三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腦組織炎性損傷的改善作用及機制

鐘瑞熙， 杜沅沁， 肖熹煜， 宋文選， 農耀斌， 朱榮火， 黃晶晶

1 廣西中醫藥大學研究生院， 南寧 530299； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院脾胃肝病科， 南寧 530299；3 廣西高發傳染病中西醫結合轉化重點實驗室， 南寧 530299

肝性腦病是慢性肝病和急性肝衰竭中常見且嚴重的并發癥，其表現為廣泛的神經或精神異常，包括僅能通過神經心理學或神經生理學評估檢測到的輕度認知障礙到明顯的定向障礙、意識模糊和昏迷［1］。乳果糖是肝性腦病的一線治療藥物，但其不良副作用包括嘔吐、腹痛腹瀉、脫水和電解質紊亂等，可能導致患者服藥依從性下降［2］。因此迫切需要開發出一種高效且不良副作用小的治療藥物。三黃瀉心湯由大黃、黃芩、黃連3味中草藥組成，現代藥理研究發現，三黃瀉心湯具有抗炎［3］、抗菌［4］、改善出血癥狀［5］等作用。方中單味藥大黃已被臨床用于灌腸治療肝性腦病，療效可觀［6］。因此，本研究通過觀察三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠生理病理指標的影響，初步探討其對肝性腦病大鼠腦組織炎性損傷的改善作用及機制，以期為制訂肝性腦病的中醫藥臨床用藥治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠30只，體質量（180±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［實驗動物生產許可證編號：SCXK（湘）2019-0004，實驗動物使用許可證編號：SYXK（桂）2019-0001］。飼養于廣西中醫藥大學SPF級動物實驗室內，室溫24 ℃，12 h光照晝夜循環，空氣流通，適應性喂養7 d，期間自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 三黃瀉心湯由大黃12 g，黃芩、黃連各6 g組成，所用“農本方”顆粒由廣西中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供。引物設計及合成（北京擎科生物科技有限公司）；硫代乙酰胺（北京謹明生物科技有限公司，批號T70013）；TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，批號ERC102a.96、ERC007.96、ERC003.96）；總蛋白提取試劑高效RIPA裂解液（北京Solarbio科技有限公司，批號R0010）；總RNA提取試劑trizo（l美國Invitrogen公司，批號155960296）；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）試劑盒（上海Novabio生物科技有限公司，批號F2202、F3528）；NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）蛋白抗體（美國Affinity公司，批號AF2006、AF5006）；β-肌動蛋白抗體、山羊抗兔二抗（安徽Biosharp科技有限公司，批號BL005B、BL003A）。

1.3 主要儀器 全自動生化分析儀Thermo Scientific Indiko（美國ThermoFisher公司）；紫外分光光度計NanoDrop（美國ThermoFisher公司）；熒光定量PCR儀qTOWER3G（德國Analytik Jena公司）；Varioskan LUX多功能酶標儀（美國ThermoFisher公司）；PowerPac Universal電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 動物模型的制備 C型肝性腦病是指發生于肝硬化等慢性肝損傷基礎上的肝性腦病。本實驗參考相關文獻［7］采用四氯化碳（CCl4）復合法構建大鼠肝硬化模型：將CCl4、花生油按2∶3比例混合配置成40%CCl4油溶液后于模型大鼠皮下注射，每周2次，持續9周。首周每次注射5 mL/kg，而后每次注射3 mL/kg。實驗期間搭配5%乙醇溶液自飲。之后采用硫代乙酰胺（TAA）法構建肝性腦病大鼠模型［8］：腹腔注射TAA溶液，連續3 d，1次/d，每次注射300 mg/kg。若大鼠出現反應遲緩、嗜睡、昏迷、共濟失調、自主活動時間減少現象之一，即為造模成功。實驗期間正常組大鼠正常飲食，造模大鼠造模成功后恢復正常飲食。

1.5 動物分組及給藥劑量 30只SD大鼠采用隨機數字表法完全隨機分為正常組、模型組、乳果糖組、三黃瀉心湯低劑量組和三黃瀉心湯高劑量組，每組各6只。根據人與大鼠換算公式換算中藥各組劑量，三黃瀉心湯低劑量組含生藥4.37 g/kg，相當于臨床等效劑量的3.5倍；三黃瀉心湯高劑量組含生藥8.74 g/kg，相當于臨床等效劑量的7倍；乳果糖組0.167 g/kg，相當于臨床等效劑量的5.5倍。造模成功后，乳果糖組、三黃瀉心湯低劑量組和高劑量組灌胃給予相應藥物；正常組與模型組灌胃給予等體積生理鹽水。給藥持續7 d。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 大鼠一般狀態觀察及行為學檢測 （1）實驗過程中每天觀察并記錄大鼠的身體狀況、精神狀態、體質量、飼料消耗等情況。（2）Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力。將直徑為1.5 m的黑色圓形水池（水溫19～22 ℃）均等分為4個象限，每個象限制作1個不同的標記用于大鼠辨別定位，在某一象限設置1個直徑10 cm的平臺隱匿于水下2 cm處，將水池用遮光布圍起，并在水中添加黑色顏料混勻，水池上方懸掛攝像機。定位巡航實驗：每天定于固定時間段訓練，訓練期持續5 d。從池壁4個起始點的任一點將大鼠面向池壁放入水池。攝像系統記錄大鼠找到平臺的時間和游泳路徑，4次訓練將大鼠分別從4個象限放入水中。大鼠找到平臺后或60 s內找不到平臺（潛伏期記為60 s），則由實驗者將其引導到平臺，在平臺上休息10 s，再進行下一次實驗。每日以大鼠4次訓練潛伏期的平均值作為其當日的學習成績。在造模后及給藥后各進行一次正式的定位巡航實驗。空間探索實驗：定位航行實驗結束后撤去平臺，在原平臺相對象限入水點將大鼠放入水中，記錄其120 s內游泳路徑并統計穿越平臺次數。空間探索實驗在給藥后進行一次。

1.6.2 標本采集及病理切片制作 （1）按照體質量比給予大鼠腹腔注射等比例的2%戊巴比妥鈉（0.03 mL/kg）深度麻醉，腹主動脈采血；取肝臟組織，截取回盲部后端結腸約10 cm，于冰上斷頭處死取腦組織，-80 ℃冰箱儲存備用。（2）所采部分腦組織、肝臟組織浸入4%多聚甲醛固定液24 h，脫水后石蠟包埋切片，HE染色法染色。切片制作完成后在光學顯微鏡下觀察（目鏡10×，物鏡20×）。選取目標區域進行拍照，分析。

1.6.3 大鼠血氨及肝功能指標測定 腹主動脈取全血后，取適量血液以肝素鈉抗凝，用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血氨水平。取適量血液常溫放置30 min后，以4 000 r/min離心10 min，分離上清液，保存于-20 ℃；用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中ALT、AST水平。

1.6.4 大鼠腸道pH值測定 準確稱取結腸內容物重量，并以1∶8的稀釋比例加入去離子水，用小型漩渦混勻器250 r/min混勻5 min，采用pH計檢測大鼠腸道pH值。

1.6.5 酶聯免疫吸附測定法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子水平 取適量血液，根據ELISA檢測試劑盒說明書進行操作。用酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度。根據標準孔繪制標準曲線，并通過標準曲線公式計算各組大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.6.6 大鼠腦質量及腦組織中含水量測定 腦組織取出后用預冷的磷酸鹽緩沖液沖洗，用濾紙吸干水分，稱重并記錄全腦質量（濕重量）。之后稱取一部分腦組織，置于60 ℃烘箱中，72 h后稱其干重量，計算含水量：含水量＝（腦濕重量-腦干重量）/腦濕重量×100%。

1.6.7 RT-qPCR檢測大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達 采用trizol法提取各組大鼠腦組織總RNA后反轉錄為cDNA，以此為模板通過RT-qPCR檢測TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達量；GADPH作為內參對其進行標準化，2-△△Ct分析其表達水平。引物序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.6.8 蛋白免疫印跡法檢測大鼠腦組織中NF-κB p65及其磷酸化蛋白的表達 取部分腦組織研磨后加入RIPA裂解液置于冰上裂解提取總蛋白，BCA法檢測腦組織蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，經80 V（0.5 h）、120 V（1 h）恒壓電泳后轉至PVDF膜，封閉液封閉2 h，加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min；加入HRP標記的二抗（1∶4 000）常溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；超敏發光液顯影曝光顯像，Image J軟件系統對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗或Dunnett’s T3法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠一般狀態的影響正常組大鼠精神狀況良好，動作敏捷；構建大鼠肝性腦病模型后，食欲不振，動作遲緩，皮毛發黃，生長發育遲滯，出現脫毛、嗜睡、昏迷等現象，極個別大鼠甚至共濟失調。經乳果糖及低、高劑量三黃瀉心湯灌胃治療后，大鼠均出現腹瀉癥狀，其中高劑量組程度較重；藥物灌胃后大鼠食欲逐漸恢復，脫毛、嗜睡、昏迷現象減少。

2.2 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠肝臟病理學的影響 正常組大鼠肝組織中肝小葉結構清晰、正常；模型組肝臟出現組織增生、肝小葉結構模糊、細胞排列紊亂、變性壞死、炎性細胞浸潤嚴重等現象；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組肝細胞變性壞死、炎性細胞浸潤、組織增生程度均得到改善，其中乳果糖組和三黃瀉心湯高劑量組改善較明顯（圖1）。

圖1 大鼠肝臟病理學改變（HE染色，×200）Figure 1 Pathological changes of rat liver （HE， ×200）

2.3 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠血氨及肝功能指標的影響 與正常組相比，模型組血氨水平及ALT、AST水平顯著增加（P值均＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠血氨水平及ALT、AST水平均明顯降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優于低劑量組（P值均＜0.05）（表2）。

表2 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠血氨及肝功能的影響Table 2 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on blood ammonia and liver function in rats with hepatic encephalopathy

2.4 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腸道pH的影響與正常組相比，模型組腸道pH值增加（P＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腸道pH值均降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優于低劑量組（P＜0.05）（圖2）。

圖2 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腸道pH的影響Figure 2 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on intestinal pH in rats with hepatic encephalopathy

2.5 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 與正常組相比，模型組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著增加（P值均＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優于低劑量組（P值均＜0.05）（表3）。

2.6 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腦部的影響

2.6.1 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腦部病理學的影響 正常組大鼠腦組織細胞結構正常完整、細胞核飽滿。模型組大鼠腦組織細胞結構排列紊亂、壞死，細胞核固縮，胞質減少；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腦組織細胞排列紊亂、壞死、細胞核固縮現象減輕，結構逐漸完整（圖3）。

圖3 大鼠腦部病理學改變（HE染色，×200）Figure 3 Pathological changes of rat brain （HE， ×200）

2.6.2 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠學習記憶能力的影響 與正常組相比，模型組大鼠尋臺潛伏期顯著增加，而穿臺次數顯著降低（P值均＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠用藥后尋臺潛伏期及穿臺次數均明顯改善（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優于低劑量組（P＜0.05）（表4）。

表4 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠學習記憶能力的影響Table 4 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on learning and memory ability of rats with hepatic encephalopathy

2.6.3 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腦質量、腦組織含水量的影響 與正常組相比，模型組腦質量、腦組織含水量均顯著增加（P值均＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腦質量、腦組織含水量均降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優于低劑量組（P值均＜0.05）（表5）。

表5 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腦質量、腦組織含水量的影響Table 5 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on brain mass and brain tissue water content in rats

2.6.4 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響 與正常組相比，模型組腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達均顯著增加（P值均＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達均降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優于低劑量組（P值均＜0.05）（表6）。

表6 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響Table 6 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on mRNA expression of TNF-α、IL-1 β、 IL-6 on brain tissue of rats with hepatic encephalopathy

2.6.5 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腦組織中NF-κB p65及其磷酸化蛋白表達的影響 與正常組相比，模型組腦組織中NF-κB p65磷酸化水平顯著增加；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腦組織NF-κB p65磷酸化水平均降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優于低劑量組（P值均＜0.05）（圖4）。

圖4 三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腦組織中NF-κB p65及其磷酸化蛋白表達的影響Figure 4 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on brain tissue of rats with hepatic encephalopathy in NF-κB p65 and its phosphorylated protein expression

3 討論

肝性腦病可分為三類，A型為急性肝衰竭相關肝性腦病，B型為門靜脈-體循環分流相關肝性腦病，C型為肝硬化相關肝性腦病［9］。目前研究［10］認為，高氨血癥是肝性腦病的主要發病機制，而炎癥反應、腸道微生態改變等多種機制可能共同參與并促進了肝性腦病發展。肝臟是人體最大的解毒器官，肝功能不全會導致血氨不能經尿素循環有效解毒，同時門體分流導致含有氨的門靜脈血流直接流入體循環并進入腦組織［11］。另一方面，全身炎癥反應可導致血腦屏障通透性增加，從而使氨及炎性因子更易進入腦組織，二者的協同作用導致星形膠質細胞腫脹，引起腦水腫［12］。同時，腦部積累的氨及炎性因子能夠激活小膠質細胞及星形膠質細胞中的NF-κB通路［13］。NF-κB通路的激活則會介導大量炎性因子的轉錄和翻譯，誘導腦部的炎癥反應，加重腦部炎性損傷，引起腦實質改變和腦功能障礙［14-15］。此外，腸道微生態也與肝性腦病發病關系密切。腸道微生態失衡時，腸道中的優勢菌生長被抑制，而內源性或外源性致病菌大量增殖［16］；小腸細菌過度生長則會導致腸道屏障完整性受損，促使細菌易位，釋放氨和內毒素進入血液循環并最終使腦部受損［17］。有研究［18］報道，肝性腦病患者的腸道微生物群相較于健康人群改變較大，潛在致病微生物群的相對豐度更高，其認知能力檢測和腦部MRI表現也更差，提示腸道微生態改變可能影響肝性腦病患者大腦功能。以上研究表明，肝性腦病是一種肝、腸、腦等多部位病變，多種機制協同致病的疾病，因此，有針對性的多靶點、多途徑治療手段或可有效改善肝性腦病患者腦部炎性損傷，進而對治療肝性腦病產生積極作用［19］。

中醫學并無“肝性腦病”病名，按其主要癥狀可歸為“昏厥”“厥逆”“肝厥”一類。此病多由濕、痰、瘀、熱諸邪交雜，上蒙清竅，元神失養所致，屬虛實夾雜之病，治法多清熱解毒，化痰開竅，兼以補虛［20］。三黃瀉心湯出自張仲景《金匱要略》，全方由大黃二兩、黃芩一兩、黃連一兩，共3味中草藥組成，功可瀉火解毒，燥濕泄熱［21］。方中大黃、黃連歸肝經，黃芩歸膽經，清肝熱，解肝毒，可減輕肝臟負擔，改善肝臟功能；三藥皆歸大腸經，且重用大黃兼能瀉下，可清潔腸道從而減少腸道內細菌及其代謝產物，并通過改變腸道微生態，減少氨的產生，促進氨的排出。全方針對肝性腦病“肝-腸-腦”軸發病的特點，從肝臟、腸道兩方面著手治療，有效減輕有害物質積累對腦組織的損害，可謂效宏力專。

本實驗結果顯示，相較于模型組，三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠肝臟病理切片中肝細胞變性壞死、炎性細胞浸潤、組織增生程度均得到不同程度改善，ALT、AST水平均顯著降低，表明三黃瀉心湯的使用有助于改善肝性腦病大鼠肝功能；三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠灌服藥物后均出現不同程度腹瀉，且腸道pH值較模型組降低并趨近正常組，產生與乳果糖類似的效果，提示三黃瀉心湯可通過促進排泄及時清除有害物質，重塑腸道微環境并改變腸道微生態。以上因素的協同作用可能是導致三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠血氨水平較模型組明顯降低的重要原因。另一方面，三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平也較模型組顯著降低，表明三黃瀉心湯具有抗炎作用［22］。有關三黃瀉心湯抗炎作用的研究［23］進一步表明，其發揮抗炎作用的有效成分主要是大黃酸、大黃素、黃芩苷、小檗堿等。已有研究［24］證實，氨與炎性因子在大腦中的積累會促進肝性腦病發生發展，并決定其嚴重程度。而三黃瀉心湯可通過降低血液中氨與炎性因子水平以減少流向腦部的有害物質積累，進而減輕腦部的炎性反應，這將有助于改善肝性腦病大鼠腦組織炎性損傷。

三黃瀉心湯對肝性腦病大鼠腦部的改善作用初步表現在：相較于模型組，三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠服藥后嗜睡、昏迷等癥狀好轉，其腦部病理切片中腦組織細胞排列紊亂、壞死、細胞核固縮現象減輕，結構逐漸完整；在檢測大鼠學習記憶能力的Morris水迷宮實驗中，三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠在尋臺潛伏期與穿臺次數方面較模型組明顯改善。對腦組織的進一步檢測顯示，相較于模型組，三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腦部炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達，以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著降低，與以往的實驗結果［25］相同。本研究結果表明三黃瀉心湯可通過抑制肝性腦病大鼠腦部炎性因子轉錄及NF-κB p65磷酸化，有效改善肝性腦病大鼠的腦組織炎性損傷。

綜上，本研究結果表明三黃瀉心湯能改善肝功能及腸道微環境，減輕血氨和炎性因子在腦部積累所導致的炎性反應，從而有效改善肝性腦病大鼠腦組織炎性損傷，其作用機制與抑制肝性腦病大鼠腦部炎性因子轉錄水平及NF-κB p65磷酸化有關。本研究初步闡明了三黃瀉心湯治療肝性腦病的作用機制，為進一步研究三黃瀉心湯治療肝性腦病提供了實驗依據，對于將傳統中醫藥與科學技術相結合的中醫藥現代化事業也具有積極意義。但由于目前三黃瀉心湯治療肝性腦病的效果仍缺乏可靠臨床研究支持，并需要明確不良反應與禁忌，故其臨床應用和推廣工作仍任重道遠。

倫理學聲明：本研究方案于2022年4月15日經由廣西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批，批號：DW20220408-054，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：鐘瑞熙負責研究的思路設計及文章初稿撰寫；杜沅沁對研究數據獲取分析解釋過程有關鍵貢獻；肖熹煜、宋文選、農耀斌、朱榮火參與了研究數據的獲取過程；黃晶晶負責指導撰寫、修改文章及提供研究經費支持。