結核分枝桿菌分子生物檢測與常規痰涂片檢驗結核菌的臨床比較

葛冰磊，陳永紅，徐成春，趙成娟

宣城市人民醫院檢驗科，安徽宣城 242000

當前，結核病仍然是全球范圍內的重要公共衛生問題。結核分枝桿菌是導致結核病的主要病原體，其傳播和感染對于早期診斷和有效治療至關重要。傳統的痰涂片檢驗是結核病的常規診斷方法之一，但其存在一些局限性，如低靈敏度和特異性以及需大量時間來培養和鑒定細菌[1-2]。近年來，隨著分子生物學技術的發展，結核分枝桿菌的分子生物檢測方法逐漸成為結核病診斷和監測的重要工具。這些分子生物學方法基于對結核分枝桿菌DNA 的擴增和檢測，能夠提供更快速、準確和敏感的診斷結果。與傳統的痰涂片檢驗相比，分子生物檢測方法可以在更短的時間內完成診斷，并且對于低菌量樣本的檢測具有較高的靈敏度[3-4]。為進一步探討比較結核分枝桿菌分子生物檢測與常規痰涂片檢驗結核菌的價值，本文回顧分析2020 年1 月—2022 年12 月期間宣城市人民醫院收治的248 例疑似結核患者的臨床資料，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析本院收治的248 例疑似結核患者的臨床資料，所有患者均進行結核分枝桿菌分子生物檢測與常規痰涂片檢驗，其中，男199 例，女49 例，年齡16～87 歲，平均（61.05±16.20）歲。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①疑似結核的患者；②伴有疑似結核病癥狀；③未服用相關藥物；④可正常交流，無意識障礙。

排除標準：①嚴重肺部疾病者；②重要臟器功能障礙者；③精神疾病者；④中途退出者。

1.3 方法

所有患者均進行結核分枝桿菌分子生物檢測和常規痰涂片檢驗，以羅氏固體培養基培養結果作為金標準，

1.3.1 常規痰涂片 在患者入院的當天，使用廣口痰杯收集患者的痰液標本3 mL，然后嚴格根據操作規定進行檢測。①先使用接種環挑取適當的痰液標本，然后制作成一個厚膜涂片，規格在15×20 mm，待其自然干燥后，使用火焰對其進行固定。②選擇染色材料，以石碳酸復紅染液進行染色，并使用3%鹽酸溶液對其進行脫色處理。③使用呂氏美藍液對其再次進行染色，時間約為30 s，涂片復染時間2 min。④確定樣本無誤可用后使用抗酸染色鏡檢結果，并對其進行分級觀察，判定其結果陰陽性。

1.3.2 結核分枝桿菌分子生物檢測 以聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）結核分枝桿菌DNA 檢測，取適當痰液標本，將其加入適當等體積的液化液，充分震蕩混合后，于37℃環境下將其液化半小時。①清洗階段。先抽取1 mL 的液化后樣本，置入潔凈的離心管內，對其進行離心處理，時間5 min，轉速12 000 r/min，離心半徑10 cm，清除上層清液，加入1 mL 的生理鹽水，再次渦旋震蕩并進行再次離心處理，轉速，半徑及時間同上，然后再次清除上層清液。②提取階段。此階段中將60 μl 的和旋提取液加入離心管內，充分渦旋震蕩混合，將其轉入核酸提取的試管中，使用核酸快速提取設備，充分進行震蕩5 min，采用恒溫為95℃的水，對其核酸提取管進行5 min 水浴，取出后并第三次進行離心處理60 s，獲得核酸，抽取2 μl 樣本對其擴增實驗，并詳細記錄結果。放置在熒光定量PCR 儀上運行程度，PCR 擴增參數：反應罐在93℃下保溫2 min，先93℃ 45s→55℃ 1 min 循環10 次，再次按93℃ 30 s→55℃ 45 s 循環30 次，而熒光檢測需在第二次循環55℃ 45 s 時完成。最后根據說明書對其結果進行判斷。

1.3.3 結核分枝桿菌培養 ①取患者的痰液樣本，1 mL，并使用氫氧化鈉（40 g/L）對其進行處理；②將其接種到酸性羅氏培養基中，于37℃下孵育，每間隔一周時間對其進行觀察1 次，查看菌株生長的情況，共持續觀察4 周，期間如果出現結核分枝桿菌生長即可判定為陽性，相反即判定為陰性。

1.4 觀察指標

以羅氏固體培養基培養結果作為金標準，對比分析兩種檢查方式的陽性檢出率，計算其診斷效能，包括靈敏度，特異性及準確率，其中，靈敏度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%，特異性=真陰性例數/（真陰性例數+假陽性例數）×100%；準確率=（真陽性例數+真陰性例數）/總例數×100%。

1.5 統計方法

采用SPSS 28.0 統計學軟件分析數據。符合正態分布的計量資料用(±s表示，采用t檢驗；計數資料用例數（n）和率（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

結核分枝桿菌分子生物檢測的陽性檢出率（35.89%）高于常規痰涂片（33.06%）；結核分枝桿菌分子生物檢測的靈敏度94.19%、特異度95.06%高于常規痰涂片，但差異無統計學意義（P＞0.05），而兩種檢測方法的準確率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1、表2。

表1 兩種檢測方式陽性檢出率、檢測的診斷結果（n）

表2 兩種檢測方式靈敏度、特異性及準確率比較（%）

3 討論

結核病是一種由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，主要影響年輕人群。一旦感染，結核菌會進入人體并潛伏一段時間，通常為4～8 周，稱為潛伏期。在潛伏期內，感染者通常沒有任何癥狀，但仍然具有傳染性[5-7]。結核菌主要侵犯肺部，占據了所有結核病患者中的80%～90%[8-9]。肺結核是最常見的類型，其病原菌通過空氣中的飛沫傳播，例如咳嗽或打噴嚏時，結核菌會釋放到空氣中，并被他人吸入感染。感染后，結核菌會侵入肺部組織并引發炎癥反應。盡管肺部是結核病最常見的部位，但結核分枝桿菌也可以侵犯其他器官和組織，如淋巴結、腎臟、骨骼、腦膜等。這些病例雖然相對較少，但對患者的健康狀況和治療有著重要的影響[10]。根據世界衛生組織的《2022 年全球結核病報告》，2021 年全球新增1 060 萬結核病患者。而我國的新發結核病患者占全球的8.9%，在30 個結核病高負擔國家中，其發病率排名第28 位。說明我國在結核病的流行和控制方面面臨著重要挑戰[11-12]。我國是世界上結核病負擔最重的國家之一，結核病耐藥形式也非常嚴峻。耐藥結核病是指對常規抗結核藥物產生耐藥性的結核病形式，包括多藥耐藥結核病（對兩種最常用的抗結核藥物耐藥）和極耐藥結核?。▽Ω喾N抗結核藥物耐藥）。這種形式的結核病對治療和控制提出了巨大挑戰，需要更加精準和個體化的治療方案。在這種情況下，早期的結核病診斷顯得尤為重要。早期診斷能夠迅速確定結核病患者，并及時開始治療，從而減少病情的惡化和傳播[13-14]。通過采用先進的診斷技術，如分子生物學檢測方法，可以更準確地檢測結核菌感染，加速診斷過程，幫助醫療機構和專業人員更好地應對結核病的挑戰。

目前，對于結核病的診斷包括實驗室檢查、影像學檢查和臨床表現三大類。在實驗室檢查方面，主要方法包括細菌學檢查、分子生物學檢查、病理學檢查和免疫學檢查等。其中，細菌學檢查是結核病常用的實驗室診斷方法之一，主要包括分枝桿菌涂片檢查和分枝桿菌分離培養。分枝桿菌涂片檢查通過觀察痰液或其他臨床標本中的分枝桿菌形態特征來進行初步診斷。分枝桿菌分離培養則是通過將臨床標本接種到特定培養基上，培養并鑒定分枝桿菌的生長，是結核病診斷的“金標準”[15-16]。然而，由于分枝桿菌的生長速度較慢，這種方法需要較長的時間來獲得結果，不符合臨床迅速診斷的需求。為了滿足快速準確診斷的需求，分子生物學診斷技術應運而生。分子生物學檢查方法利用了對結核分枝桿菌DNA 的擴增和檢測，例如PCR 能夠快速、準確地檢測結核菌的存在。這種方法的優勢在于其高靈敏度和特異性，尤其對于低菌量樣本的檢測更為敏感。通過分子生物學檢查，可以在較短的時間內獲得結核病的診斷結果，有助于早期治療和控制疾病傳播[17]。

作為一種核酸擴增技術，PCR 利用DNA 聚合酶和核苷酸底物的作用，以一段特定的DNA 序列為模板，在適當的溫度條件下，通過循環擴增過程將目標DNA 擴增至足夠數量。這種擴增后的DNA 可以用于結構和功能分析，例如測序、鑒定、定量和突變檢測等。PCR 的快速和高特異性使其在臨床診斷中具有重要意義，尤其是在細菌性傳染病的快速診斷方面。PCR 可以通過特定引物和探針的設計，針對病原微生物的特定基因或序列進行擴增和檢測。由于其高度特異性，可以快速、準確地鑒定目標微生物的存在，有助于快速確診并采取相應的治療措施[18]。此外，PCR 技術還具有靈敏度較高的優勢。其能夠在非常低的目標DNA 濃度下進行擴增和檢測，因此即使是微生物數量很少的樣本，也能夠有效檢測到。這對于早期感染或低菌量感染的診斷非常重要，可以提高疾病的檢出率和準確性。雖然PCR 在結核分枝桿菌DNA 檢測中具有許多優勢，但在應用過程中也需要注意其局限性和潛在的誤診風險。

而常規痰涂片是一種直接的顯微鏡檢查方法，用于觀察痰液樣本中是否存在結核分枝桿菌的酸酒精染色陰性桿菌形態。該方法相對簡單，操作方便，是結核病最常用的初篩檢查方法之一。其優點在于操作簡單、費用低廉，并且可以提供快速的初步篩查結果。然而，其也存在一些局限性。①常規痰涂片的敏感性相對較低，對于低菌量的樣本或非典型結核菌株可能出現假陰性結果。②該方法無法區分結核菌的活動性和非活動性，無法提供關于感染程度和病情嚴重程度的定量信息。因此，對于懷疑結核病的患者，通常需要結合其他的實驗室檢查方法，如分子生物學檢測（如PCR）和分枝桿菌培養等，以提高診斷的準確性和敏感性。常規痰涂片作為一種快速初篩方法仍然具有重要的臨床意義，特別是在資源有限的環境下，可以用來快速篩查結核病病例，進行進一步的檢測和診斷。

本文結果顯示，結核分枝桿菌分子生物檢測的陽性檢出率高于常規痰涂片，結核分枝桿菌分子生物檢測的靈敏度94.19%、特異度95.06%高于常規痰涂片，但差異無統計學意義（P＞0.05），這與劉原園等[19]的研究中，分子生物檢測組陽性檢出率高于常規痰涂片，靈敏度93.78%、特異度96.35%高于常規痰涂片的結果一致，由此可知，PCR 在檢測結核病方面具有更高的準確性和敏感性，能夠更可靠地檢測到結核分枝桿菌的存在。PCR 的特異度略低于痰涂片，意味著在某些情況下可能會出現PCR 的假陽性結果。這可能是由于PCR 方法對結核分枝桿菌的高敏感性，使其在一些非活動性或低菌量感染的情況下也能夠檢測到[20]。

綜上所述，結核分枝桿菌分子生物檢測結核菌其檢出率高，且進一步提高其診斷效能，一致性良好，可為疑似結核的患者提供明確診斷，對后續疾病治療及控制提供重要參考。