畢赤酵母表達系統及其發酵策略

李成成，黃義德

（福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117）

畢赤酵母（Pichia pastoris）因其生長快、蛋白表達效率高，且易于進行分子遺傳學操作等優良特點，被認為是工業上最重要的外源蛋白生產宿主之一。畢赤酵母表達系統作為一種優秀的真核表達系統，不僅能夠有效的對外源蛋白基因進行轉錄和翻譯，而且擁有蛋白質折疊、糖基化和分泌的必要細胞機制，可以用來生產與天然蛋白在生理、生化功能上非常接近的蛋白。外源蛋白可由醇氧化酶1（alcohol oxidase 1,AOX1）基因啟動子誘導表達，并且其自身蛋白分泌很少，有利于外源蛋白表達后純化，外源基因是和表達載體一起整合到畢赤酵母的染色體上，因此不會隨細胞分裂而丟失，可穩定存在。畢赤酵母的強好氧性以及發酵產物在高密度發酵過程中積累后，不會對自身產生太多的毒副作用，因此非常適合進行大規模的高密度發酵。

1 畢赤酵母表達系統簡介

1.1 畢赤酵母的遺傳學特性

畢赤酵母是可以甲醇為唯一的碳源和能源的甲基營養型酵母，其基因組中含有兩個編碼醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)的基因：AOX1和AOX2。在甲醇存在下，AOX1和AOX2轉錄并最終產生大量的醇氧化酶，但AOX1表達更高，這種表型稱為甲醇利用型（methanol utilizing plus phenotype,Mut+）（野生型）。因此，通過敲除AOX1基因，細胞在甲醇為碳源的環境中，生長速率會急劇減慢。這種表型稱為甲醇利用緩慢型（methanol utilization slow phenotype,MutS)。當兩個基因都敲除時，菌株無法在甲醇上生長，稱為甲醇不利用型（methanol utilizing minus phenotype,Mut-）。

1.2 畢赤酵母表達系統的構成

1.2.1 宿主菌

目前用于外源蛋白表達的畢赤酵母宿主菌有：Mut+甲醇利用型GS115、X-33、SMD1165、SMD1163及SMD1168等大多宿主菌；MutS甲醇利用緩慢型KM71；Mut-甲醇不利用型MC100-3。所有這些菌株，甚至是Mut-菌株，都保留了AOX1啟動子誘導高水平表達的能力[1]。SMD1163 (his4 pep4 prb1)、SMD1165(his4 prb1) 和 SMD1168 (his4 pep4)是蛋白酶缺陷菌株，這些菌株可使外源蛋白更穩定，不易被降解，但這些菌株不如野生型菌株那么有活力，也不易轉化[2,3]，因此只有在采取其他減少蛋白降解的措施無法達到滿意的效果時，才建議使用蛋白酶缺陷菌株。GS115、KM71、MC100-3、SMD1168、SMD1165和SMD1163菌株是組氨酸營養缺陷型，可用來篩選轉化帶有組氨醇脫氫酶基因(histidinol dehydrogenase gene,his4)質粒的陽性菌株。常見畢赤酵母菌株、基因型和表現型如表1所示。

表1 常見畢赤酵母菌株、基因型和表現型

1.2.2 載體

畢赤酵母一般采用整合型穿梭質粒作為外源基因的表達載體。表達載體的遺傳操作在大腸桿菌中進行（如載體保存、擴增和構建等），通過載體線性化電轉酵母感受態細胞后，載體整合進酵母染色體中，表達外源蛋白。根據外源蛋白能否分泌表達將載體分為胞內表達載體（如pPIC3、pPSC3k、pAO815和pPICZA等）和胞外分泌型表達載體（如pPIC9、pPIC9K、pGAPZa、pHIL-S1p和YAM7SP6等）[4]。這些載體均包含三個序列元件：5′區的啟動子序列（最常見的是AOX1）和3′區的轉錄終止序列以及一個包含單個或多個克隆位點的限制酶切序列，這是插入目的基因所必需的，這對于信使RNA的加工和多腺苷酸化至關重要。這些載體還會包含一個耐藥基因，如Kan，Shble，Bsd，Amp或FLD1，它們分別對geneticin，zeocin，blasticidin，ampicillin和甲醛具有抗性[5]。同時，根據宿主菌的營養缺陷型載體還可攜帶如HIS4，MET2，ADE1，ARG4，URA3，URA5，GUT1基因以使轉化后的酵母重新獲得野生型的表型，利用這些基因或藥物耐藥性基因來作為選擇標記，可便于篩選陽性轉化子[3]。此外，根據外源蛋白是否需要誘導表達，還可分為誘導型表達載體（如pPICZ、pPIC6、pPIC9K等）和組成型表達載體（如pGAPZ、pAOS1等）[6]。

2 畢赤酵母高密度發酵策略

畢赤酵母的高密度發酵是在普通發酵的基礎上，通過優化并調控細胞的發酵條件，使細胞在高細胞密度下產生更多的外源蛋白。畢赤酵母的高密度發酵一般分兩個階段進行，首先在碳源為甘油或葡萄糖的培養基中進行的生長階段，積累足夠的細胞密度和生物量，然后再將碳源切換至甲醇進行誘導表達目標蛋白的發酵階段。這種方式可以提高外源蛋白的表達水平，并且使得畢赤酵母在較短時間內積累高濃度的目標蛋白。在影響畢赤酵母高密度發酵的因素中，培養基成分、溫度、pH值、溶氧量、泡沫、甲醇的補料流加方式和培養時間等因素均會在一定程度上影響到外源蛋白的產量。

2.1 培養基成分對發酵影響

在高密度發酵中，培養基的成分會直接影響畢赤酵母細胞的生長以及外源基因的表達，同時也會影響工程菌的遺傳穩定性。因此，畢赤酵母高密度發酵通常會針對不同的研究目的和外源蛋白特性，在選擇或設計培養基時進行優化，以達到最佳的發酵效果。通常在進行畢赤酵母高密度發酵時，由于一些分泌型外源蛋白對蛋白酶的敏感度較高，容易被降解。針對這種情況，通常在畢赤酵母高密度發酵時，會選擇添加含有蛋白胨和酵母粉的培養基，或者添加1%酪蛋白水解物以防止或降低外源蛋白的降解[7]。

在畢赤酵母高密度發酵過程中使用到的一些化學限定培養基包括有：Invitrogen公司提供的BSM培養基、d'Anjou和同事所提出的d'Anjou培養基[8]、由Stratton及其同事所制定的FM22培養基[9]和由Matthews及其同事為畢赤酵母設計了一種營養豐富的RDM培養基[10]。這些培養基經過配制均可在補料分批培養中獲得高的細胞密度，但是這類培養基不適宜進行混合高溫滅菌處理，否則會產生沉淀現象。在高密度發酵過程中，如果加入的微量元素含量過高同樣也會導致沉淀生成，給發酵過程帶來困擾，因此對培養基進行優化在畢赤酵母高密度發酵生產中是非常重要的。

此外，高水平的甲醇（濃度高于5%）對細胞活力毒性很大，可導致代謝中間產物甲醛和過氧化氫的積累，從而使得生產停止[11]，另一方面，低水平的甲醇會觸發外源蛋白的水解降解，導致生產力降低[12]，一些研究文章中所使用過的最佳甲醇濃度有0.5%、1%、2%、2.5%、3%等[5]。山梨醇不會誘導或抑制AOX啟動子，可與甲醇一起作為混合底物使用，混合底物的使用提高了生產率和細胞密度，并減少了誘導時間[13]。此外，山梨醇與甲醇的共同喂養減少了中間代謝物的毒性作用和氧消耗，同時也減少了特定蛋白酶的產生，也消除了乳酸的積累期[14]。一些研究表明甲醇/山梨糖醇共喂會增加重組蛋白的表達[15-18]，根據其他研究的結果2.5%甲醇與1%山梨糖醇[19]、2%甲醇與0.5%山梨糖醇[20]和2%甲醇與1%山梨糖醇[21]被認為對搖瓶培養中外源蛋白的產量達到最高是最佳的。表2為用于畢赤酵母生長發酵的化學限定培養基。

表2 用于畢赤酵母的化學限定培養基

2.2 溫度對發酵的影響

溫度是對畢赤酵母的生長和細胞代謝有著重要影響的因素。一般畢赤酵母所需的生長溫度為28～30 ℃，高于32 ℃可能導致細胞死亡。一些研究表明，畢赤酵母在較低的培養溫度下發酵可以改善靶蛋白產量，降低細胞死亡率，減少死亡后細胞內蛋白酶向培養基中釋放，進而減少外源蛋白的水解[22,23]，而且在較低的培養溫度下，蛋白質折疊應力通常會降低，從而使得畢赤酵母能夠更加有效地分泌外源蛋白[24]。

2.3 pH值對發酵的影響

pH 值在畢赤酵母的發酵過程中，不僅會影響菌體的生長狀態，而且對外源蛋白的表達也會產生重要影響。pH值對畢赤酵母的影響主要包括以下方面：⑴影響細胞內酶的活性，進而影響細胞的新陳代謝，從而使外源蛋白的表達也受到影響；⑵影響細胞膜的通透性，對細胞吸收營養物質和排出代謝產物時產生一定的影響；⑶pH值會對培養基中成分和細胞的代謝產物的離解產生影響，從而對細胞吸收營養物質造成影響；⑷pH值也可能對細胞的代謝過程產生影響，使細胞代謝產物的含量發生改變[7]。另外，在高密度發酵過程中，為了減少外源蛋白被蛋白酶降解，應避開蛋白酶作用的最適pH值，將pH值設定在偏離外源蛋白等電點處，也會提高外源蛋白的收獲率。

2.4 溶氧量對發酵的影響

培養基中溶氧量（DO）對于好氧微生物的生長是非常重要的。畢赤酵母的高密度發酵需要消耗大量的氧氣，尤其是在利用甲醇時，溶氧不足會造成有害代謝產物在細胞中積累，產生有害影響。在高密度發酵中，使用發酵罐進行培養可以顯著提高外源蛋白的表達水平，通常可高出搖瓶發酵的10～100倍，如郭永志等人使用發酵罐生產重組胰島素比在搖瓶中的產量高了5～10倍[25]，這是因為發酵罐相對于搖瓶會有更高的DO，會更有利于細胞生長及外源蛋白的表達。為了盡可能地提高培養基的溶氧量，生產上采用將純氧和空氣按照一定的比例混合這種通氣方式來提高供氧，但是氧濃度太高（超過60%）細胞就會發生氧中毒，一般為保證足夠的供氧DO會保持在20%～30%之間。

2.5 泡沫對發酵的影響

在高密度發酵中泡沫的產生是因為需要強烈的攪拌和曝氣以及培養基中存在表面活性物質而產生，它對發酵生產的影響包括：⑴泡沫的形成會降低培養物表面的氣體交換效率，因為它會在培養物和容器頂部空間的氣體之間會形成屏障；⑵當氣泡破裂時會產生剪切力，損害細胞和（或）任何分泌的蛋白質；⑶泡沫會將細胞和培養基帶到泡沫相中，從而導致生產率降低；⑷泡沫也可能導致生產中無菌性的喪失。消泡可以采取添加消泡劑、機械攪拌或超聲波的形式，最常用的方法是添加化學消泡劑，Routledge等人的研究表明添加消泡劑可以提高畢赤酵母生產的重組蛋白的總產量[26]。

2.6 甲醇的補料流加方式對發酵的影響

甲醇在畢赤酵母的發酵過程中起到兩種作用：一是作為碳源提供能量，二是作為誘導劑，誘導外源蛋白的表達。因此，在發酵過程中甲醇的補加方式、用量和發酵時間都會影響到細胞的生長狀態以及外源蛋白的產量。甲醇供應不足則會限制外源蛋白合成導致其表達量偏低，而如果甲醇過量則可能會對菌體造成毒性影響，進而抑制生長和表達，因此需要根據具體情況選擇適宜的甲醇補加策略、用量和誘導時間，以最大化外源蛋白的表達同時保證菌體的生長和健康狀態。目前，有幾種方法可以用于調節甲醇的添加過程，這包括使用在線和離線甲醇監控儀器來控制流量、通過溶氧水平來控制甲醇的添加以及將甲醇與其他碳源混合后流加等，采用這些方法可以使甲醇的添加更加科學合理，從而提高外源蛋白的表達效率。

2.7 培養時間對發酵的影響

培養時間是在畢赤酵母表達系統中獲得最高蛋白表達水平的最關鍵因素之一，在畢赤酵母表達系統中，生產時間相對較長（約100 h）。培養時間與酵母細胞的數量和目標蛋白的降解程度有關，有研究表明，巴斯德畢赤酵母細胞的最高生長密度是培養96 h，而最高蛋白表達發生在48 h[11]，這表明較長的培養時間很可能會導致所表達蛋白被水解消化，也有其他的研究表明最佳蛋白質表達時間發生在培養72～96 h[20,21]。

3 展望

畢赤酵母表達系統是分子生物學中生產重組蛋白的最常用和標準工具之一，具有諸多優點，適合于工業化大規模的發酵生產，但需要一定程度的工藝優化才能實現目標蛋白的最大產量。在畢赤酵母表達系統中生產重組蛋白的最佳條件因靶蛋白而異，需要針對不同的外源蛋白采用特定的發酵工藝條件進行優化，與此同時，要尋找有效的方法來防止目標蛋白的降解，這些方法包括改進表達系統、優化培養條件、添加蛋白穩定劑、使用特定的蛋白酶抑制劑等多種途徑。目前在影響畢赤酵母分泌效率因素方面的研究成果仍然很少，可以從提高蛋白質分泌性能方面著手來優化外源蛋白的表達。相信隨著新的研究成果的不斷出現，該系統也會越來越完善，其在分子生物學和工業應用等領域也將發揮出更大的作用。