DKK-1 抑制劑對大鼠蛛網膜下腔出血后腦水腫影響的研究

張貴強，許文鋒，楊和平

1.廣西壯族自治區民族醫院神經內科，廣西南寧 530001；2.廣西壯族自治區工人醫院神經內科，廣西南寧 530022

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）屬于全球健康難題，其存在高致死、病死風險，同時具持久性，嚴重威脅患者生命健康和生活質量[1]。SAH 發生后引起嚴重的腦水腫和腦積水[2]。在腦水腫發生過程中，水通道蛋白-l（aquaporin-1, AQP-l）和水通道蛋白-4（aquaporin-4, AQP-4）起著非常關鍵的作用，是中樞神經系統中最關鍵的兩類水通道蛋白[3]。經典Wnt/β-catenin 信號通路具有阻止細胞凋亡、促進細胞再生的功能，在中樞神經系統內環境穩定的維持中發揮著至關重要的作用[4]。DKK-1 是調控Wnt 通路的關鍵負性因子[5]。已有研究表明，應用DKK-1 的拮抗劑或中和抗體誘導Wnt經典通路激活，在缺血性腦卒中發揮了腦保護作用[6]。而關于SAH 后腦水腫影響未見相關報道，為進一步深入研究，本實驗研究于2022 年1—12 月選取72 只由廣西醫科大學動物實驗中心提供的雄性健康SD 大鼠，通過建立大鼠SAH 模型，檢測不同時間點（術后1、2、4 周）大鼠腦組織含水量以及AQP-4、AQP-l 變化，探討DKK-l 對SAH 后慢性腦水腫的影響及其作用機制，為治療提供新的思路及手段。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：72 只雄性、成年的健康SD 大鼠，體質量180～220 g，采購來源于廣西醫科大學動物實驗中心。實驗試劑：AQP-4 抗體和AQP-1 抗體（購自康為世紀公司），Western blotting-抗稀釋液（購自康為世紀公司），Wnt/β-catenin 抑制劑DKK-1（購自上海康朗生物科技有限公司），腦立體定位儀（購自美國Stoelting 公司），5、100 μL 微量注射器 ，電子分析天平（購自上海天平儀器廠）。本研究已獲醫院醫學倫理委員會及動物實驗倫理委員會同意許可。

1.2 方法

1.2.1 SAH 大鼠模型 術前禁食1 d，自來水飼養。經右側腹腔注入10%水合氯醛用量為300 mg/kg（國藥準字H37022673）行麻醉處理，再進行頭頸部、左側腹股溝區的備皮處理。取俯臥位使用立體定位儀固定大鼠。頸部稍屈，常規消毒鋪巾，在顯微鏡下沿頭頸部交界處作一長約3～4 mm 的縱切口，暴露環枕筋膜，對枕大池行垂直穿刺，抽出0.1 mL清亮腦脊液（cerebro-spinal fluid, CSF）后，自原股靜脈置管區域采集0.2 mL 新鮮血，向枕大池低速注入，縫合后頭低位放置30 min。SAH 模型組操作與實驗組完全相同，但兩次注射均以生理鹽水代替自體血。

1.2.2 實驗分組及實驗模型建立 成年健康雄性SD 大鼠72 只，體質量180～220 g，按隨機數表法分為假手術組（n=24）、SAH 模型組（n=24）和 DKK-1抑制劑組（n=24）。SAH 模型組和DKK-1 抑制劑組均采用枕大池二次注血法制作大鼠SAH 模型，DKK-1 抑制劑組于造模前15 min 側腦室注射DKK-1，2 mg/kg,100 μL，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline, PBS）沖洗，而假手術組大鼠也經相同的手術過程，假手術組和SAH 模型組于造模前15 min側腦室注射等量生理鹽水。

1.2.3 腦水腫的測定 利用干濕法測定大鼠腦組織水含量：大鼠于相應時間點處死后，取腦組織，用濾紙輕吸去表面水分，標記后稱濕重，置烘干箱110℃24 h 烘至恒重，再稱干重，用電子分析天平稱量。然后按Eliot 公式計算：腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.4 免疫組化法（Western blot）測定AQP-4 與AQP-1 蛋白的表達 石蠟切片經H∶0∶處理10 min后，用10%正常羊血清封閉30 min，一抗（濃度為1∶600）為兔抗大鼠AQP-4 多克隆抗體，室溫下孵育過夜，SABc 試劑盒(武漢博士德公司)按說明書進行操作，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine, DAB）顯色后光鏡觀察。陰性對照用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline, PBS）代替一抗進行孵育。

1.3 統計方法

所用統計學軟件為SPSS 28.0，計量資料符合正態分布，數值由（±s）呈現，組間均數實施獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組大鼠腦組織含水量比較

假手術組大鼠的腦組織含水量未改變，另兩組腦組織含水量自第1 周均慢慢提高，且在1 周時增至最高。DKK-1 抑制劑組術后1、2、4 周時間點腦組織含水量均低于SAH 模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3 組大鼠腦組織含水量比較[(±s，%]

表1 3 組大鼠腦組織含水量比較[(±s，%]

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與SAH 模型組相比，△P＜0.05。

組別假手術組（n=24）SAH模型組（n=24）DKK-1抑制劑組（n=24）術后4周78.91±7.01（79.02±8.81）*（76.31±11.21）△術后1周77.10±7.19（83.87±11.41）*（80.31±11.24）△術后2周77.11±7.23（81.85±10.02）*（79.02±11.43）△

2.2 3 組大鼠AQP-4 表達水平比較

假手術組AQP-4 未見提高，另兩組AQP-4 表達水平自術后1 周時均慢慢提高；且均于術后4 周增至最大。DKK-1 抑制劑組術后1、2、4 周時間點AQP-4 表達低于SAH 模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3 組大鼠各個時間點AQP-4 表達水平比較[(±s，%]

表2 3 組大鼠各個時間點AQP-4 表達水平比較[(±s，%]

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與SAH 模型組相比，△P＜0.05。

組別假手術組（n=24）SAH 模型組（n=24）DKK-1 抑制劑組（n=24）術后4 周0.50±0.11（1.20±0.23）*（0.98±0.18）△術后1 周0.51±0.11（0.97±0.17）*（0.78±0.14）△術后2 周0.47±0.12（1.08±0.24）*（0.87±0.16）△

2.3 3 組大鼠AQP-1 表達水平比較

假手術組未出現AQP-1 上調，其余各組AQP-1從術后1周時均逐漸增高上調；模型組和DKK-1抑制劑組于術后4 周時AQP-1 表達值達到頂峰。DKK-1抑制劑組術后1、2、4 周時間點AQP-1 表達低于SAH模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 3 組大鼠各個時間點AQP-1 表達水平比較[(±s，%]

表3 3 組大鼠各個時間點AQP-1 表達水平比較[(±s，%]

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與SAH 模型組相比，△P＜0.05。

組別假手術組（n=24）SAH 模型組（n=24）DKK-1 抑制劑組（n=24）術后4 周0.49±0.12（1.21±0.26）*（0.97±0.19）△術后1 周0.61±0.21（0.98±0.16）*（0.79±0.15）△術后2 周0.50±0.22（1.09±0.21）*（0.89±0.17）△

3 討論

SAH 是最常見的出血性腦血管病之一，而腦水腫是SAH 后主要的神經損傷，是一種腦細胞間質空間水量病態增加的現象[7]。腦水腫的發生是十分復雜的病理過程，目前尚不清楚其分子水平的發病機制。AQPs 是一類表達于各種細胞的疏水性蛋白水通道家族，其參與調節體內水穩態和腦水腫的形成，是緩解腦卒中所致腦水腫的有效靶點[8]。在中樞神經系統中存在5 種水通道蛋白，分別是AQP-l、AQP-4、AQP-7、AQP-9 和AQP-Ⅱ，其中AQP-l、AQP-4 含量最高[9]，分別分布于脈絡叢上皮靠近腦脊液一側的頂部和毛細血管周圍星形膠質細胞足突的質膜、膠質界膜和室管膜[10]。DKK 為動物進化期間一類極具保守性的分泌性糖蛋白，此蛋白的功能以抑制信號途徑Wnt 傳導為主，內含4 個成員[11]。DKK-1 是Wnt 信號通路中重要的拮抗分子之一，DKK-1 可以抑制Wnt 蛋白與LRP5/6 等受體的結合，從而抑制Wnt 信號通路[12]。同時也是Wnt 通路的下游靶基因，從而形成了一個負反饋調節環，在維持成體組織的動態平衡中起到了重要作用[13]。

本研究結果顯示，假手術組術后1、2、4 周未出現 腦 組 織 含 水 量 變 化（77.10±7.19）% 、（77.11±7.23）%、（78.91±7.01）%，大鼠腦組織含水量從術后第1 周起均逐漸增多，并在術后1 周時腦組織含水量達到頂峰，而在此時間段內，以DKK-1 抑制劑組為例，在腦含水量增大的同時，術后1、2、4 周AQP-4 表 達 水 平（0.78±0.14）%、（0.87±0.16）%、（0.98±0.18）%與 術 后1、2、4 周AQP-1 表 達水 平（0.79±0.15）%、（0.89±0.17）%、（0.97±0.19）%不斷上調，這兩者的表達水平與腦含水量呈正向相關，也與Hao JQ 等[14]的研究認為上調的AQP-4（0.88±0.15）%、（0.86±0.17）% 、（0.99±0.17）% 及 AQP-1（0.80±0.14）%、（0.91±0.18）%、（0.98±0.18）%參與了腦水腫的形成的研究結果相一致，即腦水腫發生與AQP-4 及AQP-1 密切相關。在本研究中，在各時間節點的腦組織含水量方面，相較模型組，DKK-1 抑制劑組均偏低（P＜0.05）；另外，在各節點AQP-1 與AQP-4 表達量上，相較模型組，DKK-1 抑制劑組均偏低，從而能夠發現，DKK-1 抑制劑能夠減少SAH后大鼠腦組織含水量，能夠使AQP-1、AQP-4 表達下調，減輕SAH 后大鼠神經功能損害。SAH 后，腦組織含水量增多，AQP-4 及AQP-1 表達增多；AQP-4 及AQP-1 表達值與腦含水量關系密切，原因在于腦組織的AQP-4 及AQP-1 主要分布于血腦屏障，當SAH 發生后，血腦屏障受損，內環境發生紊亂，血腫AQP-4 及AQP-1 大量聚集，周圍產生炎性水液，水通道異常，引起腦水腫，是SAH 后的重要病理基礎[15-16]。本研究結果提示DKK-1 抑制劑能夠降低SAH 后大鼠腦組織含水量，能夠使AQP-1、AQP-4表達下調，一方面揭示了SAH 后腦水腫形成相關的分子機制，同時為DKK-1 抑制劑治療SAH 給予實驗上的指導。

綜上所述，DKK-1 抑制劑可以減少SAH 后大鼠腦組織含水量，可抑制AQP-4及AQP-1表達，從而減輕SAH 后大鼠神經功能損害。