唾液腺腺樣囊性癌患者的MAPK、MMP-2和MMP-9 及CD147 表達和價值

侯翌杰，何志超，夏苗

1.甘肅醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科，甘肅平?jīng)?744000；2.甘肅醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，甘肅平?jīng)?744000

腺樣囊性癌占所有唾液腺惡性腫瘤的21%～24%，具有侵襲性強、惡性程度高、遠處轉(zhuǎn)移率高等特點，調(diào)查顯示其遠處轉(zhuǎn)移率可達40%，增加死亡風險[1-2]。因此，積極診治唾液腺腺樣囊性癌尤為重要。近年來，外科手術聯(lián)合放療方案已成為治療腺樣囊性癌的理想方法，近遠期效果顯著，存活率高[3-4]。值得注意的是，腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程尤具復雜性，特別是細胞外基質(zhì)及基底膜的降解，參與了腫瘤的繁殖、生長、侵襲及轉(zhuǎn)移過程[5-6]。本研究選取2020 年2 月—2022 年2 月甘肅醫(yī)學院附屬醫(yī)院接診的20 例唾液腺腺樣囊性癌患者為研究對象，探究絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）、基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶-2 （matrix metallo proteinase, MMP-2）、微血管密度（microvessel density, MVD）、細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,CD147）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallo proteinase, MMP-9）特點及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院接診的20 例唾液腺腺樣囊性癌患者，將手術切除的腺樣囊性癌組織設為A 組，包括男12例、女8 例；年齡29～70 歲，平均（43.49±4.25）歲。另外選擇同期健康體檢者20 例為B 組（正常唾液腺組織），包括男14 例、女6 例；年齡31～70 歲，平均（44.15±5.03）歲。兩組基線資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究取得醫(yī)學倫理委員會審核批準，且入組對象知曉研究并主動參與。

1.2 納入與排除標準

納入標準：病例資料完整；結(jié)合臨床表現(xiàn)、病理檢查等確診為唾液腺腺樣囊性癌。

排除標準：心理疾患、占位性病變、重要臟器功能衰竭等；術前接受放療、化療及其他相關抗腫瘤治療；結(jié)合影像學檢查確診腺樣囊性癌遠處轉(zhuǎn)移。

1.3 方法

1.3.1 試劑及儀器 SP 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒、鼠抗人CD147 單克隆抗體、鼠抗人MMP-2單克隆抗體、MMP-9 兔抗人多克隆抗體、蘇木精復染液、磷酸化MAPK（p-JNK、p-P38）等。

1.3.2 免疫組化方法 標本經(jīng)甲醛溶液固定、石蠟包埋等處理后，制成切片（厚度4 μm），再進行防脫片處理。按照SP 免疫組化試劑盒說明書，測定石蠟標本切片內(nèi)MMP-2、MMP-9 的表達。預試驗，確定合適的一抗稀釋濃度，1:200、1:200、1:150、1:100、1:75。經(jīng)枸櫞緩沖液微波加熱處理，抗原修復15 min 后進行 DAB 顯色。再進行蘇木精復染、脫水、封片。

1.3.3 結(jié)果判定 同一組醫(yī)生進行閱片，給出最終結(jié) 論。MMP-2、CD147、MMP-9 蛋 白 在 細 胞 質(zhì) 及（或）間質(zhì)著色，參考相關文獻予以評分，即備好切片，借助400 倍鏡作用，從中采集10 個視野，至少含有200 個細胞，對陽性細胞數(shù)目進行計算、統(tǒng)計。判定標準如下：無陽性細胞：陰性（-）；弱陽性（+）:r＜10%；陽性（++）:10%≤r＜50%；強陽性（+++）：r在50%及以上。陽性細胞率＝[（弱陽性細胞數(shù)+陽性細胞數(shù)+強陽性細胞數(shù)）/計數(shù)細胞總數(shù)]×100%。

MVD 的計算：直徑＞10 個紅細胞的血管不進行計數(shù)。計數(shù)方法：在低倍鏡作用下觀察切片，確定高血管密度區(qū)（熱點），再經(jīng)高倍鏡作用，確定被染成棕黃色的血管數(shù)目，并計數(shù)4 個高倍鏡視野下血管數(shù)目，取平均值。

1.4 觀察指標

比 較A 組 與B 組MMP-2、MMP-9、MVD、CD147、MAPK 及 其c-Jun N-末 端 激 酶（Jun Nterminal kinase，JNK）、馬氏珠母貝絲裂原活化蛋白激酶p38（PmMAPK，p-P38）表達水平，以及A 組中MMP-2、MMP-9 、MVD 、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）的相關性分析。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以(±s)表示，行t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 A 組與B 組MMP-2、MMP-9、MVD 、CD147及MAPK（p-JNK、p-P38）表達水平的比較

A 組MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 表達水平高于B 組，MAPK（p-JNK、p-P38）表達水平低于B 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 A 組與B 組MMP-2、MMP-9、MVD 、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）表達水平的比較(±s)

表1 A 組與B 組MMP-2、MMP-9、MVD 、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）表達水平的比較(±s)

組別A 組（n=20）B 組（n=20）t 值P 值MMP-2（ng/mL）3.09±0.87 1.31±0.49 7.972＜0.001 MMP-9（ng/mL）8.11±1.75 1.45±0.51 16.340＜0.001 MVD 值（%）20.13±4.40 4.75±1.41 14.886＜0.001 CD147 0.59±0.17 0.15±0.07 10.703＜0.001 MAPK p-JNK 0.67±0.05 1.05±0.07 19.755＜0.001 p-P38 0.31±0.03 0.97±0.05 50.620＜0.001

2.2 A 組 中MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）的相關性分析

將p-JNK、p-P38 以陽性強度分組，形成p-JNK陰性/陽性組，p-P38 陰性/陽性組；p-JNK 陽性/陰性組中，MMP-9、MVD 水平情況相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；p-JNK 陽性組中，MMP-2、CD147 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；p-P38 陽性/陰性組中，MMP-2、MMP-9、MVD 水平相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CD147 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。經(jīng)Spearman 系數(shù)顯示，p-JNK 與MMP-2、CD147 存在相關性（P＜0.001），p-P38 與CD147 存在相關性（P＜0.001），見表3。

表2 p-JNK、p-P38 陰性/陽性中MMP-2、MMP-9、MVD 表達情況(±s)

表2 p-JNK、p-P38 陰性/陽性中MMP-2、MMP-9、MVD 表達情況(±s)

指標p-JNK p-P38組別陽性（n=14）陰性（n=6）t 值P 值陽性（n=18）陰性（n=2）t 值P 值MMP-2（ng/mL）8.41±1.11 4.21±0.51 8.775 0.001 7.15±1.03 6.37±0.89 1.023 0.320 MMP-9（ng/mL）136.41±29.33 135.19±27.61 0.087 0.932 134.37±26.21 133.59±24.41 0.040 0.968 MVD 值（%）2.89±0.49 2.77±0.53 0.490 0.630 2.83±0.45 2.71±0.49 0.356 0.726 CD147 0.71±0.25 0.25±0.11 4.281＜0.001 0.63±0.17 0.23±0.09 3.222 0.005

表3 A 組中MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）的相關性分析

3 討論

唾液腺腺樣囊性癌發(fā)生機制復雜，具有生長緩慢、廣泛侵襲、遠處轉(zhuǎn)移風險高、局部復發(fā)高等特點，可危及生命[7-9]。研究指出，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中病灶對細胞外基質(zhì)成分、基底膜的降解占據(jù)了重要的地位，尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶家族對細胞基底膜、細胞外基質(zhì)的降解作用[10]。目前，MMP-9、MMP-2 被認為與腫瘤的侵襲、生長相關，前者是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員之一；后者可使基底膜、包繞腫瘤的基質(zhì)降解，促進腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及血管的生成、毛細血管的增生[11-12]。CD147 作為一種糖蛋白，既能誘導腫瘤周圍間質(zhì)成纖維細胞，刺激MMPs 的大量分泌，又能降解細胞的基質(zhì)、基底膜。MVD 是腫瘤血管新中的敏感性指標。正常成熟血管內(nèi)皮細胞內(nèi)MVD 呈弱表達，而增殖血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的MVD 呈過度表達。MAPK 是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是信號從細胞表面?zhèn)鲗е良毎藘?nèi)部的重要傳遞者。MAPK 信號通路分布在大多細胞內(nèi)，類型較多，如P38、JNK 等[13]。MAPK 在激素、細胞因子等不同細胞外因子刺激作用下可使細胞增殖、分化、遷移[14]。目前，MAPK 通路是研究最多的激酶通路，其中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERIC、p38 激酶參與調(diào)節(jié)細胞功能，尤其是p38 激酶，能夠促進細胞凋亡、抑制細胞增殖。

本研究結(jié)果顯示，A 組MVD、CD147、MMP-2及MMP-9 表達水平較B 組高，MAPK（p-JNK、p-P38）表達水平低于B 組，說明了MMP-2、MMP-9、MVD、CD147 及MAPK（p-JNK、p-P38）變化參與了唾液腺腺樣囊性癌患者的發(fā)生、發(fā)展。細胞株中的細胞外刺激因子可使ERIK 激活，以及調(diào)節(jié)下游目的基因，促進MMP-2、MMP-9 的分泌，二者均是唯一可降解IV 型膠原的基質(zhì)蛋白酶5，也可促進新生血管的生成，以為腫瘤細胞的生長提供條件，使腫瘤侵襲進、轉(zhuǎn)移。因此，認為激活MAPIK 信號通路，以及上調(diào)MMP-2、MMP-9、CD147、MVD 的高表達，可加快患者病情進展。經(jīng)Spearman 系數(shù)顯 示，經(jīng)Spearman 系 數(shù) 顯 示，A 組 與MMP-2、CD147 存在相關性（r=0.584、0.687，P＜0.001），p-P38 與CD147 存在相關性（r=0.650，P＜0.001），與張彬等[15]提出的研究成果相符，p-P38 與MMP-2、MMP-9 表達 呈 正 相 關(r=0.824、0.768），p-JNK 與MMP-2、MMP-9 表達呈正相關（r=0.581、0.604)，充分證實了本研究結(jié)論的真實性、可靠性，也說明了MAPK/ MMPs 通路參與了唾液腺腺樣囊性癌的侵襲、轉(zhuǎn)移復雜過程，為此建議以此為治療靶點，選擇合理的治療方法，確保提高臨床療效，延長患者生存期限。

綜 上 所 述，MMP-2、MMP-9、CD147、MVD 及MAPK（p-JNK、p-P38）在唾液腺腺樣囊性癌患者中呈高表達，與唾液腺腺樣囊性癌呈正相關。