穿膜肽修飾的PHBHHx負載紫杉醇遞藥系統構建

劉煥迪， 杜 潔， 張紅蕾， 張路路， 李 瑋

（1.河北大學藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室，化學國家級實驗教學示范中心，化學與材料科學學院，河北 保定 071002；2.河北牧群生物科技有限公司，河北 保定 071002）

0 引言

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一種從紅豆杉屬植物的樹皮中提取分離出來的具有廣譜抗癌活性的二萜類化合物［1］，是繼阿霉素和順鉑之后的一類新型抗癌藥物，廣泛用于乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、食管癌等多種腫瘤的治療［2-4］。然而，PTX在臨床應用上的治療效果因其疏水性、高毒性和低生物利用度而受到限制［5］。研究人員利用脂質體［6］、殼聚糖［7］、聚合物膠束［8］等作為載體遞送紫杉醇，具有增加藥物穩定性和延緩藥物釋放，實現藥物靶向輸送的設計優勢。但是，遞送載體本身存在生物相容性差，降解產物導致正常細胞炎性等問題，影響其在臨床上的廣泛應用。因此選擇一種安全無毒且有效的遞送載體，對PTX 新制劑具有重要的臨床意義。

聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一類由多種微生物胞內發酵合成的生物可降解高分子材料，具有良好的生物可降解性、生物相容性，被廣泛應用在生物醫學領域［9］。3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate，PHBHHx）是PHA家族在生物醫學領域應用中較為廣泛的一種，其降解產物對細胞和組織沒有任何毒性［10］。已有研究利用PHBHHx 作為載體對雷帕霉素［11］、阿霉素［12］進行遞送，表現出了優異的生物相容性及藥物緩釋效果。

本文以生物可降解材料PHBHHx 包載疏水性藥物PTX，制備可安全降解的PHBHHx負載PTX（PTX@PHBHHx）納米微球。并對所制備的納米微球的尺寸、包封率和載藥量進行評估與優化。將具有強穿膜特性的富精氨酸多肽（Arginine-rich polypeptide，RALA）與PHA 顆粒表面結合蛋白［13］（Polyhydroxyalkanoates granule binding protein，PhaP）進行融合表達并純化獲得融合蛋白（PhaP-RALA）。PhaP-RALA 與PTX@PHBHHx納米微球通過自組裝的方式相結合，構建穿膜肽修飾的PHBHHx負載PTX藥物遞送系統（PTX@PHBHHx-PhaP-RALA）。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

（1）試劑。PTX（98%），麥克林；PHBHHx（99.4%），北京藍晶微生物；吐溫-20（99%）、氨芐青霉素（99%），BBI 生命科學；聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）（97%），天津大茂；曲拉通X-100（TritonX-100）（99%）、聚丙烯酰胺（99%）、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒，生工生物工程；甲醇（光譜純）、乙腈（光譜純）、二氯甲烷（光譜純）、碳酸氫銨（分析純），天津科密歐；油酸鈉（98%），安耐吉；HisTrapTMHP、HisTrapTMDesalting預裝柱，德國通用。

（2）儀器。Nano Brook Omini 動態光散射儀（Dynamic Light Scattering，DLS），美國布魯克；AKTA Pure蛋白純化系統，德國通用；Dionex Ultimate 3000 高效液相色譜儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），美國賽默飛；JSM-7500F掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM），日本電子；Tecnai G2 F20S-TWIN 透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM），美國FEI公司；JB-2 雙向磁力加熱攪拌器，江蘇金壇榮華儀器；LYNX 6000 大型離心機，美國賽默飛；Centrifuge5424 R小型離心機，德國艾本德；N-1100 旋轉蒸發儀，東京理化；BT125D電子天平，德國賽多利斯；JY 92-IIND超聲波粉碎機，新芝；FDU-2110 冷凍干燥機，東京理化；NanoDRop 2000C超微量分光光度計，美國賽默飛。

1.2 PTX@PHBHHx納米微球制備及優化

（1）利用乳化溶劑揮發法制備PTX@PHBHHx 納米微球。稱取1 mg PTX和50 mg PHBHHx，置于7 mL二氯甲烷中，超聲30 min 使其溶脹并溶解；將上述混合溶液，緩慢滴加入60 mL 1% PVA 溶液，隨后加入0.5 ml 吐溫-20 采用超聲波粉碎機超聲混勻；用旋轉蒸發儀在42 ℃條件下除去殘余二氯甲烷；將殘留的濃縮液體置于大型離心機12000 r/min 下離心20 min，收集沉淀，用蒸餾水洗滌3 次；將沉淀置于冷凍干燥機中進行干燥，得到PTX@PHBHHx 納米微球。操作過程中，曲拉通X-100（TritonX-100）、吐溫-20 二者中對比選擇乳化效果好的油相乳化劑，對其用量進行調整；由PVA、碳酸氫銨、油酸鈉三者中對比選擇乳化效果好的水相乳化劑，并對其濃度進行調整。以上用以優化微球尺寸及粒度分布。分別用1∶3、1∶5、1∶7、1∶10、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 比例調整PTX 和PHBHHx，進行藥物的包封率及載藥量的優化。

（2）PTX@PHBHHx納米微球的DLS表征。取50 μL組裝完畢的微球于2 mL EP管中，用PBS定容至2 mL后，轉入5 mL 的比色皿中，用DLS 對該樣品粒度及尺寸分布進行檢測。

（3）PTX@ PHBHHx 納米微球包封率、載藥量的測定。為確定PTX@ PHBHHx 納米微球裝載PTX 的能力，用HPLC，建立PTX 濃度標準曲線，來檢測PTX的濃度。色譜條件：流動相采用乙腈和水溶液，在比例為55∶45 的等度條件下洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為270 nm，進樣量為20 μL。精確稱取PTX對照品1.5 mg 于棕色容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至25 mL制得濃度為60 mg/L的儲備液；對母液逐級稀釋分別得到濃度為60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469 mg/L 的系列標準溶液，并于4 ℃保存備用；采用外標法，分別對PTX 各濃度的標準溶液進行檢測，根據檢測結果繪制PTX濃度的標準曲線；并通過下式計算PTX的包封率（Encapsulation Efficiency，EE）和載藥量（Loading Content，LC）［14］：

式中：Wt為PTX的投藥量；C為上清中藥物濃度；V為本批次制劑總體積；Ws為載藥微球總質量。

1.3 PTX@PHBHHx納米微球的功能化修飾

（1）PhaP-RALA 的制備。將實驗室表達PhaPRALA的大腸桿工程菌株E. coli BL21（DE3）/phaprala的凍存液［15］置于冰上使其融化，并將其以1%接種量接種于含1‰氨芐青霉素（50 mg/mL）的培養基中，37 ℃，200 r/min孵育12 h后進行擴大培養并進行低溫誘導，實現PhaP-RALA 在大腸桿菌的表達；將表達PhaP-RALA 的菌液進行收集、洗滌后超聲破碎，然后使用大型低溫離心機12000 r/min 下20 min，收集上清，使用His TrapTMHP 預裝柱（1 mL）進行梯度洗脫、純化；用His TrapTMDesalting 預裝柱進行脫鹽處理，收集脫鹽后的PhaP-RALA，取10 μL加等體積的上樣緩沖液，100 ℃加熱15 min，用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-Poly Acrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）進行純度分析。剩余蛋白儲存于4 ℃備用。

（2）PTX@PHBHHx-PhaP-RALA 的自組裝。取2 mL 純化后的PhaP-RALA 蛋白液與1 mg PTX@PHBHHx納米微球混合后，低溫低速攪拌過夜，結合完畢后使用小型離心機13000 r/min 下15 min，收集沉淀，得到PTX@PHBHHx-Phap-RALA。將沉淀用1 mL磷酸鹽緩沖液重懸，低溫保存。

（3）PTX@PHBHHx-PhaP-RALA 的SEM、TEM 表征。取50 μL樣品沉積在硅片表面上，過夜干燥后，在電壓為15 kV 條件下，用SEM 放大40000 倍進行觀察。取50 μL樣品沉積在銅網上表面上，干燥后，用1%負染液進行負染，并用蒸餾水洗滌，過夜干燥，在電壓為80 kV條件下，用TEM放大40000 進行倍觀察。

2 實驗結果與討論

2.1 乳化劑對PTX@PHBHHx納米微球尺寸的影響

在乳化溶劑揮發法制備微球的過程中，乳化分散劑的種類及用量對液滴的分散穩定性有著重要作用。吐溫-20 與TritonX-100 作為水包油型乳化劑、穩定劑能夠使納米粒子之間產生排斥力，從而阻止粒子之間的團聚。本實驗對比了吐溫-20 與TritonX-100 作為乳化劑的乳化效果，TritonX-100 乳化效果差、顆粒團聚明顯。

（1）不同吐溫-20 用量對納米微球粒度及尺寸分布的影響。當吐溫-20 用量分別為0.5、1、2 mL時獲得的微球尺寸及分布分別為（159.3 ±3.2）、（2880.5 ±1987.6）、（6663.6 ±5170.2）nm，結果表明：隨著吐溫-20 用量的增加，微球的粒徑也隨之增加，用量為0.5 mL 時粒徑最小為150 nm 左右，分散性、均勻性更好。

（2）水相乳化劑影響。水相中的乳化分散劑能起到增加水相的黏度，防止乳滴沉降的作用，其吸附在乳滴的表面，降低乳滴表面張力，防止微球團聚，也會對微球的尺寸及粒度分布產生影響，本實驗分別采用PVA、碳酸氫銨、油酸鈉3 種常見的水相乳化劑來制備微球，所制備微球粒度及尺寸分布分別為（159.3 ±3.2）、（26117.6 ±9409.5）、（436.4 ±25.2）nm，結果表明：當水相乳化劑采用為PVA時，效果最佳，微球粒徑最小，分散度、均勻性最好。

（3）不同濃度的PVA對微球粒徑及分布的影響。PVA質量濃度分別采用1%和0.1%，所制備微球粒度及尺寸分布分別為（159.3 ±3.2）nm 和（1267.01 ±143.6）nm，結果表明：0.1% PVA條件下，活性劑濃度低，導致微球粒徑大于1 μm，而1% PVA條件下微球粒徑維持在160 nm 左右，故此選擇1% PVA 為最佳用量。

2.2 PTX@PHBHHx納米微球包封率及載藥量評價

（1）PTX濃度檢測及標準曲線。使用超微量分光光度計在200 ～800 nm 波長范圍內對PTX 樣品進行紫外掃描，考察藥品的紫外吸收情況，得到PTX 最大吸收波長為270 nm。為確定PTX@ PHBHHx 納米微球對PTX的包封能力和載藥能力，采用HPLC 檢測方法對PTX標準品進行檢測，液相結果如圖1 所示。由圖可知，保留時間T在7.420 min時峰為PTX的峰，峰面積最大，峰形呈高斯對稱；相同色譜條件下，以進樣質量濃度為x軸，PTX的峰面積為y軸，繪制不同濃度的PTX溶液曲線，并對PTX溶液曲線進行線性回歸擬合，獲得PTX溶液標準曲線如圖2 所示。獲得的線性方程為y=0.7298x+0.2974，線性回歸系數R2=0.999 4，表明PTX標準曲線線性關系良好，方法重現性優，精密度高。

圖1 PTX液相色譜圖

圖2 PTX溶液標準曲線

（2）包封率與載藥量的優化。采用外標法對PTX@PHBHHx 納米微球中PTX 組裝前后的濃度進行測試，利用差值法計算裝載材料與藥物添加量在不同比例條件下藥物的EE及LC，對PHBHHx與PTX添加量的配比進行優化，結果見表1 所列。由表可見，隨著二者比例的增加，包封率及載藥量呈現出先增加后降低的趨勢，當PTX與PHBHHx反應比例為1∶50 時，藥物的包封率與載藥量達到最優，PTX 的包封率為81.02%，載藥量為50.9 mg/g。

表1 藥物與裝載材料配比對包封率、載藥量的影響

2.3 PhaP-RALA的純化

實驗室保存的工程菌株E. coli BL21（DE3）/phap-rala經過誘導表達后，得到可溶性目的蛋白。使用蛋白純化系統經親和層析、脫鹽、濃縮進行純化后，經SDS-PAGE分析檢測，結果如圖3 所示：蛋白條帶大小與目的蛋白PhaP-RALA相對分子質量（24 kg/mol）大小相同且條帶單一，可用于后續實驗。

圖3 PhaP-RALA的SDS-PAGE圖

2.4 PTX@PHBHHx-PhaP-RALA 的自組裝與形貌表征

PhaP-RALA 與PTX@ PHBHHx 納米微球低溫經夜結合，通過自組裝獲得PTX@PHBHHx-PhaP-RALA。用SEM和TEM對PTX@PHBHHx-PhaP-RALA的粒徑大小和形貌進行了表征，其結果如圖4 所示。由圖4可知，載藥系統分散度較好，基本呈球形，表面負載蛋白使表面略顯粗糙，粒徑約為150 nm；載藥系統出現中間顏色深，周圍顏色淡的現象，這也進一步證實了疏水性藥物PTX被包裹在高分子材料PHBHHx中。

圖4 PTX@PHBHHx-PhaP-RALA粒徑和形貌照片

3 結語

本文利用乳化-溶劑揮發法將PTX 負載在PHBHHx上，制備出PTX@PHBHHx納米微球；利用轉基因技術獲得PhaP-RALA，并成功修飾在PTX@PHBHHx納米微球表面，構建出生物可降解PTX@PHBHHx-PhaP-RALA。通過DLS 對不同條件下獲得的納米微球尺寸及分布進行了研究，通過HPLC 測量殘余PTX 的濃度并利用差值法計算獲得最優藥物與裝載材料的比例，并通過SEM、TEM 對遞藥系統的大小與形貌進行了表征，結果表明：當采用0.5 mL 的吐溫-20、60 mL（1%）PVA 作為乳化劑制備PTX@PHBHHx納米微球時，微球尺寸達最小為150 nm，均勻性良好；藥物與裝載材料比例為1∶50 時藥物包封率及載藥量最優，分別為81.02%和50.9 mg/g；所構建遞藥系統尺寸在150 nm 左右，顆粒小、分散性好。該遞藥系統的設計對解決PTX 及其載藥體系生物相容性差、藥物利用度低的問題有現實意義。