，平均年齡（41.43±8.60）歲。納入健康體檢者10例（健康組），其中男6例，女4例，平均年齡（45.52±11.15）歲。兩組研究對象在年齡、性別方面差異均無統計學意義（P值均＞0.05）。

2.2 cGAMP誘導乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細胞炎癥因子的分泌 乙型肝炎肝硬化組外周血單核細胞接受cGAMP刺激后所分泌的IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α均顯著高于健康組（P值均＜0.05）（表1）。此外，cGAMP組IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α水平均明顯高于cGAMP+CCCP組和Control組（P值均＜0.05），而cGAMP+CCCP組與Control組比較，各炎癥因子水平差異均無統計學意義（P值均＞0.05）（表2）。

表1 cGAMP作用下乙型肝炎肝硬化患者和健康成人外周血單核細胞炎癥因子分泌水平比較Table 1 Comparison of inflammatory factor secretion levels in peripheral blood mononuclear cells of patients with hepatitis B cirrhosis and healthy adults under the effect of cGAMP

表2 cGAMP作用下乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細胞炎癥因子分泌水平Table 2 Inflammatory factor secretion levels in peripheral blood mononuclear cells of patients with hepatitis B cirrhosis under the influence of cGAMP

2.3 cGAMP刺激人外周血單核細胞后的吞噬殺菌能力 乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細胞在有或無cGAMP /cGAMP+CCCP處理下，吞噬細菌能力均較健康組顯著降低（t值分別為4.647、2.790、2.504，P值均＜0.05）（圖1）。而cGAMP或cGAMP+CCCP處理對乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細胞吞噬細菌能力均無明顯影響（P值均＞0.05）（圖2）。

圖1 不同處理情況下乙型肝炎肝硬化組和健康組外周血單核細胞吞噬細菌能力比較Figure 1 Phagocytic ability of peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatitis B cirrhosis and healthy people under different treatments

圖2 不同處理情況下乙型肝炎肝硬化患者外周血單核細胞吞噬細菌能力比較Figure 2 Phagocytic ability of peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatitis B cirrhosis under different treatments

3 討論

有研究［15-16］報道，從肝硬化特別是失代償期肝硬化患者外周血循環中檢測出DNA分子，主要來自于細菌或宿主細胞的裂解。因此理論上，肝硬化患者外周血單核細胞STING通路應該受到影響。筆者在前期的工作中發現，肝硬化患者外周血單核細胞STING蛋白表達較健康體檢者顯著升高，推測在肝硬化狀態下，外周血單核細胞STING通路可能參與全身炎癥反應的發生機制。

本研究以cGAMP刺激外周血單核細胞STING通路，結果顯示肝硬化患者外周血單核細胞分泌IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α水平均顯著高于健康組和Control組，進一步證實肝硬化狀態下外周血單核細胞STING通路處于高度活化狀態，對肝硬化狀態下全身炎癥反應的發生可能發揮了重要作用。同時，在STING通路被特異性抑制劑CCCP阻斷后，本研究發現IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α四種炎癥細胞因子的表達水平與cGAMP組相比均顯著下降，并且與Control組無顯著差異。提示可以通過特異性阻斷STING通路，進而減輕肝硬化狀態下的全身炎癥反應，這為今后晚期肝病全身炎癥反應綜合征的治療提供了新的選擇。

進展期肝硬化尤其是失代償期肝硬化為主的晚期肝病，往往伴隨CAID的出現［17-18］，一方面表現為全身性炎癥反應，另一方面表現為固有免疫和適應性免疫功能的低下或缺陷，增加了感染風險。其中固有免疫功能低下，主要表現為中性粒細胞、單核巨噬細胞等免疫細胞吞噬細菌能力下降［19］，其確切機制尚未完全清楚。Ashare等［20］研究證實了慢性肝病患者循環系統中性粒細胞和/或單核細胞的細菌清除功能受損。此外，肝硬化狀態下肝組織炎癥微環境和外周炎癥反應狀態影響了吞噬細胞殺菌能力。為進一步研究STING通路活化是否會影響肝硬化患者單核細胞的吞噬功能，本研究檢測了肝硬化患者外周血單核細胞的吞噬細菌能力，結果發現乙型肝炎肝硬化患者單核細胞吞噬細菌能力較健康成人顯著降低，與Bernsmeier等［21］研究結果一致，而STING通路激活或抑制對單核細胞吞噬細菌功能無顯著影響，提示肝硬化狀態下外周血單核細胞吞噬細菌功能低下，但是STING通路的激活與否對其無明顯影響。

綜上所述，本研究結果表明，外周血單核細胞STING通路的活化參與了乙型肝炎肝硬化狀態下全身性炎癥反應的發生機制，并可能發揮重要作用，這為乙型肝炎肝硬化患者免疫紊亂狀態的診斷和免疫治療提供了新的靶點。

倫理學聲明：本研究方案于2020年7月2日經由徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會審批，批號XYFY2020-KL075-01，入組患者均采取自愿原則，并簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：楊逸帆、杜萬威、潘修成負責課題設計；楊逸帆、杜萬威、李麗負責實驗操作，資料分析和撰寫論文；楊逸帆、李麗、王霞、楊廣德、傅涓涓參與收集數據，修改論文；潘修成負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。